Universidad de San Carlos de Guatemala

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia

Escuela de Medicina Veterinaria
Unidad de Ciencias Morfológicas
Curso: Histoembriología I, Código 138
Catedrático: Dr. Mario René Vásquez González
Año: 2017

MANUAL DE TÉCNICAS HISTOLÓGICAS

INTRODUCCION:

La técnica histológica comprende la preparación de los tejidos para su estudio al microscopio de luz, lo
cual se logra sometiendo a la totalidad o a una parte seleccionada del tejido a una serie de procesos:

 Fijación
 Deshidratación
 Aclaramiento
 Inclusión
 Corte
 Tinción

Tomando en cuenta también los diferentes métodos más usuales para la descalcificación de los tejidos.

OBJETIVOS:

A) Que se comprenda por qué se deben hacer los cortes histológicos coloreados para su estudio al
microscopio de luz.
B) Que se conozca los diferentes pasos a realizar en la técnica de inclusión en parafina.

MATERIALES:

a) Formol al 10% neutralizado

b) Alcohol isopropílico
c) Xilol
d) Parafina
e) Colorantes: Hematoxilina y Eosina
f) Permount o Merckoglass
g) Gelatina
h) Acido fórmico

EQUIPO DE LABORATORIO:

a) Baño de María
b) Mechero
c) Horno
d) Autotecnicón o Procesador de tejidos
e) Centro de Inclusión
f) Espátulas y pinzas
g) Láminas porta objetos
h) Laminillas cubre objetos
i) Micrótomo
j) Batería de coloración

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OBTENCION DE MUESTRAS:

La recolección de material puede hacerse de animales encontrados muertos (dependiendo del tiempo de
su muerte) y de animales sacrificados en el laboratorio, ya sea por desarticulación cervical, sangría,
narcotización o shock eléctrico. Es preferible que el examen necrópsico sea realizado inmediatamente
después de la muerte. Si es inevitable el retraso el cadáver debe ser colocado en refrigerador a 4
grados centígrados o sometido a embalsamamiento por vía arterial.

Para la recolección de material deben respetarse las siguientes normas:

a) Seleccionar adecuadamente las muestras de modo que sea representativa (del padecimiento)
b) Las muestras deben ser tomadas lo más rápidamente posible después que el animal ha muerto.
c) Toda muestra debe ser debidamente identificada

FIJACION:

En cuanto se extirpa un tejido del organismo animal se priva de su irrigación, empieza a descomponerse
o a cambiar su morfología siendo una causa la falta de oxígeno, la acumulación de bióxido de carbono y
otros productos sobre el metabolismo celular y de acción de diversas enzimas (autolisis).

Este mismo proceso empieza en todos los tejidos en cuanto se produce la muerte, y la rapidez de la
descomposición parece ser proporcional a la actividad metabólica propia del tejido.

Así pues, para preservar el estado natural de las células de los tejidos, es indispensable detener cuanto
antes este proceso de descomposición en los tejidos.

Para este propósito, debe colocarse el tejido en un volumen adecuado de una solución fijadora, lo más
pronto posible después de la obtención de la pieza del organismo animal.

La fijación es el proceso mediante el cual los elementos constitutivos de las células, y por tanto, de los
tejidos, son fijados en cuanto a su estado físico, y parcialmente también, en su estado químico, de
manera que puedan resistir el tratamiento sucesivo con varios reactivos sin pérdida, distorsión importante
o descomposición, la mayoría de los agentes fijadores actúan desnaturalizando o precipitando las
proteínas, que forman entonces una esponja o maya que tiende a englobar los otros componentes de la
célula.

En condiciones ideales, un fijador debe penetrar rápidamente al tejido, su acción debe ser inmediata, y
debe causar una pérdida y una alteración química y física mínima de las células y de sus componentes;
debe además, ser barato, estable y de fácil manejo.

En principios generales de Manejo y Fijación de las muestras la cantidad de líquido fijador debe ser
aproximadamente 10-20 veces el volumen de la muestra, excepto cuando se utiliza tetraóxido de osmio,
que es caro. Se debe tener en cuenta que no hay ningún fijador ideal y la elección depende del tipo de
células o de tejido que se desee estudiar, teniendo presente las posibles tinciones posteriores.

FIJADORES:

a) Formol al 10% neutralizado (fijador ordinario):

Ha sido neutralizado con fosfatos para alcanzar un pH de 6.8, tiene la ventaja de que es económico, fácil
de preparar, relativamente estable y permite el empleo ulterior de numerosas funciones, penetra bien en
los tejidos y no los hace duros ni quebradizos.

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El tiempo de fijación depende del tamaño de la pieza y oscila entre 12-24 horas.

