DETERMINATION OF THE ENZYMATIC ACTIVITY AND PARAMETERS OF THE

MICHAELIS-MENTEN EQUATION (Vmax and Km)

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y PARÁMETROS DE LA

ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN (Vmax y Km)
Arrieta Q. Luis1, Hoyos S. Javier1, Tatis R. Orlando1, Pérez N. Noreidys1

Abstract
The α-Amialases are one of the enzymes
most studied and used in bioprocesses, these
enzymes are very important for the
hydrolysis of starch, have come to
completely replace chemical hydrolysis.
Enzymes are organic molecules produced
by living beings and are capable of
functioning outside the cell or organism that
produces them, because they are of organic
origin and help to preserve the environment.
In this study, we determined the enzymatic
activity in IU of the α-amialase at different
concentrations of substrate 2%, 7%, 13%,
obtaining values of 0.0324116, 0.438489
and 0.182894 respectively, also the
parameters were determined (Limeweaver
Burk 0.179575g / L * min and 3.35212886g
/ L, Eadie Hofstee 0.2127906g / L * min
and 11.627906 g / L, respectively)
Langmuir 0.20386113 g / L * min and
11.894685 g / L) respectively. From the
results obtained for the kinetic parameters of 3,35212886g/L,
Michaelis-Menten the Langmuir method
was the one that most adapted to the process
since this showed a linearity of 97.31%.
Keywords: Substrate, Bioprocess, α- fue el que más se adaptó al proceso ya que
Amialase, Hydrolysis.
Resumen
Las α-amialasas son unas de las enzimas
más estudiadas y utilizadas en los
bioprocesos, estas enzimas son muy
importantes para la hidrolisis de almidón,
han llegado a remplazar por completo la
hidrolisis química. Las enzimas son
moléculas orgánicas producidas por los seres
vivos y son capaces de funcionar fuera de la
célula u organismo que las produce, por ser
de origen orgánico ayudan a la conservación
del medio ambiente. En este estudio se
determinó la actividad enzimática en UI de
la α-amialasa a diferentes concentraciones
de sustrato 2%, 7%, 13%, obteniendo
valores de 0,0324116, 0,438489 y 0,182894
respectivamente, también se determinaron
los parámetros cinéticos de Michaelis-
Menten Vmax y Km utilizando diferentes
métodos obteniendo los siguientes
resultados, (Limeweaver Burk
0,179575g/L*min y
Eadie Hofstee
0,2127906g/L*min y 11,627906 g/L,
Langmuir 0,20386113 g/L*min y 11,894685
g/L) respectivamente. De los resultados
obtenidos para los parámetros cinéticos de
Michaelis-Menten el método de Langmuir
este mostro una linealidad del 97,31%

Palabras claves: Sustrato, Bioproceso,

α-amialasa, Hidrolisis.

