UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

BIOQUÍMICA GENERAL
Práctica de Laboratorio: Volumetría

Volumetría.-

El análisis volumétrico o volumetría consiste en la determinación de la concentración de

una sustancia mediante una valoración, que es el cálculo de volumen necesario de una
sustancia de concentración conocida (solución patrón) que ha de reaccionar
completamente con la sustancia a analizar.

La valoración se basa en el hecho de que el punto final de la misma coincide con el punto
de equivalencia donde el número de equivalentes del reactivo coincide con el número de
equivalentes de la sustancia problema. En el punto final de la valoración se cumple:

V. N = V´. N´

Material de vidrio volumétrico.-

Los vidrios son sales de sílice, como el silicato de sodio o el borosilicato. El vidrio
empleado en la fabricación del material de vidrio para el laboratorio generalmente es el
vidrio borosilicato porque presenta una muy buena resistencia química y una muy alta
resistencia al calor y a los cambios de temperatura. El cuarzo, utilizado para fabricar celdas
o tubos empleados en espectrofotometría y fluorometría es dióxido de silicio que no
reacciona con la mayoría de productos químicos, pero se deteriora con los hidróxidos.

El material de vidrio utilizado para medir líquidos con precisión son las fiolas o matraces
aforados, las buretas y las pipetas. Medidas no tan precisas se pueden realizar en probetas
o cilindros graduados. Los frascos Erlenmeyer y los “beakers” o vasos de precipitado
tienen indicaciones de volumen sólo referenciales que indican la cantidad de volumen
aproximado que pueden contener por lo tanto, no pueden ser utilizados para medir
líquidos con precisión. Una ventaja que tienen los frascos Erlenmeyer y los “beakers”
sobre las fiolas y las probetas es que pueden ser utilizados para preparar soluciones sobre
placas calefactoras o para realizar reacciones exotérmicas como por ejemplo, diluir ácido
sulfúrico. Estas soluciones al enfriarse, pueden ser ajustadas a su volumen final en una
fiola o en una probeta graduada. Nunca se debe calentar una fiola o una probeta
graduada.

El material volumétrico es calibrado por el fabricante que debe indicar si la calibración de

este material se realiza para contener determinado volumen y grabar las iniciales TC o IN
(TC del inglés: to contain, que significa contener) o para transferir o entregar (en inglés:
Deliver) y grabar las iniciales TD o EX. Es importante que este calibrado sea avalado por
una entidad oficial de calibrado y estándares que certifique el uso de patrones de
referencia nacionales e internacionales. Estos patrones permiten que el fabricante pueda
comparar su calibración con estos patrones y pueda conocer cualquier diferencia entre su
producto y los patrones. El límite de error, es la diferencia entre el volumen del material
calibrado y la cantidad que dice contener o transvasar y el fabricante debe hacerlo
conocer al usuario, grabándolo en el material volumétrico, indicándolo en sus catálogos o
proporcionando certificados de calibración en el momento de la compra.

Frasco Erlenmeyer Vaso de precipitado o “beaker”

Fiolas o matraces aforados.- Se emplean en la preparación de soluciones exactas. Se

encuentran fiolas con capacidad desde 1 mL hasta 10 000 mL. La mayoría de las fiolas
están calibradas por el fabricante para contener una cantidad definida de líquido a 20°C y
tienen una marca grabada en el cuello que indica dónde debe quedar el nivel superior del
líquido que se lee en el punto más bajo del menisco. El límite de error (±mL) indica el
grado de exactitud y depende de la marca y del tamaño de la fiola. Por ejemplo, en la fiola
de 100 mL de la marca BLAUBRAND®, el límite de error es ± 0,10 mL mientras que en la
fiola de 100 mL de la marca SILBERBRAND el límite de error es ± 0,15 mL. En la fiola de 1
000 mL de la marca BLAUBRAND®, el límite de error es ± 0,40 mL mientras que en la fiola
de 1 000 mL de la marca SILBERBRAND el límite de error es ± 0,60 mL. BLAUBRAND® y
SILBERBRAND son marcas de la fábrica de vidrio BRAND.