Formol 37-40%........................................................... 100 ml.

Agua........................................................................... 900 ml.
Fosfato de sodio monobásico....................................... 3.5 gr.
Fosfato de sodio dibásico............................................. 6.5 gr.

b) Buoin (fijadores Acido Pícrico):

Llamado también picro -formalina y es considerado uno de los mejores fijadores del glucógeno, pero
tiene el inconveniente de alterar los lípidos y disminuye la cantidad de hierro férrico demostrable, también
produce lisis de los glóbulos rojos. La fijación oscila entre 1-12 horas.

Solución saturada de ácido pícrico al 1.2%................... 720 ml.

Formol al 37-40%......................................................... 250 ml.
Acido acético glacial...................................................... 50 ml.

c) Carnoy (fijador en alcohol):

Es buen fijador para el glucógeno y sustancia de Nissl pero disuelve otros elementos citoplásmicos.
Tiene el inconveniente de producir hemólisis y lacado de glóbulos rojos y disuelve los lípidos y la mielina.
La fijación oscila de 3-6 horas.

Alcohol etílico................................................................ 600 ml.

Cloroformo.................................................................... 300 ml.
Acido acético glacial....................................................... 100 ml.

d) Zenker (fijadores metálicos):

Esta solución destruye muchos glóbulos rojos y elimina gran parte del hierro de la hemosiderina. Es
excelente para preservar los detalles cuando se requiere tomar fotografías.

La fijación oscila de 6-15 horas.

Cloruro de mercurio........................................................ 50 gr.

Bicromato de potasio....................................................... 25 gr.
Sulfato de sodio............................................................... 10 gr.
Agua................................................................................ 1000 ml.
Acido acético glacial........................................................ 50 ml

e) Helly (fijador metálico):

Es un buen fijador para médula ósea y bazo. Es excelente para tomar fotografías. La fijación oscila de 6-
15 horas.

Cloruro de mercurio........................................................ 50 gr.

Bicromato de potasio.................................................... 25 gr.
Sulfato de sodio............................................................... 10 gr.
Agua................................................................................1000ml.
Formol 37-40%................................................................ 50ml.

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DESHIDRATACION Y ACLARAMIENTO DEL TEJIDO:

Los tejidos contienen grandes cantidades de agua tanto intra como extracelular, que debe ser eliminada y
reemplazada por parafina, a este proceso se le denomina deshidratación.

Tanto la deshidratación como el aclaramiento, se realizan en el autotecnicón, utilizando diferentes

soluciones o reactivos como formol neutralizado, alcohol isopropílico (se mezcla bien con el agua para
eliminarla), xilol (soluble en alcohol y afinidad con la parafina) y parafina fundida.

El tiempo de recorrido es de 12 horas y se hace de la siguiente forma:

REHIDRATACION:

Formol neutralizado.......... 1 hora

Formol neutralizado.......... 1 hora 2 recipientes

Alcohol isopropílico........... 1 hora

Alcohol isopropílico........... 1 hora
Alcohol isopropílico........... 1 hora 5 recipientes
Alcohol isopropílico........... 1 hora
Alcohol isopropílico........... 1 hora

ACLARAMIENTO (DESALCOHOLIZACION):

Xilol................................... 1 hora
Xilol................................... 1 hora 3 recipientes
Xilol................................... 1 hora

Parafina fundida................. 1 hora 2 recipientes

Parafina fundida................. 1 hora

La parafina fundida se mantiene a una temperatura de 56 – 60 grados centígrados.

INCLUSION:

Este proceso comprende la impregnación de los tejidos con un medio que llene todas las cavidades
naturales extra e intercelular, y que proporcione la consistencia firme necesaria para hacer cortes
bastante delgados sin provocar distorsión y sin alterar las relaciones espaciales del tejido y los
elementos celulares.

La inclusión la realizamos en el Aparato de Inclusión, éste se compone de un recipiente que contiene

parafina fundida a 60 grados centígrados y una plancha fría. Después de haber concluido el proceso en
el autotecnicón se incluyen los pequeños trozos de tejido en parafina fundida, formando pequeños
bloques.

Para realizar este proceso utilizamos moldes ya sea de plástico o papel parafinado (existen moldes
hechos).

Dentro del molde, antes de hechas la parafina, se coloca la pieza tisular poniendo hacia abajo el lado
perforado y se llena con parafina, luego el conjunto se enfría sobre la plancha fría. Cuando este conjunto
se ha endurecido, es retirado de la plancha fría, se anota el número y se desecha el molde y se procede
a cortarlo en cubo y se elimina el exceso de parafina.

