Diagnóstico de laboratorio de

CRYPTOSPORIDIOSIS
INTESTINAL
Curso No. 8008-C

US. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES-PUBLIC HEALTH SERVICE

CENTERS FOR DISEASE CONTROL- ATLANTA GEORGIA 30333
 LIBRO DE TRABAJO DE AUTO-APRENDIZAJE
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS*
Curso No. 8008-C

Dr.P.H Sandra L. Bullock-Iacullo.

Sucursal de desarrollo de método de laboratorio
División de entrenamiento
Oficina de Programas de entrenamiento y laboratorio

*Nota: Pese a que este manual se desarrolló originalmente para ser utilizado con
los especimenes que se otorgaban para los ejercicios, la información que se da en
este libro de trabajo es útil, aún sin estos especimenes de trabajo. Los
estudiantes pueden realizar los procedimientos utilizando testigos de su propio
laboratorio y materiales de compañías comerciales.

Mayo 1988

U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES

Public Health Service
Centros para el control y prevención de enfermedades
Atlanta, Georgia 30333

*Actualizado de la versión impresa original en Dic 2000.

i
 RECONOCIMIENTO

Deseo expresar un agradecimiento especial al Sr. Richard Green y al Sr. Don

Howard por su fotomicrografía experta, a la Sra. Sara Cote por su ayuda en la
preparación de las ilustraciones, a la Sra. June Sumpter por corregir el manuscrito
pacientemente y a la Sra. Shirley Holmes cuya magia en la computadora produjo
la versión final de este manual.

Dr. P.H. Sandra L. Bullock-Iacullo.

El uso de nombres de marcas es únicamente para identificación y no constituye un

aval del Public Health Services o del US. Department of Health and Human
Services.

ii
 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS INTESTINAL

Instrucciones previstas: auto-estudio. Nivel intermedio. La instrucción se limita

al diagnóstico de laboratorio; las referencias para la información clínica se
enumeran en la última sección de este libro de trabajo. La instrucción está
dirigida hacia su uso en un ambiente de práctica de parasitología en el
laboratorio.

SE PROPONE PARA LAS SIGUIENTES PERSONAS:

Técnicos de laboratorio con suficiente experiencia en parasitología diagnóstica

que puedan identificar correctamente quistes de Giardia lamblia (sin. Giardia
intestinalis) en frotis directos con solución salina, laminillas teñidas con lugol y
tricrómica. Con las instrucciones escritas y el equipo y materiales necesarios,
los técnicos de laboratorio serán capaces de realizar la tinción ácido-resistente y
la técnica de concentración con formalina-acetato de etilo.

TIEMPO REQUERIDO PARA COMPLETAR EL PAQUETE DE ESTUDIO:

Aproximadamente 6 horas, tomando en consideración que el equipo y materiales

estén listos para usarse.

MATERIALES QUE SE PROVEEN EN EL PAQUETE DE ESTUDIO:

1. Libro de trabajo
2. Seis viales con heces en formol (un testigo positivo y cinco “desconocidos” **)

MATERIALES Y EQUIPO NECESARIOS:

1. Microscopio binocular equipado con el equivalente a una lámpara de

halógeno de 20 watts, con objetivos de 40 X y 100X con aceite de inmersión,
un filtro azul para luz de día y un ocular micrométrico calibrado.
2. Aceite de inmersión.
3. Laminillas de vidrio para microscopio, 76 x 50 mm, aproximadamente 20.
4. Cubreobjetos, grosor #1, 22 x 22 mm, aproximadamente 20.
5. Formol neutral buferado al 10%, aproximadamente 100 ml (la misma que
para la técnica de concentración; ver instrucciones de preparación en la
página 14).
6. Solución de lugol Dobell y O'Conner, aproximadamente 10 ml, fresco (ver
instrucciones de preparación en la página 14).
7. Aplicadores de madera, aproximadamente 40.
8. Pipetas Pasteur con bulbos de hule, aproximadamente 20.

**No se ofrece en la versión del libro de trabajo en CD-ROM.

1
9. Materiales y soluciones para hacer la técnica de concentración de formalina-
acetato de etilo (ver las instrucciones en la página 15).
10. Materiales y soluciones para hacer las técnicas de tinción modificada de
Kinyoun o ácido-resistente de auramina O ó ambas (ver instrucciones en las
páginas 18 y 21).

