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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUÍMICA Y BIOLOGÍA


DEPTO. DE BIOLOGÍA
ÁREA DE BIOLOGÍA MOLECULAR

REPORTE DE LABORATORIO

NOMBRE DE LA EXPERIENCIA: Extracción de DNA genómico de células procariotas, Ampliación


por PCR de un segmento del gen que codifica para rRNA 16S
FECHA: 14/05/2018
NOMBRE DE LOS ALUMNOS: Alba-Rayen Araya Acosta; Catalina Paz Bugueño Olivos, Luis
Fuentes Martínez

Introducción
Para poder analizar el DNA de una forma adecuada, se debe obtener en una cantidad y un
rango adecuado. Para ello se utilizan diferentes técnicas de extracción de DNA, donde
primeramente buscan lisar la célula, solubilizar el DNA y finalmente eliminar contaminantes.
En este caso utilizaremos DNAzol Reagent que emplea una solución lisante de guanidina y
detergente que permite realizar una precipitación selectiva de DNA a partir de la lisis celular
[1]. De igual manera, se utilizará una solución de fenol-cloroformo, con el fenol a pH 8 para
poder eliminar la mayor cantidad de proteínas como las nucleasas.

Una de las técnicas más utilizadas para amplificar DNA es el PCR (Reacción en Cadena de
la Polimerasa). Este requiere de una enzima polimerasa (taq DNA polimerasa) que es
termoestable y debido a que esta no puede sintetizar hebras de DNA de novo, se deben
utilizar primers que unan el primer nucleótido. Para el caso del PCR se requieren dos
primers donde estos no deben ser complementarios entre sí y deben aparear por
complementariedad de bases con la hebra de DNA [2]. En esta técnica se utilizan ciclos de
amplificación, donde la primera etapa de un ciclo se utiliza una temperatura de 92° para
separar las hebras de DNA durante un minuto. Posteriormente se baja la temperatura a
60°C (etapa de elongación) para producir la hibridación de los primers con el genoma y
finalmente se vuelve a subir la temperatura a 72°C permitiendo la acción de la taq DNA
polimerasa para realizar la síntesis de la cadena complementaria.
Resultados

I. Extracción de DNA genómico de células procariontes

A continuación, se presenta la electroforesis en gel de agarosa, realizada para visualizar los


resultados de la extracción de gDNA de E.coli.

Figura 1: Electroforesis de Extracción de DNA genómico de Escherichia coli


en gel de agarosa, del carril 1 al 5 corresponden al Estándar (ST 1kb), control positivo,
ACL, PA y ML respectivamente, siendo los 3 últimos a las muestras de extracción de gDNA
de cada grupo del laboratorio.

II. Amplificación por PCR de un segmento del gen que codifica para el rRNA 16S

Se presentan los resultados de la amplificación por PCR, observados en una electroforesis


en gel de agarosa

Figura 2: Electroforesis de Amplificación por PCR de Escherichia coli en gel de


agarosa, del carril 1 al 6 corresponden al Estándar (ST 1kb), control negativo, control
positivo, ACL, PA y ML respectivamente, siendo los 3 últimos las muestras de amplificación
por PCR de cada grupo del laboratorio.

Discusión
En la figura 1 se observan 5 carriles de izquierda a derecha los resultados obtenidos por los
grupos ACL y PA son DNA degradados quedando bajo el control positivo de la muestra de
electroforesis. El grupo LM no obtuvo muestra de DNA por esto no se observa en el carril
correspondiente. La degradación del DNA puede haber sido por la mala manipulación o
mala realización del procedimiento para la obtención de este. En el caso del grupo que no
obtuvo DNA, se estima que en el lavado realizado con etanol 70%, procedimiento en el cual
se descartó el sobrenadante por inversión, se haya resuspendido el DNA precipitado,
saliendo en conjunto con el sobrenadante y no dejando muestras de DNA en el tubo.
En la figura 2, se ve un control negativo correcto y luego un control positivo con una banda
no uniforme. Esto, se puede deber a que la cámara de electroforesis aumentó su
temperatura hasta fundir parte el gel de agarosa, permitiendo que el fragmento de rRNA
16S de control positivo haya migrado un poco más abajo que los carriles 4, 5 y 6. A su vez,
la forma de las bandas del carril 3 y 4 (curvada en el centro) se puede deber a una alta
concentración en dichas muestras, respecto a las bandas más lineales ubicadas en el carril
5 y 6. Las bandas de los 3 grupos, como la del control positivo, marcaron a 1500 pb,
correspondiendo a la longitud de la secuencia del gen que codifica para rRNA 16S que es
de 1541 pb [3].

Conclusión:
En este práctico, fue posible extraer DNA genómico desde E.coli utilizando DNAzol
Reagent, procedimiento que tiene por principal error la fragmentación del DNA, como
ocurrió en el caso de los dos primeros grupos que extrajeron DNA. También, a partir de una
muestra de DNA purificado, se realizó una PCR para amplificar la secuencia de genes que
codifica para rRNA 16S, mostrando una banda muy definida a los 1500 pb, denotando un
buen resultado en el procedimiento.

Referencias:
[1] Piotr Chomezynski, Karol Mackey, Roman Drews y William Wilfinger (1997) DNAzol: A
reagent for the Rapid Isolation of Genomic DNA: BioTechniques 22:550-553.
[2] Weier HU, Gray JW. A programmable system to perform the polymerase chain reaction.
DNA. 1988;7(6):441–7.
[3]Jürgen Brosius, Margaret L. Palmers, et al. (1978) Complete nucleotide sequence of a
16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli, PNAS. 75: 4801-4805.