Fiolas
Probetas graduadas.- Llamadas también cilindros graduados, como su nombre lo indica,
son cilindros de vidrio pegados a una base de vidrio o de plástico. Se encuentran probetas
graduadas desde 5 mL hasta 2 000 mL. El cilindro lleva graduaciones que indican un
volumen determinado y el nivel superior del líquido se lee en el punto más bajo del
menisco. En la parte superior del cilindro se indica el volumen y la división. Por ejemplo,
50:1 esto indica que es una probeta que contiene 50 mL y que las graduaciones o
divisiones son de 1 mL. Muchas marcas también indican el límite de error (±mL) que
depende de la marca y del tamaño de la probeta graduada. Por ejemplo, en la probeta
graduada de 100 mL de la marca BLAUBRAND®, el límite de error es ± 0,5 mL mientras que
en la probeta graduada de 100 mL de la marca SILBERBRAND el límite de error es ± 0,8
mL. En la probeta graduada de 1 000 mL de la marca BLAUBRAND®, el límite de error es ±
5 mL mientras que en la probeta graduada de 1 000 mL de la marca SILBERBRAND el
límite de error es ± 8 mL. Si comparan el límite de error de las fiolas con el de las probetas
graduadas verán porqué al utilizar fiolas se preparan soluciones más exactas que con
probetas graduadas.

Probetas graduadas

Buretas.- Son tubos graduados de diámetro pequeño, adaptados para entregar pequeños
volúmenes de líquido. El flujo comienza, se regula o se cierra en el extremo inferior
mediante una llave que el estudiante manejará con su mano izquierda utilizando los dedos
índice y pulgar. El tubo lleva graduaciones que indican un volumen determinado y el nivel
superior del líquido se lee en el punto más bajo del menisco. Hay buretas de 10, 25 y 50
mL y en el caso de la marca BLAUBRAND®, el límite de error es ± 0,02 mL, ± 0,03 mL y ±
0,05 mL respectivamente. Durante la práctica el alumno aprenderá a utilizar la bureta.
 Bureta

Pipetas.- Las pipetas son tubos adaptados para medir cantidades más pequeñas que las
medidas en probetas graduadas. Las pipetas pueden ser divididas en:
1. Pipetas aforadas o volumétricas
2. Pipetas graduadas
a) Pipetas graduadas de vaciado parcial o pipetas de Mohr
b) Pipetas graduadas de vaciado total

Pipetas aforadas o volumétricas:

Se utilizan para vaciar un solo volumen específico de líquido. Hay pipetas volumétricas
desde 0,5 mL hasta 100 mL. Tienen la forma de palos de amasar y uno de sus extremos
es romo mientras que el otro termina en punta. Son utilizadas cuando se requieren
medidas de gran precisión ya que está diseñada para transferir sólo un volumen y está
calibrada a ese volumen.

En una pipeta volumétrica, las especificaciones se encuentran en el extremo romo de la

pipeta o en el bulbo en el centro de la pipeta e indican:
 El volumen que puede ser transferido
 La temperatura a la cual fue calibrada
 Si es una pipeta TD (Ex en Europa)
 En algunas marcas se indica el límite de error

El límite de error depende de la marca y del tamaño de la pipeta volumétrica así las
pipetas volumétricas de 1 mL de la marca de la marca BLAUBRAND®, el límite de error
es ± 0,015 mL, las pipetas volumétricas de 5 mL de la marca de la marca BLAUBRAND®,
el límite de error es ± 0,03 mL y las pipetas volumétricas de 10 mL de la marca de la
marca BLAUBRAND®, el límite de error es ± 0,04 mL.

Al transferir soluciones con una pipeta volumétrica el líquido se deja caer lentamente,
regulando el flujo con el dedo índice hasta que el líquido salga del bulbo central.
Cuando el líquido haya salido del bulbo central, para completar la transferencia se
apoya la punta de la pipeta sobre la pared del recipiente en ángulo de 30° hasta que
deje de salir la solución. En ningún momento se ejerce fuerza para vaciar la pipeta
debido a que esta pipeta ha sido calibrada para transferir o entregar (en inglés:
Deliver). Luego que se deja caer el líquido contenido en la pipeta, el pequeño volumen
que queda en la punta no se sopla o se fuerza con una bombilla.