OBJETIVOS:

Al completar este programa de estudio y ofreciendo todos los materiales y el

libro de estudio necesarios, los participantes serán capaces de:

1. Describir la morfología de los oocistos de Cryptosporidium en frotis

directo con preparaciones de solución salina y solución de lugol, y
las preparaciones con tinción tricrómica y ácido-resistente.
2. Describir los tipos de especimenes fecales que tienen más
probabilidades de contener oocistos y cuáles deben ser
examinados rutinariamente para la presencia de oocistos.
3. Realizar la técnica de concentración de formalina-acetato de etilo
en una muestra fecal que contenga oocistos y que se demuestre
la presencia de estos al microscopio en un frotis fecal teñido con
solución de lugol.
4. Utilizando el concentrado del #3 descrito arriba, realizar la técnica
modificada de Kinyoun o ácido-resistente de auramina O ú ambas
y demostrar la presencia de oocistos al microscopio.

Para evaluar la realización de los objetivos de arriba, los participantes

elaborarán pruebas en los oocistos de Cryptosporidium de los cinco viales de
contenido “desconocido” del paquete de estudio. Los participantes deben
informar sobre la presencia o ausencia de oocistos en cada muestra. Se
considerará como desempeño satisfactorio (80%) cuando se ofrezcan reportes
correctos para cuatro de las cinco muestras.

NOTA IMPORTANTE ACERCA DE Isospora belli:

Aunque este programa de estudio se enfoca específicamente al diagnóstico de

laboratorio de los oocistos de Cryptosporidium, los procedimientos que se han
dado, especialmente la tinción ácido-resistente, pueden ser utilizados para el
diagnóstico de los oocistos de Isospora belli. La información adicional acerca de
los oocistos de Isospora belli sobre la tinción ácido-resistente, se da con cada
técnica de tinción y se ofrece en la sección del libro de trabajo (sección azul).
Referencias para la información clínica de Cryptosporidium, se incluyen también
en la última sección del libro de trabajo.

* No se incluye en la versión en CD de este libro de trabajo.

2
MEDIDAS DE SEGURIDAD:

Las muestras fecales en este programa de estudio están conservadas en formol

neutro buferado al 10% y lo más seguro es que no sean infecciosas**. Sin
embargo, TODOS LOS ESPECIMENES, especialmente los especimenes sin
conservadores, deben ser tratados como infecciosos capaces de transmitir
infecciones de importancia. Las heces pueden contener virus, bacterias,
protozoarios e incluso algunos helmintos, los cuales son inmediatamente
infecciosos. Por favor siga de cerca las medidas de seguridad de su laboratorio
para manejar y muestrear los especimenes médicos.

Las siguientes referencias pueden ser útiles para conocer las medidas de
seguridad y pruebas en especimenes médicos:

Centros de Control de Enfermedades. Recommendations for prevention of HIV

transmission in health-care settings. . Morbidity and Mortality Weekly Report
(MMWR), 1987;36(2S) :3S-18S.

Miller BM, Groschel DHM, Richardson JH, et al., editores. Laboratory safety:
principles and practices. Washington, DC: American Society for Microbiology,
1986:372.

National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of laboratory

workers from infectious disease transmitted by blood and tissue; proposed
guideline. Villanova, PA: NCCLS, 1987; NCCLS Documento M29-P.

Richardson JH, Barkley WE, editores. Biosafety in microbiological and

biomedical laboratories. 1s ed. Atlanta, GA: Centros de Control de
Enfermedades-Institutos Nacionales de Salud, PHS, HHS, 1984; HHS
publicación no. (CDC) 86-8395.

** No se ofrecen en la versión del libro de trabajo en CD-ROM.

3
 Cryptosporidium:

MORFOLOGÍA Y DETECCIÓN

El diagnóstico de laboratorio de cryptosporidiosis usualmente requiere de un

mayor esfuerzo que para otros parásitos intestinales. El oocisto, que es la etapa
diagnóstica en coccidias, son muy pequeños e incoloros y no se detectan
fácilmente en los exámenes de rutina. Muy frecuentemente, se requiere de
procedimientos especiales (un examen microscópico meticuloso en un aumento
mayor o técnicas de tinción diferentes), para hacer una identificación positiva de
estos oocistos tan pequeños. Este programa de auto-aprendizaje provee
instrucciones y prácticas para obtener la experiencia visual para detectar desde un
número reducido, hasta un gran número de oocistos en un espécimen dado,
además de que provee los protocolos e instrucciones para las tinciones
especiales‡.

Usted debería ahora ESTUDIAR ahora la información en las siguientes páginas

sobre la morfología y la detección de oocistos. Una vez que tenga una imagen
mental clara de cómo se ven los oocistos y en qué especimenes es más factible
que los encuentre, vaya a la siguiente sección del libro de trabajo y siga las
instrucciones y PRACTIQUE, PRACTIQUE, PRACTIQUE. A través de la
PRÁCTICA usted será competente y obtendrá la confianza para detectar
eficientemente oocistos en muestras fecales.