1
estudiantes de ingeniería agroindustrial. Facultad de ingeniería. Universidad de sucre. Sincelejo
(Colombia). E-mail: luige_xxi@hotmail.com
1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas son catalizadores biológicos
de naturaleza proteica, esto significa que
son proteínas cuya función es acelerar las
reacciones bioquímicas. Para lograr
determinar la actividad de las enzimas es
de vital importancia conocer el
comportamiento (parámetros físicos y
químicos), es decir, su cinética.
La cinética enzimática estudia la
velocidad de las reacciones catalizadas
por enzimas. Estos estudios proporcionan
información directa acerca del mecanismo
de la reacción catalítica y de la
especifidad de la enzima. Cuando se
determina la velocidad inicial de la
reacción catalizada por la enzima a
distintas concentraciones de esta, en
presencia de concentraciones saturantes
de sustrato y manteniendo constantes los
otros factores ambientales (temperatura y
pH) se pueden establecer la relación entre
la cantidad de enzima y actividad
cinética. En estas condiciones, la
velocidad de reacción observada es la
velocidad máxima (Vmáx). La velocidad
puede determinarse bien midiendo la
aparición de los productos o la
desaparición de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparición de
producto (o de desaparición del sustrato)
en función del tiempo se obtiene la
llamada curva de avance de la reacción, o
simplemente, la cinética de la reacción.
La curva que expresa la relación entre la
concentración de sustrato y la velocidad
inicial tiene la misma forma para la
mayoría de las enzimas; se trata de una
hipérbola rectangular, cuya expresión
algebraica viene dada por la ecuación de
Michaelis-Menten, donde muestra la
relación entre la velocidad inicial y la
concentración de sustrato. Este
comportamiento es característico de la
mayoría de las enzimas y fue estudiado
por Michaelis y Menten en 1913. La
teoría de Michaelis-Menten ha
demostrado ser un poderoso Para analizar
la cinética enzimática. Esta ecuación
define La relación entre las velocidades
iniciales y las concentraciones de
sustrato. Las velocidades iniciales se
determinan usualmente Regresión de los
puntos de datos iniciales de las curvas de
progreso sustrato (Rui M.F. Bezerra, 2013)
En muchos casos es de vital importancia
conocer estos parámetros cinéticos,
debida que permiten la obtención de la
Km y la Vmáx de una enzima, los cuales
se vuelven indispensables no sólo porque
son parámetros que la identifican, sino
también por motivos que permiten
desarrollar de manera más eficiente y
eficaz reacciones a nivel de laboratorios e
industrial.
Con la presente práctica se buscó
determinar la actividad enzimática de la
α-Amylase from Bacillus licheniformis
diferentes concentraciones y los
parámetros de Michaelis-Menten (Vmáx
y Km) utilizando diferentes métodos
2. METODOLOGIA ml de solución de glucosa en las
concentraciones conocidas (0, 0.05, 0.1,
Para llevar a cabo la práctica se tomó una 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6). Se le añadió 0,25 ml
solución de almidón soluble, con un de reactivo de DNS, se llevó a un
volumen total de 100 ml, a unas agitador, seguido se sometió a agua en
concentraciones (2%, 7%, 13%) de ebullición durante 5 minutos, después se
almidón en un birreactor de 500 ml frenó la reacción en hielo durante 5
posterior mente se estabilizo el pH hasta minutos, se le adiciono 2,5 ml de agua
un 7.0 dependiendo su pH inicial. Con destilada y se agito para la
HCL o NaOH 0,1N. Después de esto se homogenización de la muestra. Seguido
llevó la temperatura hasta 80°C y una se llevó a espectrofotometría para leer la
velocidad de agitación de 400 rpm. absorbancia en el espectrofotómetro a 540
Seguido se adiciono 100 µl de solución mm. De cada una de las concentraciones
enzimática (α-Amylase from Bacillus ya mencionadas. Después de medida la
licheniformis), por cada gramo de absorbancia se graficó la (concentración
Almidón, en cada agitador bajo las de glucosa/ litros) vs (absorbancia mm),
condiciones de agitación y temperaturas con la ecuación de la pendiente de esta
dadas. Se le agrego 100 µg de CaCl2 grafica (Y= AX + B). Se calculó la
(calcium chloride) que es un activador [Media de Azucares Reductores] en (g/l).
enzimático, se agito continuamente bajo
las condiciones de trabajo especificadas. 3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Seguido de esto se tomó 500 µl para cada
uno de los tiempos (0, 30, 60, 90, 120, Presentación de la curva patrón para el
150, y 180) minutos de biorreacción. Para cálculo de las concentraciones de azúcar.
cada una de estas muestras se le agrego
Absorbancia [ ] azucares (g/l)
250 µl de DNS, se agito y se llevó a baño
0,051 0
de agua caliente a (~100°C) por 5
0,06 0,05
minutos, posteriormente a un baño de
0,089 0,1
hielo a (~4ºC) por 5 minutos, que
0,265 0,5
ocasiono un choque térmico para la
0,448 1
inactivación de la enzima. Después de
esto se le agrego 2,5 ml de agua destilada 1,256 2
y se agita para así llevarlo, al equipo de 1,785 3
espectrofotometría y medir la absorbancia 2,437 4
de cada una de las muestras en los 2,919 5
diferentes tiempos ya mencionados. 3,182 6
Tabla 1. Valores de los rangos de
Para la curva de calibración de glucosa. absorbancia y [] azucares.
Se tomó 2,5 ml de solución de glucosa, de
esta muestra se tomaron 9 tubos de
ensayo tapa rosca y se le agregaron 0,25
 Velocidades gr/L*Min
Curva Patron 2% 0,2016
7 7% 2,7274
6 y = 1,7713x - 0,0478
13% 1,1376
R² = 0,9916 Tabla 2. Datos de las velocidades para
[ ] azucares (g/l)

5
cada concentración de almidón.
4
3 Calculo de las concentraciones de
2 sustratos.
1
Para 2%.
0
0 1 2 3 4
Absorbancia

Grafica 1. Representación gráfica de la

curva patrón.