Pipetas graduadas: Son tubos de vidrio con un extremo en punta. Están calibradas en
pequeñas divisiones o graduaciones, de tal manera que se pueden medir diferentes
volúmenes con una sola pipeta. Con estas pipetas suelen medirse cantidades entre
0,01 mL y 25 mL pero no son tan precisas como las pipetas volumétricas debido a que
cualquier imperfección en su diámetro interno tendrá un efecto sobre el volumen
transferido.

Las especificaciones se encuentran en el extremo romo de la pipeta como se muestra

en la figura de arriba e indican el volumen máximo que puede ser transferido (10 mL),
el tamaño de las divisiones o graduaciones de la pipeta (1/10 ó 0,1 mL), la temperatura
a la cual se realizó la calibración y la manera en la cual fue calibrada que por lo general
es para transferir (TD). Cuando son calibradas para contener, todo el líquido debe ser
evacuado de la pipeta y para ello se debe ejercer presión o soplar la pipeta.

a) Pipetas graduadas de vaciado parcial o pipetas de Mohr.- Llamadas

también pipetas no terminales porque la graduación termina antes de
llegar al extremo en punta, por lo tanto, se deja de trasvasar el líquido
cuando éste llega a la última marca. Las especificaciones se encuentran
en el extremo romo.

b) Pipetas graduadas de vaciado total.- Llamadas también pipetas

terminales porque la graduación termina en la punta de la pipeta.
 En las pipetas graduadas de vaciado terminal, al transferir
soluciones, el líquido se deja caer y para completar la transferencia se apoya
la punta de la pipeta sobre la pared del recipiente en ángulo de 30° hasta que
deje de salir la solución. En ningún momento se ejerce fuerza para vaciar la
pipeta debido a que esta pipeta ha sido calibrada para transferir o entregar
(en inglés: Deliver). Cuando las pipetas graduadas de vaciado terminal tienen
una banda pavonada (opaca) o dos bandas de color en el extremo superior
(ver figura) son denominadas pipetas serológicas. Éstas son también pipetas
TD (EX) pero, han sido calibradas para una vez que son vaciadas por gravedad,
se soplan para así poder evacuar el líquido completamente.

Pipetas serológicas

Examine las siguientes especificaciones y explique qué significan:

- 1 mL 1/100
TD 20°C

- 5 en 1/10 mL
TD 20°C
EXAMINE LAS PIPETAS A Y B: ¿Cuál es la pipeta de Mohr y cuál es la pipeta de
vaciado total?

El límite de error depende de la marca y del tamaño de la pipeta de vaciado total, así
en las pipetas de vaciado total (TD ó Ex) de 1 mL de la marca de la marca BLAUBRAND®,
el límite de error es ± 0,007 mL, las pipetas de vaciado total (TD ó Ex) de 5 mL de la
marca de la marca BLAUBRAND®, el límite de error es ± 0,05 mL y las pipetas de
vaciado total (TD ó Ex) de 10 mL de la marca de la marca BLAUBRAND®, el límite de
error es ± 0,05 mL.

En las pipetas y en los frascos volumétricos en general, el nivel superior del líquido se
lee en el punto más bajo del menisco. Cuando el Líquido es opaco y por lo tanto es
difícil de distinguir el punto más bajo del menisco, se lee el punto más alto del líquido.

Micropipetas automáticas.- La micropipeta es un instrumento de laboratorio

empleado para absorber y transferir pequeños volúmenes de líquidos mediante el
desplazamiento de aire. Los volúmenes captables por estos instrumentos varían según
el modelo: los más habituales, denominados p20, p200 y p1000, admiten un máximo
de 20, 200 y 1000 microlitros, respectivamente. Las macropipetas automáticas
entregan volúmenes mayores de líquido.