‡
Muchos procedimientos publicados se utilizan para la recuperación y detección
de oocistos. Aquellos que se escogieron aquí, parecen ser los más exitosos y
más económicos para la mayoría de los laboratorios.

4
MORFOLOGÍA DEL OOCISTO:

Su rango de tamaño es de 4-6 µm; la mayoría son de 5-6 µm.

Su forma es usualmente esférica, rara vez oval.

Es inmóvil.

La pared del oocisto es muy delgada y de apariencia delicada.

Los oocistos maduros contienen 4 esporozoítos “desnudos” (no presenta

esporoquistes) y un solo cuerpo “residual”obscuro. Los esporozoítos
son altamente refráctiles a la luz.

Variaciones que se observan en el microscopio óptico de

campo claro:

En infecciones agudas, se excreta frecuentemente un

número grande de lo que parecen oocistos inmaduros.
Estas formas presentan las características descritas
arriba con la excepción que los esporozoítos individuales
no se observan. En cambio, el material que da lugar a
los esporozoítos se observa sin división y se sujeta a la
pared del oocistos, dando la impresión de una “dona” o
“media luna” pequeña y muy refráctil. Los cuerpos
residuales son generalmente grandes y visibles en estas
formas. La pared del oocisto se puede ver pero es muy
delgada y frecuentemente se colapsa unilateralmente.

En infecciones que se están resolviendo y en infecciones

crónicas, los oocistos presentan una morfología típica,
sin embargo no todos los esporozoítos son visibles en
los oocistos. Además de que generalmente hay un
número significativamente menor de oocistos presentes.

Apariencia de los oocistos en diferentes tipos de preparaciones:

SOLUCIÓN SALINA: La morfología es como se describe anteriormente. La

característica más notable es que a un aumento de 400 X los oocistos son más
refráctiles que las estructuras similares en tamaño y forma que la rodean.

En aumento con el objetivo 1000 X con aceite de inmersión, se observan

muchas, aunque no todas, de las estructuras antes descritas. Con una
observación cuidadosa, los oocistos se pueden diferenciar de levaduras
comunes con base a la forma, grosor de la pared celular, y la apariencia de los
contenidos internos. Las levaduras son ovales, con pared celular gruesa y su
citoplasma está lleno de gránulos oscuros.

5
SOLUCIÓN DE LUGOL DE DOBELL Y O'CONNER: Los oocistos típicamente no
se tiñen con lugol, pero permanecen claros y muy refráctiles a la luz, aún cuando
se les deje en la solución por un largo período. Las levaduras rápidamente se
tiñen de un color café-amarillento y por lo tanto se distinguen fácilmente de los
oocistos. Generalmente el aumento 400 X es suficiente para ver la diferencia.

NOTA 1: Una levadura degenerada (levadura "fantasma") consiste en una

pared celular gruesa y escaso contenido interno que no acepta la
tinción de lugol. El examen en aumento de 1000 X mostrará una
pared gruesa en la levadura sin teñir.

NOTA 2: Algunos oocistos atípicamente aceptarán la tinción de lugol en un

tiempo relativamente corto; algunos la aceptan en pocos minutos
después del contacto. La causa es desconocida, por lo que los
especimenes deben examinarse tan pronto se sometan a la
solución de lugol.

TINCIÓN TRICRÓMICA: Los oocistos generalmente no se tiñen con tinción

tricrómica y aparecen como “huecos” en el fondo fecal. Sin embargo,
ocasionalmente algunas cepas de oocistos adquieren un color de rosa a rojo
pero NO SE RECOMIENDA EL USO DE TINCIÓN TRICRÓMICA PARA EL
DIAGNÓSTICO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium.

TINCIÓN ÁCIDO-RESISTENTE MODIFICADA DE KINYOUN: Los oocistos de

Cryptosporidium son alcohol ácido-resistentes y adquieren un color rojo-oscuro
con la tinción. La mayoría se observan como bolas, pequeñas y sólidas.
Algunas veces, solo los esporozoítos dentro del oocistos maduro retienen la
tinción y por lo tanto aparecen como cuatro pequeñas salchichas juntas. El
encontrar estas formas que contienen esporozoítos confirma que estas
estructuras son oocistos. Muchas levaduras y otras estructuras adquieren la
coloración de la tinción de contraste, generalmente verde o azul.

TINCIÓN ÁCIDO-RESISTENTE DE AURAMINA O: Esta es una tinción

fluorescente y requiere de un microscopio de fluorescencia. Aquí los oocistos
ácido-resistentes adquieren un color naranja-amarillento brillante y se observan
como un cuerno sólido o con apariencia de cráter. Algunas veces se pueden
observar esporozoítos individuales. Los materiales que no son ácido-resistentes
o parcialmente ácido-resistentes fluorescentes adquieren un color pálido. La
mayoría de las levaduras no se tiñen.

