Autor invitado: Dr.

Ramkumar Dhandapani
El término cromatografía procede de la palabra griega chroma- que significa color y -graphein
que significa escribir. El primer uso registrado de la cromatografía en columna se le otorga al
científico ruso Mikhail Tsvet que trituró carbonato de calcio en un tubo y posteriormente
agregó hojas de una planta verde homogeneizadas, seguido de un solvente orgánico. Tsvet
observó bandas de colores separadas a medida que el solvente pasaba a través del tubo. Así es
como la cromatografía práctica comenzó al principio, separando con éxito varios pigmentos de
las hojas. En el mundo de hoy, hay muchos analitos que son incoloros y están separados por
técnicas cromatográficas, todavía se le conoce con el mismo nombre.

Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC)

Es un tipo de cromatografía en columna en el que por acción de una bomba, se hace pasar una
mezcla de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente conocido como fase
móvil. La fase móvil pasa a través de una columna cromatográfica, que contiene la fase
estacionaria a un flujo especificado. La separación de los compuestos ocurre en base a la
interacción de éstos con la fase móvil y la fase estacionaria.

Cromatografía líquida de Ultra-Alta eficacia (UHPLC)

Es una tecnología basada en el principio de que un tamaño de partícula menor conlleva una
mayor eficiencia, rápidas separaciones con mayor resolución y sensibilidad. Sin embargo, para
resistir la presión extrema de las partículas más pequeñas de 2 µm, el equipo necesita ser capaz
de trabajar a alta contrapresión. La eficiencia de estas columnas no debe perderse en el resto del
equipo, debido al volumen muerto, por ello se diseñaron equipos capaces de trabajar a altas
presiones.

Debido a que los instrumentos de UHPLC tienen un coste elevado, a finales del 2000,
Phenomenex lanzó las columnas Kinetex 2,6 μm con tecnología Core-Shell, que proporciona
un rendimiento UHPLC en un equipo HPLC tradicional. De esta forma se puede utilizar el
instrumento de HPLC tradicional que se posee en el laboratorio y lograr un rendimiento
equivalente de UHPLC.

Modos de separación.

Hay muchos modos de separación en cromatografía y cada uno tiene sus propios principios.

A continuación presentamos una guía de selección de columnas de HPLC para ayudar a los
lectores a elegir el modo de análisis correcto. Aunque hay muchos modos de separación
disponibles para resolver las mezclas en un cromatógrafo la separación mediante Fase Reversa
(RP) es el modo más común en cromatografía líquida.

“¿Por qué la fase reversa se llama fase reversa?”

La respuesta es simple:

La cromatografía evolucionó a partir del uso de la fase estacionaria polar y de un eluyente no

polar como componente principal de la fase móvil, por ello se consideró la práctica normal, de
ahí el nombre de fase normal. Si bien este modelo separó componentes basados en su
naturaleza polar, hubo una gran cantidad de mezclas de analitos que no eran polares y tenían
características hidrofóbicas que necesitaban separación.

El uso de una fase estacionaria no polar, con una fase móvil polar ayudó a separar estos analitos
hidrofóbicos. Dado que esta práctica es inversa a la fase normal, se utiliza el término fase
reversa. Esto es similar a llamar a un jugador de ping-pong derecho como normal y un jugador
de ping-pong zurdo como el original.
Proceso de separación en Fase Reversa

Ahora que sabemos que el modo más popular de cromatografía líquida es la fase reversa,
vamos a explorar cómo funciona.

A continuación se muestra un esquema del proceso de separación. La mezcla de analitos se

representa por puntos azules, morados y rojos, que se introducen de manera conjunta en la
columna que contiene una fase estacionaria de fase reversa no polar. Las flechas rojas
representan la dirección del flujo de la fase móvil. Cuando la mezcla de analitos mixtos entran
en la columna, la fase móvil empuja los analitos por la columna. A medida que avanzan entran
en contacto con la fase estacionaria. Los analitos que tengan una mayor afinidad por la fase
estacionaria (puntos azules) serán retenidos más fuertemente y eluirán más tarde en la carrera.
Por lo tanto, puede separar los analitos basándose en la intensidad con la que interactúan con la
fase estacionaria.

En el siguiente ejemplo se representa una fase estacionaria, hidrofóbica no polar, más

concretamente una C18. La fase móvil consiste en un componente acuoso polar, hidrófilo,
usualmente agua y acetonitrilo o metanol. Los analitos se separarán basándose en su afinidad
relativa por estas dos fases. Los compuestos hidrófobos, tales como el benzopireno, tendrán una
fuerte afinidad por la fase estacionaria hidrófoba, y estarán fuertemente unidos. Los
compuestos hidrófilos tales como sulfato de etilo tendrán poca afinidad por la fase estacionaria
y permanecerán principalmente en la fase móvil y se transportarán rápidamente a través de la
columna.
Aunque la separación en fase reversa se produce por la interacción hidrofóbica, existen tres
mecanismos primarios de interacción que dictan el comportamiento cromatográfico global.

Esto incluye:

1. Interacciones hidrofóbicas
2. Interacciones polares
3. Interacciones iónicas

A parte de esas tres interacciones, la selectividad estérica y la forma de la molécula en

ocasiones también pueden contribuir a la interacción. Usando el ejemplo del tapentadol, una
molécula farmacéutica típica de pequeño tamaño, podemos mostrar mejor estos tres tipos de
interacción, ya que posee componentes polares, hidrofóbicos y también iónicos.