Para 7%.
Determinación de las velocidades
iniciales para las concentraciones de 2%,
7% y 13%

Tiempo vs [] azucares
90 reductores Para 13%.
y = 2,7274x + 0,1727
80 R² = 1
70
60
[ ] Azucares

50 y = 1,1376x + 3,1069
R² = 1
40
30
y = 0,2016x + 1,3153
[ ] de sustrato gr/L
20 R² = 0,9346 2% 20,214
10 7% 70,2
0 13% 130,33
0 20 40 60 80 Tabla 3. Valores de las concentraciones
Tiempo de sustratos.
2% 7% 13%

Grafica 2. Tiempo vs concentraciones de

azucares reductores.
 [ ] de sustrato Velocidades
9:38 90 1:20 0,413 13,674938
gr/L gr/L*Min
20,214 0,2016 10:08 120 1:20 2,093 73,190618
70,2 2,7274
130,33 1,1376 10:38 150 1:20 0,566 19,095116
Tabla 4. Datos de las concentraciones de
11:08 180 1:20 0,833 28,553858
sustratos y velocidades para cada Tabla 6. Datos obtenidos de absorbancia
concentración de sustrato. y [] de azucares en diferentes tiempos.
grafico de vel. inicial vs [ S ]
( )
3 y = 0,0346x - 0,4984
R² = 0,6125
velocidad inicial

2,5
2
1,5 ( )
1
0,5
0
0 20 40 60 80
[S]

Grafica 3. Concentración de sustrato vs

velocidades iniciales.

Calculo de la actividad enzimática para

una concentración de almidón del 2%.

[ ] de almidón 2% Calculo de la actividad enzimática para

Masa almidón (g) 2,0214 una concentración de almidón del 7%.
Temperatura °C 80
Vol. Sln (ml) 100 [ ] de almidón 7%
pH 7,05 Masa almidón (g) 7,02
[] inicial de az. Temperatura °C 80
2
(mg/dl) Vol. Sln (ml) 100
vel. Agitación rpm 400 pH 7,08
[ ] enzima (µl/g) 100 [] inicial de az.
7
Tabla 5. Condiciones de operaciones (mg/dl)
vel. Agitación rpm 400
[] [ ] enzima (µl/g) 100
Tiempo azucar Tabla 7. Condiciones de operaciones.
Hora Dis. Abs.
(min) reductores
(g/L) []
Tiempo azucar
8:08 0 1 0,248 0,3914824 Hora Dis. Abs.
(min) reductores
8:38 30 1:20 0,287 9,211262 (g/L)
8:08 0 1 0,1245 0,17272685
9:08 60 1:20 0,3795 12,488167
8:38 30 1:20 2,3415 81,993979 []
Tiempo azúcar
Hora Dis. Abs.
9:08 60 1:20 0,9143 31,4339918 (min) reductores
(g/L)
9:38 90 1:20 0,9053 31,1151578
8:08 0 1 1,781 3,1068853
10:08 120 1:20 0,9346 32,1531396 8:38 30 1:40 0,5525 37,23373
10:38 150 1:20 1,023 35,284798 9:08 60 1:40 0,6455 43,822966
11:08 180 1:20 0,8166 27,9728716 9:38 90 1:40 0,5845 39,500994
Tabla 8. Datos obtenidos de absorbancia
10:08 120 1:40 0,6405 43,468706
y [] de azucares en diferentes tiempos.
10:38 150 1:40 0,7845 53,671394
( )
11:08 180 1:40 0,562 37,906824
Tabla 10. Datos obtenidos de
( ) absorbancia y [] de azucares en
diferentes tiempos.