6
7
DETECCIÓN DE OOCISTOS:

Tipos de heces:

Recuerde que las heces están clasificadas con base a la consistencia:

FORMADA SUAVE SUELTA ACUOSA

En cryptosporidiosis aguda (frecuente en niños inmunocomprometidos), por lo

general en cuanto más líquida sea la evacuación, mayor número de oocistos.
Frecuentemente las evacuaciones acuosas y sueltas que contienen un gran
número de oocistos son de color claro, (ej. amarillo pálido, café o verde) y se ven
homogéneas. Las heces suaves usualmente contienen menos oocistos. Las
heces formadas contienen muy pocos oocistos.

En infecciones crónicas (usualmente en personas inmunocomprometidas, como

las que tienen síndrome de inmunodeficiencia adquirida), los oocistos presentan
un rango de muchos a escasos, aún en heces líquidas. Todas las muestras de
heces de personas que se sabe o se sospecha estén inmunocomprometidas
deben examinarse para oocistos de Cryptosporidium.

Sistema sugerido para recuperar y detectar oocistos:

Los oocistos se pueden recuperar de heces frescas sin conservantes o de heces

conservadas con formol neutral buferada al 10% (es importante que esté
buferada para una concentración de oocistos efectiva), fijador MIF, fijador SAF, o
fijador PVA.

Puesto que la preservación con formol permite que los oocistos se tiñan mejor
con el lugol o las tinciones ácido-resistentes, se recomienda su uso de rutina.
Además, puesto que los oocistos de Cryptosporidium son infecciosos al ser
excretados, la preservación con formol antes del examen probablemente reduce
la posibilidad de transmisión de la infección. Todas las muestras de heces del
programa de estudio están conservadas en formol neutral buferado al 10%.

Cuando se reciben especimenes con la solicitud de un examen de rutina para

parásitos, el primer paso es determinar la consistencia de las heces cuando se
eliminan. Si el espécimen no está conservado, esto se hace fácilmente al ver las
heces y compararlas con las imágenes arriba. Si el espécimen está conservado,
el envase o la solicitud deben estar marcados con la consistencia original de la
muestra. Aunque el saber cuál es la consistencia de la muestra no es imperativo
para el examen, aumenta la eficacia del trabajo. No es necesario y es poco
práctico realizar un procedimiento especial para cada espécimen. Como se
explicó anteriormente, la cantidad de oocistos que se pueden obtener de una
muestra formada es muy escasa.

8
Como rutina, todos los especimenes sin formar o acuosos, y aquellas personas
que son o se sospecha que están inmunocomprometidas, deben ser revisados
para oocistos de Cryptosporidium. Así mismo, todos los especimenes con una
solicitud especial para Cryptosporidium, se deben examinar, sin importar la
consistencia de las heces.

La experiencia de aquellos que hacen los exámenes determinarán hasta que

grado y cómo se van a analizar estos especimenes. Algunos laboratorios revisan
visualmente con lugol todos los especimenes candidatos y usan tinción (es)
ácido-resistente(s) para confirmar aquellos especimenes sospechosos y/o para
tener un registro permanente de los especimenes positivos. Otros laboratorios
realizan como rutina la tinción ácido-resistente en todos los especimenes. Esto,
por supuesto, requiere más tiempo y energía pero reduce la probabilidad de
perder aquellos especimenes con pocos oocistos. Cada laboratorio debe
evaluar sus propias capacidades y recursos, y es usualmente la población de
pacientes la que decide cuál es el sistema más apropiado.

Sin importar el sistema de detección que ha seleccionado el laboratorio, todos

los especimenes deben ser concentrados antes de ser examinados al
microscopio. Aunque hay técnicas especiales para concentrar oocistos, se ha
demostrado que la técnica mas popular para concentrar muestras fecales para
parásitos es la de la formalina-acetato de etilo (FAE), que también concentra
oocistos de Cryptosporidium. Por eso, la formalina-acetato de etilo, es la técnica
que recomendamos y utilizamos en este programa de estudio.

Después de la concentración, el sedimento resultante puede ser examinado por

una, dos o una combinación de tres diferentes técnicas. Estas son:

1. Examen microscopio meticuloso con un gran aumento, usando la

solución de lugol de Dobell and O'Conner.
2. Tinción ácido-resistente modificada de Kinyoun.
3. Tinción ácido-resistente de auramina O.

Cada técnica es más útil que otras en determinadas circunstancias.