El uso de micropipetas permite emplear distintos líquidos sin tener que lavar el
aparato: para ello, se emplean puntas desechables, de plástico, que habitualmente son
estériles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las amarillas para pipetear
volúmenes pequeños (por ejemplo, 10 microlitros), y las azules para pipetear
volúmenes grandes (por ejemplo, 800 microlitros).

En algunas micropipetas el volumen a aspirar se fija girando un botón en su parte

superior que está conectado a un sistema analógico de confirmación de volumen. En
otras, dicho sistema es digital.

Hay micropipetas simples, que sólo acogen una punta cada vez, y multicanales, que
permiten incorporar múltiples puntas (por ejemplo, ocho), absorbiendo el mismo
volumen en todas ellas.
Las micropipetas tienen dos topes para el pistón que desplaza el aire: el primero
permite tomar el volumen de líquido fijado con la punta descartable y el segundo para
transferir el líquido a otro recipiente.

Micropipetas de un solo canal y multicanal

Cuidados en el manejo de las pipetas de vidrio.-

- Las pipetas astilladas o rajadas deben descartarse porque no son seguras y pueden
afectar la precisión de las medidas.
- Por motivos de seguridad, nunca utilice la boca para aspirar con la pipeta líquidos
corrosivos o que puedan contener sustancias u organismos que puedan poner en
riesgo su salud. Si va a aspirar con la boca, asegúrese que nadie haya usado antes la
misma pipeta.
- Sostenga la pipeta por el tercio superior del tubo y evite que el extremo en punta
tome contacto con algo.
 Como manejar una pipeta
- Las pipetas sucias deben ser colocadas en un cilindro o en una bandeja con agua
jabonosa o una vez enjuagadas con agua corriente colocarlas en un cilindro o
bandeja con mezcla sulfocrómica, que es una solución de dicromato de potasio,
ácido sulfúrico y agua. Coloque las pipetas desechables usadas en una caja de
cartón. Nunca deje las pipetas sucias en los mostradores o los lavaderos. Si trabaja
con material radioactivo, asegúrese de colocar las pipetas contaminadas en un
recipiente que ha sido rotulado adecuadamente.

El manejo de pipetas estériles.-

- Cuando utilice pipetas estériles descartables, asegúrese de utilizar las técnicas

sanitarias adecuadas. Al abrir un paquete de pipetas descartables, rasgue sólo una
esquina del paquete y empuje a través de esta abertura una pipeta, luego cierre
inmediatamente el paquete para evitar la contaminación.
- Si usted utiliza pipetas estériles que mantiene en un envase para pipetas, coloque
el envase de costado, saque la tapa, retire una pipeta e inmediatamente coloque la
tapa.

Transferencia de un volumen preciso de líquido.-

- Para aspirar líquido en la pipeta se utilizan peras de goma de tres válvulas,

bombillas y llenadores de pipetas. Si usted no tiene ninguno de éstos, puede
fabricar fácilmente un llenador de pipeta empleando una jeringa hipodérmica
descartable y un trozo de manguera de goma.

a) pera de goma, b) bombilla c) llenador de pipeta

- En el laboratorio practicarán el llenado de una pipeta con un líquido coloreado y
con leche y la transferencia del líquido a otro recipiente siguiendo las instrucciones
que a continuación se indican:
1) Sostenga la pipeta a 8 cm por debajo del extremo superior con una mano.
Con la otra mano apriete la bombilla y coloque la apertura en la boca de la
pipeta. Si utiliza un llenador de pipeta, coloque la apertura (o la manguera
de jebe si usted lo fabricó) en la boca de la pipeta. No inserte más de 1 cm
de la pipeta en la bombilla o en el llenador de pipeta.

2) Coloque la punta de la pipeta en el líquido coloreado y si usa la bombilla,

suelte lentamente la presión sobre la bombilla. Si utiliza un llenador de
pipeta, jale lentamente el émbolo del aparato. El líquido entrará en la
pipeta y formará una superficie curvada contra el vidrio. Esta superficie se
llama menisco. Suba la porción inferior del menisco hasta
aproximadamente 1 cm por encima del nivel deseado.