( )

( )

Calculo de la actividad enzimática para

una concentración de almidón del 13%.

[ ] de almidón 13%
Masa almidón (g) 13,033
Temperatura °C 82
Vol. Sln (ml) 100
Tabulación de los datos de la actividad.
pH 7,05
[] inicial de az.
13 Actividad enzimática UI
(mg/dl)
vel. Agitación rpm 400 2% 0,0324116
[ ] enzima (µl/g) 100 7% 0,438489
Tabla 9. Condiciones de operaciones. 13% 0,182894
Tabla 11. Datos de actividad enzimática
para cada concentración de sustrato.
Calculo de las velocidades para cada determinación de los parámetros de
concentración de sustrato. Michaelis-Menten.

Determinación del Vmax y el Km mediante

el método de Limeweaver Burk.

Para 2% 1/[ S ] 1/V

0,049471 6,391506
0,014245 6,474786
0,007673 5,172423
Tabla 14. Inversos de sustratos y
velocidades.
Para 7%
Limeweaver Burk.
7
6
5
y = 18,667x + 5,5687
4
1/V
R² = 0,3312
Para 13% 3
2
1
0
0 0,02 0,04 0,06
1/ [S]

Velocidad (gr/L * min) Grafica 4. Linealización mediante el método

2% 0,156476 de Limeweaver Burk para la determinación
de los parámetros cinéticos de Michaelis-
7% 0,1544452
Menten.
13% 0,193333
Tabla 12. Datos de velocidades para cada
concentración de sustrato.

Determinación de los parámetros de

Michaelis-Menten Vmax y Km por los
métodos de Limeweaver Burk, Eadie
Hofstee y Langmuir.

[ ] de sustrato Velocidades
gr/L gr/L*Min
20,214 0,156476
70,2 0,1544452
130,33 0,193333
Tabla 13. Datos de velocidades y
concentraciones de sustratos para la
Determinación del Vmax y el Km mediante Determinación del Vmax y el Km mediante
el método de Eadie Hofstee. el método de Langmuir.

V V/[S] [S] [S]/V

0,156476 0,007740 20,214 129,19791
0,1544452 0,002200 70,2 454,53001
0,193333 0,001483 130,3338 674,14153
Tabla 15. Valores de velocidades y de Tabla 16. Concentraciones de sustratos y de
velocidades entre concentraciones de concentraciones entre velocidades.
sustratos.
Langmuir
Eadie Hofstee 800
0,009 700 y = 4,9053x + 58,347
0,008 600 R² = 0,9731
0,007 y = -0,086x + 0,0183 500
0,006