Para crear una rutina, por ej. el examen con lugol para heces sueltas o acuosas,
es el método más fácil y económico, pero requiere de una gran experiencia y no
es tan sensible como otros. Si la experiencia de los técnicos de laboratorio es
limitada, deberán realizar la tinción ácido-resistente en estos especimenes para
poder detectar de pocos a escasos oocistos. Para otros especimenes, que no
estén en el examen de rutina, se requiere la tinción ácido-resistente. La tinción
modificada de Kinyoun es fácil y deja un registro permanente, pero no es tan
confiable como la tinción de auramina O para teñir oocistos. Además es más
difícil detectar a los oocistos cuando son escasos en preparaciones con Kinyoun
que con auramina O.

9
Auramina O es una prueba bastante sensible y fácil de hacer, pero se requiere
de microscopio de fluorescencia para examinar las muestras, y a veces hay
restos pequeños que se parecen a los oocistos. Para disminuir el riesgo de
confundir los restos con oocistos, el técnico de laboratorio debe revisar, por otro
método cualquier espécimen que tenga de pocas a escasas “estructuras
parecidas” a los oocistos que no presenten esporozoítos internos. La otra
técnica debe evidenciar suficientes características de los oocistos para permitir
una identificación positiva.

EL PRACTICAR CADA TÉCNICA LE AYUDARÁ A DECIDIR CUAL UTILIZAR

EN SU LABORATORIO, ASÍ QUE PASE A LA SIGUIENTE SECCIÓN DEL
PROGRAMA DE ESTUDIO Y PRACTIQUE, PRACTIQUE, PRACTIQUE.

**Nota: Este ejercicio de auto-aprendizaje se publicó antes del uso de la técnica

de antígenos marcados con fluoresceína para diagnosticar Cryptosporidium.

10
EJERCICIOS DE ESTUDIO

ASEGÚRESE DE TENER TODOS LOS MATERIALES Y EL EQUIPO LISTOS

PARA USARSE. NO OLVIDE LOS MATERIALES PARA EL EJERCICIO DE
CONCENTRACIÓN Y TEÑIDO.

1. Prepare las laminillas sin teñir y teñidas con lugol a partir de la muestra
positiva usando el procedimiento siguiente:

a. Identifique apropiadamente una laminilla 76 x 50 mm.

b. Utilice la pipeta Pasteur, coloque de 1/3 a 1/2 de gota (una gota

completa es mucho) de solución salina a un lado de la laminilla y una

cantidad similar de solución de lugol en el otro lado

c. Agite bien el vial con el espécimen, y usando una pipeta Pasteur

limpia, coloque de 1/3 a 1/2 de gota del testigo positivo a un lado del
diluyente.

d. Utilizando la esquina del cubreobjetos, mezcle la solución salina y

el espécimen y coloque el cubreobjetos encima de la mezcla.

e. Utilizando un segundo cubreobjetos, repita el procedimiento

anterior con el lado de lugol-espécimen.
Estas preparaciones deben ser suficientemente delgadas. Puede usted
voltear el portaobjetos hacia abajo y el cubreobjetos se mantendrá en su
lugar. Si esto no es posible inténtelo de nuevo con cantidades menores
de diluyente y espécimen.

f. Las orillas de estas preparaciones se pueden sellar con una

mezcla 1:1 de vaselina:parafina derretidas, para prevenir la desecación
durante algunas horas. El sellado también permite estabilizar el material
para ser observado con aceite de inmersión. Sin embargo, como usted
observará sus preparaciones de inmediato y éstas son delgadas el
sellado no es esencial.

