PRACTICA 7

ENSAYO COLORIMETRICO DEL TETRAZOLIUM NITROBLUE (NBT):EVALUACION

DE LA PRODUCCION DE ANION SUPEROXIDO (O2-)

I. INTRODUCCIÓN
Los neutroó filos juegan un rol clave en proteger al cuerpo, utilizando una amplia
variedad de mecanismos microbiocidas dependientes e independientes de oxigeno
para eliminar los agentes infecciosos. Los mecanismos dependientes de oxigeno
implican la produccioó n de especies reactivas de oxigeno (ROS), atravez de lo que se
conoce como la explosioó n respiratoria oxidativa, que implica un elevado consumo de
oxigeno por estas ceó lulas, y que son escenciales para la proteccioó n contra los
patoó genos invasores. Mientras que los mecanismos independientes de oxigeno
incluyen muchas otras funciones del neutroó filo, tales como quimiotaxais , fagocitosis,
desgranulacion y liberacioó n de enzimas líóticas y peó ptidos bactericidas
El sistema responsable de esta explosioó n respiratoria oxidativa es la NADPH oxidasa,
que es un sistema de transferencia electroó nica multicomponente, que cataliza la
reduccioó n del O2 molecular Los electrones son transferidos desde el citosol y
entregados al oxigeno presente en un compartitmiento intracelular (fagosoma) o
extracelular El producto primario de la NADPH oxidasa es el O 2- y su metabolito inicial
el H2O2,ademaó s estos ROS son metabolizados en otros metabolitos reactivos de
oxigeno, que son fuertes microbiocidas.

La importancia de la produccioó n de ROS por los neutroó filos es ejemplificada por la

enfermedad granulomatosa croó nica (CGD), caracterizada por recurrentes infecciones
bacterianas y fuó ngicas a lo largo de la vida y la formacioó n de granulomas tisulares
El ensayo del NBT se basa en la acumulacioó n del precipitado formazan azul oscuro El
NBT, permeable a la membrana es reducido al formazan por el O 2- el cual es generado
luego de la activacioó n de los neutroó filos Este ensayo es colorimetrico, sensible y
cuantitativo y puede detectar pequenñ as cantidades de O2-
II. OBJETIVOS
Evaluar la produccioó n de anion superoxido (O2-) por neutroó filos activados

III. REACTIVOS Y MATERIALES

Materiales
- Tubos de centrifuga de 15ml (falcon)
- Centríófuga
- Micropipetas
- Tubos eppendofts
- Hemocitometro
- Espectrofotometro

Reactivos
- Ficoll – hypaque
- dextrano
- medio de cultivo RPMI – 1640
- PBS
- Sangre con anticoagulante ( EDTA )
- Azul de trypan
- NaCl 1,8 %
- NBT
- Dimetilformamida
- KOH 2M
- DMSO
- EDTA

IV. PROCEDIMIENTO
1. Aislar neutroó filos humanos apartir de sangre entera
2. Sembrar 1x 105 neutrofilos por pozo en una placa de cultivo celular de 24
pocillos en 500 ul de medio DMEM
3. Adicionar 100ul de solucioó n de NBT a cada pozo
4. Adicionar 1ul de PMA (200ng/ml) o buffer (control no estimulado) a los
pozos e incubar por 30 min a 37 oC
5. Lavar las celulas dos veces con PBS (37oC )
6. Fijar las celulas con metanol y dejar secar las placas al aire
7. Agregar 120ul de KOH 2M por pozo
8. Agregar 140ul de DMSO por pozo y disolver el formazan precipitado por
pipeteo
9. Tansferir la solucioó n de NBT disuelta a una cuveta de espectrofotoó metro y
medir la absorbancia a 620nm
10. Comparar la absorbancia entre lo neutrfilos estimulados y los no estimulados
para cuantificar la producion de O2- en cada muestra

V. RESULTADOS
1. Esquematice el ensayo del NBT
2. Hacer los caó lculos para determinar la cantidad de O2- producida

VI. CUESTIONARIO
1. Indique el fundamento del ensayo del NBT
2. ¿Queó es la explosioó n respiratoria?
3. indique los tipos de ROS producidos por los neutroó filos
4. ¿Queó importancia diagnostica tiene la determinacioó n de O2-?
5. Indique la reaccioó n catalizada por la NADPH oxidasa