S/V
R² = 0,3026 400
0,005
V/S

300
0,004
200
0,003
0,002 100
0,001 0
0 0 50 100 150
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 [S]
V
Grafica 6. Linealización mediante el método
Grafica 5. Linealización mediante el método de Langmuir para la determinación de los
de Eadie Hofstee para la determinación de parámetros cinéticos de Michaelis-Menten.
los parámetros cinéticos de Michaelis-
Menten.
Tabulación de los valores de Vmax y Km
para cada uno de los métodos utilizados.
Métodos Vmax Km
Limeweaver
Burk.
Eadie Hofstee
Langmuir
Tabla 17. Valores de Vmax y Km obtenidos
por cada uno de los métodos.
Actividad enzimática:
La tabla 11 muestra los valores obtenidos
de la actividad enzimática de la α-
amialasas para las concentraciones de
2%, 7% y 13% a un PH de 7 y
temperatura de 80°C estos dos últimos
constantes. Dado que la actividad
enzimática denota El potencial catalítico
de una enzima, que
Termodinámicamente, Se refieren a la
reducción de magnitud de la barrera de
energía requerida para convertir un
substrato En una producto y que Esta
reducción conduce a un aumento de la
tasa de reacción, por lo que la actividad es
Expresada y medida como una tasa de
reacción, convencionalmente referida
como la "velocidad inicial" De reacción ",
que representa el potencial máximo
catalítico de la enzima. (illanes, et al.,
2014) A partir de esta premisa podemos
inferir que el potencial máximo catalítico
de la enzima α-amialasas en el medio de
cultivo liquido de almidón es a una
concentración de 7% donde muestra
una actividad de 0,438489 UI esto en
base a la comparación de las
concentraciones de 2% y 7% igualmente
realizadas en este estudio . La literatura
establece que la velocidad inicial de
reacción es consustancial a la actividad
enzimática. (illanes, et al., 2014)
Entonces inferimos que esta relación
directa entre actividad enzimática y
concentración de sustrato no se mantuvo
para una concentración de almidón de
13% debido a que el factor temperatura
no se mantuvo constante si no que esta
estaba a 2°C más altos que las
temperaturas a las cuales fueron
sometidos los procedimientos a
concentraciones de 2% y 7% según
(DUARTE, 1995) Un incremento
adicional de temperatura reduce
gradualmente la velocidad de la reacción
catalizada a causa de la ruptura de los
enlaces covalentes dentro de la molécula
de enzima.
Parámetros de Michaelis-Menten:
La tabla 17 representa los valore
obtenidos de la velocidad máxima de
reacción (Vmax) y la constante de
Michaelis-Menten (Km) mostrando que
el modelo de Limeweaver Burk arroja
datos alejados de los valores de km y
vmax en comparación con los modelos
de Eadie-Hofstee y Langmuir en donde
estos últimos los valores de los
parámetros si son semejantes. el método
de Langmuir fue el que más se adaptó al
proceso ya que este mostro una linealidad
del 97,31% por tanto los valores de este
del Km y Vmax son los más confiables.
El conocimiento del Vmax nos da
información sobre la cantidad de enzima
presente ya que Vmax es directamente
proporcional a la concentración de
enzima. A medida que aumenta la
concentración de enzima aumenta la
concentración del complejo enzima
sustrato y por lo tanto aumenta la
velocidad de la reacción de igual manera
el conocer de Km nos indica la afinidad de
la enzima por un determinado sustrato.
Cuanto menor es Km mayor es la afinidad
de la enzima por el sustrato. (cruz, 2012).

COMPARACION CON OTROS
ESTUDIOS.
Comparando los valores de los
parámetros Km y Vmax determinados
para la enzima α-amialasa con estudios
realizados por (Mera & carrera, 2004) los
valores no son semejantes. En este
estudio utilizaron el modelo de
Limeweaver Burk para determinar los
parámetros de Michaelis-Menten y el
sustrato utilizado almidón de yuca.
4. CONCLUSIONES.
La actividad enzimática de α-amialasas
(temperatura de 80°C y PH de 7)
obtenida para las concentraciones de
almidón del 2%, 7% y 13% fue de
0,0324116 UI, 0,438489 y 0,182894 UI
respectivamente. En donde la mayor
actividad de la enzima se dio a una
concentración de sustrato de 7%.
la temperatura. El método de adición de la
solución reguladora o solución buffer
debe ser más preciso para evitar cambios
en el PH en el proceso de determinación
de la actividad enzimática y parámetros
de Michaelis-Menten.
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Burk fueron Vmax de 0,179575 y de almidones gelatinizados del
Km de 3,35212886 . Por el método de fruto de la planta de banano.
Eadie Hofstee el Vmax de 0,2127906 medellin.
y el Km de 11,627906 y por el  Doran, P. M. (1995).
método de Langmuir se obtuvieron PRINCIPIOS DE LA
valores de Vmax y Km de 0,20386113 INGENIERIA DE LOS
y 11,894685 respectivamente. En BIOPROCESOS.
donde los valores de los parámetros por el Sidney,Australia: ACRIBIA S.A.
método de Limeweaver Burk fueron los
que no se asemejaron a los otros dos  DUARTE, T. ( 1995).
métodos de determinación de los INTRODUCCION A LA
parámetros de Michaelis-Menten. el
método de Langmuir fue el que más se INGENIERIA BIOQUIMICA.
adaptó al proceso ya que este mostro una SANTAFE DE BOGOTA.
linealidad del 97,31%
Los métodos prácticos del procedimiento  illanes, a., wilson, l., & vera, c.
para controlar la temperatura deben ser (2014). Problem Solving in
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