11
2. Observe cuidadosamente el espécimen en lugol a un aumento de 400 X.
Durante la observación debe usted rotar el micrométrico casi
continuamente. Al hacer esto usted podrá ser capaz de ver claramente
objetos altamente refráctiles de 5 µm aproximadamente, que contrastan
con el fondo amarillo. Enfoque claramente para localizar uno, colóquelo
en el centro del campo y cambie al objetivo 100X con aceite de inmersión.
A este aumento (1000 X), usted debería poder ver los detalles internos.
Si usted puede observar una pared celular delgada, esporozoítos y
cuerpos residuales, está usted viendo oocistos de Cryptosporidium.
Compare con la fotografía de la sección anterior del libro de trabajo.
Observe varios para adquirir un rango de variabilidad.
3. Después de observar varios oocistos en las preparaciones con lugol,
observe las preparaciones con solución salina. Aunque no se detecta
fácilmente a los oocistos en solución salina, el ejercicio tiene el propósito
de obligar a que sus ojos observen la característica refracción. Cuando
domine usted la detección observando la refracción, podrá usted detectar
exitosamente oocistos en frotis directos. Asegúrese de observar a los
organismos con los aumentos 400 X y 1000 X.
4. Ahora regrese a la preparación con lugol y PRACTIQUE, PRACTIQUE,
PRACTIQUE.
5. Siguiendo las instrucciones de la página 17, realice la técnica de
concentración de formalina-acetato de etilo en un testigo positivo. Al final
del procedimiento, asegúrese de drenar todo el fluido del sedimento y
retire todos los restos de acetato de etilo de la pared del tubo. Cualquier
residuo de acetato de etilo puede hacer que el material se disperse en la
laminilla y resultar en una mala preparación. Después de quitar el fluido,
agregue 2-4 gotas de formol neutral al 10% y mezcle bien con una pipeta
Pasteur limpia. Para prevenir la evaporación tape el tubo. Finalmente,
prepare las preparaciones con solución salina y lugol y observe los
oocistos al microscopio bajo los aumentos 400 X y1000 X. Note que se
observa un mayor número de oocistos por campo que en el frotis directo
del espécimen; la técnica de formalina-acetato de etilo concentra los
organismos.
6. Usando el mismo sedimento para la técnica de formalina-acetato de etilo,
realice cualquiera de las técnicas de tinción ácido-resistente descritas en
las páginas 18 y 21. Usted seleccionará la técnica (s) apropiada (s) para
su laboratorio. Compare los oocistos teñidos con las imágenes de la
página 7.
7. Cuando complete los ejercicios de arriba y sienta confianza en la
detección de oocistos, pruebe los cinco especimenes “desconocidos” que
se le dieron en el paquete de estudio. Use la técnica, o una combinación
de técnicas que utilizará posteriormente en su laboratorio.
8. Registre los resultados de cada espécimen en la parte posterior del libro
de trabajo. Por favor siga las instrucciones descritas en la forma de la
cuantificación de organismos; también siga las instrucciones en el
formulario provisto en cuanto al doblado y envío por correo con la
dirección incluida.
12
El completar exitosamente el programa de estudio, por ejemplo cuatro de los
cinco especimenes “desconocidos” correctos, le otorga 0.6 unidades CDC de
ŧ
educación continua

ŧ
No se aplica para la versión en CD de este libro de trabajo.

13
 TÉCNICAS Y REFERENCIAS

I. Preparación de la solución de lugol de Dobell y O'Connor

Prepare mensualmente una cantidad fresca:

Yodo (cristales en polvo) 1 gm

Yoduro de potasio 2 gm
Agua destilada 100 ml

Disuelva el yoduro de potasio en agua. Agregue los cristales de yodo y agite

cuidadosamente. Puede ser que los cristales no se disuelvan
completamente, la solución deberá adquirir un color café-rojizo o de té fuerte.
Decante en una botella ámbar con gotero u otro tipo de botella ámbar.

Ya que la mayoría de los laboratorios no utilizan toda la solución en un mes,

se sugiere el siguiente procedimiento.

1. Prepare 500 ml de yoduro de potasio al 2% (10 g en 500 ml de agua

destilada).
2. Guarde la solución base de yoduro de potasio en una botella ámbar con
tapón de vidrio. Se mantendrá por varios meses.

Vierta una pequeña cantidad (20-30 ml) en un matraz o vaso de precipitado y

agregue cristales de yodo (aproximadamente 0.2-0.3 g; la cantidad exacta no
es importante) agite hasta que la solución adquiera el color apropiado.
Renuévela cada mes.

II. Preparación de formol neutral buferado al 10%

La preparación comercial de formaldehído tiene aproximadamente una

concentración de 40% por volumen, lo que significa que 10% de formol es cerca
de 4% de formaldehído.

Na2HPO4 6.10 g
NaH2PO4 0.15 g
Formaldehído 800 .0 ml
Agua (de la llave o destilada) 7,200.0 ml

Mezcle el formaldehído y el agua. Agregue las sales buferadas y mezcle bien.

Se hacen 8 litros de formol neutral al 10%. Ésta solución se mantiene
indefinidamente.

14
III. Técnica de concentración de formol-acetato de etilo

A. Materiales y soluciones necesarios:

1. Vasos de papel pequeños (100 a 120 ml) (PARA ESPECIMENES
FRESCOS SOLAMENTE)
2. Aplicadores de madera
3. Copas de papel cónicas con el ápice cortado ó embudos pequeños
4. Gasa o tela de cedazo del #50
5. Tubos para centrífuga (15 ml, vidrio o polipropileno)
6. Tapones para tubos de centrífuga
7. Centrífuga
8. Pizetas para agua y formalina-acetato de etilo. La botella de
acetato de etilo requiere un tapón.
9. Reloj o cronómetro
10. Hisopos de algodón (no estériles)
11. Pipetas Pasteur con bulbos
12. Laminillas de vidrio para microscopio de 76 x 50 mm
13. Cubreobjetos de grosor #1, 22 x 22 mm
14. Agua de la llave
15. Acetato de etilo, grado certificado
16. Formol neutral buferado al 10%. Ver la fórmula de preparación en
la página 14.