3) Luego, rápido pero cuidadosamente remueva la bombilla o el llenador de

pipeta mientras desliza su dedo índice libre sobre el hueco de la boca de la
pipeta. Nunca use el pulgar. Su dedo índice le permite un mejor control y
le permite sostener otros objetos (como la tapa del frasco donde
transferirá el líquido) con sus otros dedos cuando es necesario. Luego, con
su dedo aún en la boca de la pipeta, retire lentamente la pipeta de la
solución.
4) Luego, levante su dedo lo suficiente para permitir que el líquido fluya
lentamente hasta que el punto más bajo del menisco llegue a la marca de
graduación deseada. Debe observar el menisco al nivel de sus ojos
mientras realiza esta operación. Cuando el menisco llega al nivel adecuado,
toque la punta de la pipeta con la pared interna del frasco para remover
cualquier gota de líquido que se encuentre en la punta de la pipeta. Ahora,
hay exactamente 0,45 ± 0,001 mL en su pipeta.

5) Manteniendo su dedo en la boca de la pipeta, muévala lentamente hacia el

frasco de transferencia. Toque la pared interna del frasco con la punta de la
pipeta, levante el dedo índice de la boca de la pipeta, permitiendo que el
líquido drene fuera de la pipeta. Mantenga la pipeta en esta posición unos
cuantos segundos después que la pipeta deja de drenar.
 6) Luego, use una pipeta serológica y tome exactamente 2,5 ± 0,1 mL (si le
toca una pipeta de 5 mL) ó 0,5 ± 0,001 mL ( si le toca una pipeta de 1 mL)
de una solución coloreada. ¿Cuál sería la diferencia con el procedimiento
anterior?

7) Repita ambas experiencias empleando leche en lugar de la solución

coloreada. ¿Qué es lo que debe de tener en cuenta cuando mide líquidos
opacos?

Resumen

- Apriete la bombilla y colóquela en la boca de la pipeta ó coloque la boca

de la pipeta en la abertura del llenador de pipeta.
- Coloque la punta de la pipeta en el líquido a ser transferido y libere
lentamente la presión sobre la bombilla ó jale el embolo del llenador de
pipeta.
- Tome líquido por encima del nivel necesitado, reemplazando rápidamente
la bombilla o el llenador de pipeta con el dedo índice.
- Deje que el líquido drene hasta que el fondo del menisco enrace con la
graduación adecuada de la pipeta.
- Toque la punta de la pipeta con la pared interior del frasco para remover
cualquier gota adherida a la punta.
- Transfiera el líquido a un segundo envase y toque con la punta de la pipeta
la pared interna del frasco y deje que el líquido drene de la pipeta.

Otros tipos de pipetas.-

Para la transferencia de volúmenes no calibrados de hasta 2,5 mL se usan las pipetas de
transferencia de vidrio denominadas pipetas Pasteur. Éstas pueden ser esterilizadas.
Para la transferencia de volúmenes de 1 o 2 mL calibrados groseramente se emplean
pipetas de plástico de una pieza que se pueden comprar estériles o sin esterilizar.
Bibliografía.-

- www. Brand.de. Revisado el 20 de Abril de 2010.

- www.coleparmer.com/catalog/product_index.asp?... Revisado el 21 de Abril de

2010.

- Nolte, A., Wisniewski, D., Yunus, S. and Dusenbery, R. http://74.125.45.132/search?

q=cache:AwnNu8cQbAAJ:www.timbertest.co.nz/docs/PPT_pipetteSlides-
RLD4.ppt+pipettes+module&cd=6&hl=es&ct=clnk&gl=pe The Michigan University-
Dearborn revisado el 22 de abril 2010.

- www.sigmaaldrich.com revisado el 21 de abril de 2010.

- Simmons, J.S. and Gentzkow, C.J..(eds.)(1944) Laboratory methods of the united

states army, fifth edition, Lea and Febriger, Philadelphia.
- http://es.wikipedia.org/wiki/Micropipeta. revisado el 18 de Abril de 2010.

PATRICIA WOLL