Los soportes para bloques o tejidos son de madera, para fijarlo a éste se calienta una espátula plana de
hoja en la llama de un mechero de Bunsen; se coloca el fondo del bloque de parafina sobre la espátula y
en cuanto se derrita se desliza sobre la superficie cerrada del bloque de madera, teniendo cuidado de

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que los lados del bloque de parafina sean paralelos a los del bloque de madera, se presiona el bloque de
cera firmemente hacia abajo y se deja endurecer.

CORTE EN MICROTOMO:

Micrótomo, máquina construida para obtener láminas muy delgadas de tejidos. Existen varias clases de
micrótomos, por ejemplo:

 De deslizamiento
 Rotario
 De balanceo
 De congelación
 Para cortes ultradelgados que se usan en microscopía electrónica

Estas máquinas utilizan un juego de cuchillas, de las cuales, las más utilizadas en la actualidad son los
de filo de cuña.

El cubo de parafina con su soporte de madera se coloca en el micrótomo y se procede a calcular el corte.
El corte recomendado debe hacerse de 4-5 micras de grosor, luego, con una pinza se obtienen las piezas
cortadas y se dejan flotar en el Baño de María que debe estar a 60 grados centígrados conteniendo agua
y gelatina. Después se recogen con un portaobjetos, ya adherido a éste, se llevan al horno que debe
estar a 60 grados centígrados y se dejan durante un mínimo de 30 minutos para el secado.

TINCION:

Para poder colorear los cortes con hematoxilina eosina se procede de la siguiente manera:

Desparafinación: esto consiste en que antes de colorear debe eliminarse la parafina con una sustancia
que la disuelva y para esto el xilol es indicado.

a) Desparafinar los cortes con 3 recipientes con xilol, 5 minutos en cada uno.
b) Pasarlos después en 3 recipientes con alcohol isopropílico, 5 minutos en cada uno.
c) Lavar con agua corriente para hidratación 5 minutos.
d) Colorear con hematoxilina 5 minutos
e) Lavar rápidamente con agua corriente.
f) Sumergir los cortes una vez en alcohol ácido (alcohol isopropílico al 80% con 1cc de ácido
clorhídrico por cada 100cc de alcohol al 80%) para diferenciar.
g) Lavar con agua corriente durante 10 minutos para azulear los cortes
h) Sumergir por un minuto en Eosina al 5%
i) Lavar rápidamente con agua corriente
j) Deshidratar con 3 baños de alcohol isopropílico, pocas sumergidas
k) Aclarar con 2 baños de xilol pocas sumergidas
l) Montar los cortes con Permount, Merckoglass, Bálsamo de Canadá, etc.
m) Con la coloración de H.E. el núcleo se colorea azul y el citoplasma en rosado.

DESCALCIFICACION DE TEJIDOS DUROS:

Descalcificación consiste en disolver las sales de calcio y fosfato del hueso (Ca y P).

Los medios usados para descalcificar son los ácidos; todas estas soluciones ácidas lesionan la sustancia
orgánica de base en el hueso y otros tejidos, por lo tanto, deben protegerse por fijación antes de iniciar la
descalcificación.

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La fijación se logra mejor preparando piezas adecuadas de 2 a 4 mm. de espesor, se emplea sierra de
calado o de alambre, luego se ponen en formol neutro amortiguando durante 2 - 4 días, o en formol con
cloruro mercúrico, líquido de Helly, Susa de Heidehain o Líquido de Zenker por 15-24 horas.

Se recomienda tener más tiempo en formol las piezas, para que los ácidos nucleicos resistan a la acción
hidrolítica de los ácidos empleados en la descalcificación.

Se puede acelerar el fenómeno de descalcificación en caso de que se quiera estudiar hueso esponjoso o
su contenido (médula) para esto se recomienda cortar y desechar el hueso externo denso.

Para médula ósea se inicia lo más pronto posible, después de la muerte con el objeto de evitar los
fenómenos enzimáticos que pueden destruir muchos detalles celulares.

Con fines ordinarios se recomiendan 2 ácidos:

Acido Fórmico: preserva mejor el tejido para la tinción.

Acido Nítrico: dos veces más rápido que el fórmico.

El volumen de solución descalcificante es 30 ml/gr. de tejido y se debe cambiar una o dos veces al día
hasta terminar la descalcificación (125-250ml).

Pruebas para el estado de descalcificación:

-
 Por el tacto
 Flexibilidad
 Resistencia a la uña
 Introducción de una aguja
 Rayos “X”
 Pruebas químicas sobre el líquido descalcificado.

Ácidos descalcificantes:

 Acido fórmico 90/100

 Acido nítrico
 Acido tricloracético 5/100
 Acido clorhídrico 10/100
 Vérseno (EDTA) ácido etilendiamintetracético