B. Técnica para especimenes en fresco

1. Mezcle bien una porción de las heces del tamaño aproximado de
una canica con agua suficiente para hacer una suspensión de tal
manera que 10 ml de ésta resulte en un ml de sedimento posterior
a la centrifugación. La suspensión se puede preparar en un vaso
pequeño de papel.
2. Pase por el colador aproximadamente 9 ml de la suspensión a
través del pequeño embudo con dos capas simples de gasa o una
capa de cedazo. Para conservar materiales de vidrio, se puede
sustituir el embudo con un vaso cónico de papel sin ápice.
3. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Decante el sobrenadante.
Debe quedar un 1 ml de sedimento. Si la cantidad es mucho
mayor o mucho menor, ajuste a la cantidad adecuada con los
siguientes métodos:
a. Cantidad excesiva.

Resuspenda el sedimento en agua y elimine una porción. Por

ejemplo, si la cantidad es el doble de la deseada, elimine la mitad
de la suspensión. Agregue agua para tener un nivel de fluido de 10
ml y centrifugue nuevamente.

15
b. Cantidad escasa.
Vierta el sobrenadante y cuele una segunda porción de la
suspensión original de heces en el tubo. La cantidad por colar
puede determinarse por el sedimento, si es aproximadamente la
mitad de lo necesario, cuele otros 10 ml en el tubo. Centrifugue
nuevamente.
No es necesario tener la cantidad exacta de sedimento en el tubo,
pero la cantidad debe ser aproximada a lo indicado anteriormente.
Si la cantidad de sedimento es demasiada o muy poca puede
resultar en una concentración ineficiente.
4. Resuspenda el sedimento en agua fresca, centrifugue, y decante
como antes.
5. Agregue 9 ml de formol neutral al 10% al sedimento, mezcle bien, y
permita que repose por 5 minutos o más. En este punto, la mezcla
debe ser cerrada y guardarse hasta más tarde.
6. Agregue 4 ml de acetato de etilo, tape el tubo y mezcle
vigorosamente cuando menos por 30 segundos, manteniendo el
tubo invertido. Retire el tapón cuidadosamente.
7. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Se obtendrán cuatro capas:
(1) capa de acetato de etilo, (2) tapón de deshechos, (3) capa de
formol, y (4) sedimento.
8. Libere el tapón de deshecho desde los lados del tubo introduciendo
un aplicador y decante las tres capas superiores. Antes de regresar
el tubo a la posición vertical, utilice un hisopo para limpiar los
desechos y trazas de acetato de etilo de las paredes del tubo para
evitar que se sedimenten. La presencia de acetato de etilo en el
sedimento final puede causar problemas para elaborar un frotis
directo adecuado.
9. Con una pipeta, agregue el doble de la cantidad de formol neutral
al 10% que la cantidad final de sedimento. Por ejemplo, si se tiene
0.2 ml de sedimento final, agregue 0.4 ml de formol. Tenga
cuidado de no agregar mucho, de lo contrario el espécimen estará
muy diluido como para hacer una preparación satisfactoria.
Una vez agregado el formol, el tubo se debe tapar y se puede
guardar por algún tiempo (meses). Desde luego que no se debe
permitir que el sedimento se seque.

16
 10. Con una pipeta Pasteur, mezcle el sedimento y el formol y haga
las preparaciones con lugol y frotis sin teñir como acostumbre
para su examen microscópico.

