ENZYME LINKED INMUNO SORBENT ASSAY (E.L.I.S.

A)

Simanca, Dayana1; Fadul, Xiomara1; Portillo, Cristina1

1
Estudiante de cuarto semestre de medicina de la facultad de ciencias
de la salud de la universidad de sucre.

METODOLOGÍA
En primera instancia, la práctica de laboratorio se dividió en dos
sesiones la cual se describirán a continuación. En la primera parte del
laboratorio se procedió a adicionar 12 pozo en placas de polietileno de
96, en donde del pozo 2A hasta el 12H se adicionaron 50 µL de buffer
de carbonato. Luego se agregaron 100 µL de un suero problema que
se encontraba a una dilución de 1/200 en el pozo 1A – 1H (toda la
primera columna). Posteriormente se realizaron diluciones dobles a
partir de la fila B y se incubo durante una hora a una temperatura de
37°C. Luego de cierto tiempo se desechó el sobrenadante y la placa de
polietileno fue lavada 3 veces con PBS –T (Buffer fosfato salino 1X-
Tween 20 al 0.1%). Después se añadió 100 µL de solución bloqueadora
(BSA 0.5%) en cada uno de los pozos y se incubo por 1 hora a 37 °C,
seguidamente se lavó 3 veces la placa y se guardó a 4°C hasta su uso
(segunda parte de la práctica), y para evitar la deshidratación se agregó
50 µL de PBS-UX.
Por otro lado, en la segunda parte de la práctica de laboratorio se
comenzó adicionando 50 µL del conjugado anti ig-G a cada uno de los
pozos a una dilución 1/5000, en donde se pasó a incubar por 1 hora a
temperatura ambiente, luego se desestimó el sobrenadante y se lavó 4
veces la placa con PBS-T. Posteriormente se le agrego a cada pozo 50
µL de sustrato OPD y se incubo en oscuridad a temperatura ambiente
durante 10 minutos. Por último se leyó en el lector de Elisa a 410 nm y
promediaron las absorbancias de cada dilución con el fin de determinar
el título de anticuerpos en el suero problema.
RESULTADOS
De acuerdo con la experiencia de laboratorio se obtuvieron los siguientes resultados de
cada una de las mediciones:
# De datos. Conjugado de
humano.
1 0.2315
2 0.2175
3 0.2105
4 0.211
5 0.2255
6 0.218
7 0.218
8 0.23
9 0.2465
10 0.222
11 0.2225
12 0.229

Desv. Estandar 0.00997497

Figura 1. Tabla de resultado del conjugado de humanos con su respectiva desviación
estándar calculada.

Figura 2. Grafica obtenida de los resultados del conjugado de humanos.

# De datos. Conjugado de
perro.
1 0.3005
2 0.2785
3 0.262
4 0.25
5 0.2535
6 0.2615
7 0.266
 8 0.245
9 0.279
10 0.2815
11 0.257
12 0.2515

Desv. Estandar 0.0163304

Figura 3. Tabla de resultado del conjugado de perro con su respectiva desviación estándar
calculada.

Figura 4. Grafica obtenida de los resultados del conjugado de perro.

# De datos. Conjugado de
cerdo.
1 0.2025
2 0.203
3 0.2085
4 0.211
5 0.217
6 0.217
7 0.214
8 0.275
9 0.209
10 0.212
11 0.204
12 0.2015

Desv. Estandar 0.01980181

Figura 5. Tabla de resultado del conjugado de cerdo con su respectiva desviación estándar
calculada.

Figura 6. Grafica obtenida de los resultados del conjugado de cerdo.

# De datos. Conjugado de
pollo.
1 0.274
2 0.265
3 0.251
4 0.2565
5 0.266
6 0.2635
7 0.2565
8 0.2525
9 0.261
10 0.2645
11 0.2635
12 0.2605

Desv. Estandar 0.0063763

Figura 7. Tabla de resultado del conjugado de pollo con su respectiva desviación estándar
calculada.
Figura 8. Grafica obtenida de los resultados del conjugado de pollo.
De acuerdo a las orientaciones impartidas por la docente se logró establecer que el suero
usado fue de pollo, y relacionándolo con los resultados de experiencia de laboratorio se
puede identificar que nuestro suero problema el de pollo ya que este obtuvo una desviación
estándar (0.0063763) menor a la de las otras muestras.