Interacciones Hidrofóbicas

Es el mecanismo primario en RP-HPLC y que determina el comportamiento de retención. Es

decir la interacción hidrófoba entre el ligando de fase estacionaria no polar (por ejemplo C18) y
la naturaleza hidrófoba de la molécula de muestra (por ejemplo, el esqueleto de carbono).

Ésta es una interacción débil y transitoria entre una fase estacionaria no polar y las moléculas,
que incluye interacciones hidrofóbicas y de van Der Waals. Se puede predecir una estimación
razonable de la retención basada en el valor Log P, o coeficiente de coeficiente de reparto
octanol-agua. El Log P es la Relación entre octanol y agua en una extracción líquido-líquido.
En otras palabras, cuanto más hidrofóbica es una molécula, mayor es el valor de Log P que
tiene, lo que se traduce en mayor retención en RP-HPLC.
Interacciones Polares

Estas son interacciones que ocurren entre los grupos funcionales polares de los analitos.
También se producen entre silanoles residuales, grupos polares incrustados, grupos polares
superficiales o grupos terminales polares en la fase estacionaria. Interactúan con el analito a
través de enlaces de hidrógeno y dipolo-dipolo. Estas interacciones son relativamente débiles y
transitorias en comparación con la interacción de intercambio iónico.
Interacciones de Intercambio Iónico

La mayoría de las fases estacionarias en RP se basa en un soporte de sílice a la que se le ancla

una fase no polar tal como C18. Los fabricantes de columnas cromatográficas como
Phenomenex, tratan de lograr la inactivación completa de todos los grupos silanol de la sílice,
sin embargo este proceso no puede eliminar el 100% de los grupos, dando lugar a grupos
silanol residuales en superficie (Si-OH) que están ocultos. Estos silanoles pueden desprotonarse
y adquirir una carga negativa, e interaccionar iónicamente con moléculas básicas de analito
cargadas positivamente. Estas interacciones de intercambio iónico son muy fuertes y lentas, en
contraste con las interacciones hidrofóbicas y polares. Por lo tanto, cuando ocurre intercambio
de iones, los analitos experimentan diferentes tasas de interacción (lento vs rápido), y esto
puede conducir a la distorsión de pico. Este es un ejemplo clásico de analitos básicos que
interactúan con silanoles residuales, que pueden ser controlados neutralizando el silanol o
neutralizando el analito analizándolos a pH alto.
Para más información sobre HPLC/UHPLC y las diferentes columnas que pueden utilizarse,
por favor visite nuestra web.

¿Qué tipo de HPLC es el que debo utilizar?

De acuerdo al tipo de objetivo cromatográfico, existen diferentes escalas de equipos de HPLC, cuyo
funcionamiento es igual, pero ofrecen resultados diferentes según la cantidad de analito que se
desee procesar.

Escala analítica, que define la información del compuesto (identificación y concentración)

Escala semi – preparativa, brinda información del compuesto y permite purificar pequeñas
cantidades (inferior a 0.5g).
Escala preparativa, brinda información del compuesto y permite purificar cantidades mayores
(superior a 0.5g).

Escala de proceso (industrial), maneja cantidades de manufactura (producción), de gramos hasta

kilogramos de analito separado.

Para trabajar a estos niveles es necesario modificar algunas características del equipo de HPLC,
entre ellas los volúmenes de solvente utilizado y tipo de material de empaque (selectividad del
sistema). Pero, para soportar las cantidades específicas de cada método, es necesario tener una
columna apta para cada escala, por lo cual se debe modificar el tipo de volumen de la columna (que
implica cambiar de columna, ver tabla 1).

Para esto existen diferentes tipos de columnas, de diferentes diámetros, largos, materiales de
empaque y tipo de material de construcción; capaces de resistir altas presiones y ser totalmente
inerte a reaccionar con los componentes de la muestra. Entre estos se encuentran: los construidos
en plástico, en vidrio o en acero inoxidable.

Tabla 1. Escala cromatográfica vs diámetro de columna y tamaño de partícula.

Diámetro de la columna Tamaño
de
Escala 10 - 40 50 – 100
1 – 8 mm > 100 mm partícula
mm mm
(micrones)
Analítica X 1.7 – 10
Semi-
X 5 - 15
preparativa
Preparativa X 15 – 100
Proceso X 100 +

A partir de esto se desprenden varias definiciones acerca de la capacidad del equipo para separar
los componentes de la muestra, a esto se le llama Resolución y la conforman dos habilidades: La
separación mecánica (Eficiencia) y la separación química (Selectividad).

La Eficiencia del equipo depende principalmente de las características de la columna (diámetro,

longitud y tamaño de partícula del material de empaque). Pero, la modificación de las características
de la columna repercuten sobre el tiempo de corrida, la cantidad de solvente implicado y la presión
necesaria para realizar el muestreo.

Por ejemplo: Una columna el doble de larga puede mejorar la separación de dos picos, pero
duplicaría el tiempo de corrida y la presión necesaria para hacer fluir el solvente, también al doble.

Si por el contrario, se utiliza la misma columna inicial pero rellena con un tamaño de partícula dos
(2) veces menor, es posible obtener picos en mejor resolución con el mismo tiempo de retención
pero con un aumento en la presión hasta veinticinco (25) veces mayor.

Por otro lado, mejorar la Selectividad es el método más efectivo para lograr una mejor separación
sin tener que modificar la columna o sus características. Esto se realiza mediante una correcta
selección del solvente (puro o mezcla), con su respectivo gradiente; de modo que la interacción de
la muestra, con la fase estacionaria y la fase móvil, sea selectiva para cada tipo de componentes,
logrando la separación de la muestra.