ANALISIS
El ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) es una técnica de
laboratorio que identifica pequeñas partículas –antígenos–, y gérmenes
que causan enfermedades, Para poder identificar esos antígenos se
utilizan moléculas con dos componentes acoplados: un anticuerpo (que
se une al antígeno de forma específica) y una enzima (que se activa y
señala la unión al antígeno). (1) Está es una prueba altamente sensible
para detectar antígenos y anticuerpos.
Estás prueba se expresa en valores cualitativos, es decir, o es positivo o
es negativo. Sólo el ELISPOT puede aportar resultados cuantitativos.
Cuando el ELISA es positivo quiere decir que se han detectado
antígenos en la muestra recogida, y por tanto hay gérmenes presentes.
Cuando es negativa, no se han podido detectar antígenos y se
considera que la muestra no está contaminada.
Se han diseñado diversos tipos de ELISA básico, cada tipo de este
puede usarse para detectar de manera cualitativa anticuerpos o
antígenos.

Los tipos de ELISA son los siguientes:

 ELISA directo: es la forma más básica de realizar la técnica.

Consiste en recoger una muestra a estudiar y ponerla en un pocillo
en frente de una muestra igual pero contaminada con el germen
a estudiar, y otra muestra en la que se sabe que no hay germen.
Se aplica el anticuerpo con la enzima en los tres pozos y se
compara la muestra a estudio con las otras dos. ( Se usa para la
detección de antígenos)

 ELISA indirecto: se realiza de forma similar al ELISA directo, pero

en este caso se añade primero un anticuerpo sin enzima y
después uno con enzima. De esa forma, la señal que emite el
enzima es mucho más potente y la prueba es más sensible. ( Se
usa para la detección de anticuerpos)

 ELISA sándwich: en este caso en los pocillos primero se añade

un anticuerpo y después la muestra, para que los antígenos
queden ya retenidos en el fondo del pozo. Después se añade el
anticuerpo con la enzima. Es la forma más eficaz de realizar la
prueba.

 ELISPOT: se trata de un tipo de ELISA que permite conocer de

forma cuantitativa el antígeno, incluso identifica el número
concreto de células donde se encuentra (1)

Básicamente este prueba consiste en hacer que un suero

problema al cual se le han agregado un conjugado de anticuerpos
dirigidos contra un anticuerpo humano o antígeno, relacionen al
entrar en contacto con una enzima. (2)

Para la realización de la prueba hay que seguir los siguientes

fases.

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :

1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima
(peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado a la
enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich.
antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de
antígeno.

2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de

anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de
plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el

caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un
anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un
anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario
marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la
amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos
secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo
unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno
marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frío frente
a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de
competición del antígeno.

4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para

eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de
inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se
deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante
espectrofotometría. (3)

En la práctica realizada la prueba fue positivo para suero de pollo,

se llega a esta conclusión porque en los pozos donde estos
estaban fue donde la enzima pudo reaccionar y cambiar de color
dando un resultado positivo, además a realizar la desviación
pudimos observar que en los pozos donde había suero de pollo
se obtuvieron los menores longitudes de onda.

Está prueba es utilizada en distintos ámbitos como los son; el

diagnóstico médico (en estudios serología, hematológicos,
endocrinológicos, oncológicos, y trasplantes) , la industria de
alimentos y el estudio y control del medio ambiente.
Con propósitos médicos está prueba se ha aplicado en la
determinación de hormonas y proteínas plasmáticas, antígenos
tumorales, drogas, AG y Ac de microorganismos como parásitos
hongos, bacterias y virus. Los resultados obtenidos aportan
elementos diagnósticos, e informan de un enfermedad.( 2)

Conclusión
Se puede concluir que la prueba ELISA posee gran importancia
puesto:
 La prueba se utiliza en el diagnóstico médico, la industria de
alimentos y en el estudio y control del medio ambiente.
 En estudios serológicos, hematológicos, endocrinológicos,
oncológicos, en los transplantes, la medicina forense y la
antropología.
 Con propósitos médicos se ha aplicado en la determinación
de hormonas y proteínas plasmáticas, antígenos tumorales,
drogas, Ag y Ac de microorganismos (parásitos, hongos,
bacterias, virus)
 Los resultados aportan elementos diagnósticos, información
de una enfermedad y coadyuvan en la planificación del
tratamiento.

Bibliografía

1. https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/elisa-13695

2. http://www.higiene.edu.uy/parasito/trabajos/elisa.pdf

3.https://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?
it=10049