C. Técnica para conservar especimenes en formol

1. Mezcle bien o revuelva el espécimen en formol.
2. De acuerdo a la densidad del espécimen, cuele una cantidad
suficiente a través de dos capas de gasa simple o una capa de
cedazo obtenga en un tubo de centrifuga la cantidad adecuada
de sedimento como se indica abajo. Usualmente es suficiente de
2 a 3 ml de heces a no ser que la suspensión esté muy diluida.
3. Agregue agua de la llave hasta tener 9 ml de suspensión, mezcle
bien, y centrifugue a 500 x g por 10 minutos.
4. Decante el sobrenadante. La cantidad de sedimento debe ser
aproximadamente de 0.5 ml. Si la cantidad es poca o mucha,
ajuste la cantidad siguiendo el mismo método descrito en el paso
3 para especimenes frescos. En aquellos especimenes
conservados en formol estos se han aclarado en algún grado, y
aclararán más principalmente por el acetato de etilo. De tal
manera que la reducción del sedimento es menor que en heces
frescas y la cantidad inicial debe ser menor.
5. Agregue 9 ml de 10% formol neutral al sedimento y mezcle bien.
6. Agregue 4 ml de acetato de etilo, tape el tubo, mezcle en
posición invertida por 30 segundos. Retire el tapón
cuidadosamente.
7. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Se obtendrán 4 capas.
Ver la descripción en el paso 7 para especimenes frescos.
8. Libere el tapón de deshechos de los lados del tubo por medio de
un aplicador y decante cuidadosamente las tres capas
superiores. Antes de regresar el tubo a la posición vertical, utilice
el hisopo para limpiar los desechos y todos los restos de acetato
de etilo de las paredes del tubo para prevenir que se sedimente.
La presencia de acetato de etilo en el sedimento final puede
causar problemas para elaborar un frotis directo adecuado.

17
 9. Con una pipeta, agregue el doble de la cantidad de formol neutral
al 10% que la cantidad final de sedimento. Por ejemplo, si se
tiene 0.2 ml de sedimento final, agregue 0.4 ml de formol. Tenga
cuidado de no agregar mucho, de lo contrario el espécimen
estará muy diluido como para hacer una preparación
satisfactoria.

Una vez agregado el formol, el tubo se debe tapar y se puede

guardar por algún tiempo (meses). Desde luego que no se debe
permitir que el sedimento se seque.

10. Con una pipeta Pasteur, mezcle el sedimento y el formol y haga

las preparaciones con lugol y frotis sin teñir como acostumbre
para su examen microscópico. Ver la página 11.

IV. Tinción ácido-resistente modificada de Kinyoun para oocistos

Cryptosporidium* en muestras de heces

Las tinciones ácido-resistentes son útiles para distinguir los oocistos de

Cryptosporidium de otros organismos que se encuentran en las heces,
particularmente levaduras. Los oocistos son ácido-resistentes y retienen el color
rojo de la tinción de carbol-fucsina después de la decoloración ácida. Puesto que
muchas levaduras no son ácido-resistentes, se decoloran al someterlas al
decolorante ácido, por lo que adquieren la tinción de contraste.
La técnica que se presenta aquí es un método modificado en frío adaptado por
Marilyn S. Bartlett, del Departamento de Microbiología/Patología del Centro
Médico de la Universidad de Indiana, basado en la tinción ácido-resistente de
Kinyoun modificada para Nocardia.
*Esta técnica puede utilizarse también para teñir oocistos de Isospora belli

A. Materiales y soluciones necesarias:

1. Laminillas de vidrio, 76 x 26 mm
2. Pipetas Pasteur con bulbos
3. Vasos de Coplin, con capacidad de 50 ml
4. Pinzas para manipular las laminillas
5. Reloj o cronómetro
6. Papel secador
7. Medio para montar laminillas
8. Cubreobjetos, de espesor #1, 22 x 22 mm
9. Microscopio (descripción en la página 1)
10. Agua corriente de la llave (chorro suave)
11. Alcohol metílico absoluto

18
12. Tinción ácido-resistente: Carbol-fucsina modificada Kinyoun

a. Tinción comercial: Carbol-fucsina modificada Kinyoun

Fórmula, EMDS/Harleco #7645X
b. Preparación:

Fucsina básica, índice de color No.42510 4g

Alcohol etílico, 95% 20 ml
Fenol, líquido 8 ml
Agua destilada 100 ml

Se coloca el colorante de fucsina básica en un matraz Erlenmeyer

de 500 a 1,000 ml. Se agrega el alcohol lentamente, mezclando
constantemente para disolver el polvo. (La fucsina básica tiende a
“hervir” cuando se agrega el alcohol; es importante agregar el
alcohol lentamente y mezclar constantemente.)

Agregar el fenol y el agua a la solución colorante. Mezcle bien.

Guarde en una botella con tapa de rosca.

13. 50% Alcohol etílico

Alcohol etílico 50 ml
Agua destilada 45 ml

Mezcle bien. Guarde en una botella de vidrio con tapón de vidrio.

14. Decolorante ácido

Ácido sulfúrico, concentrado 10 ml

Alcohol etílico, 95% 90 ml

Mezcle el ácido con el alcohol. Guarde en una botella de vidrio con

tapón de vidrio.

15. Tinción de contraste: Verde malaquita

Verde malaquita, índice de color No. 42000. 3g

Agua destilada 100 ml

Disuelva el colorante en agua. Guarde en una botella de vidrio con

tapón de vidrio.

19
 B. Técnica:
1. Haga un frotis delgado de una muestra de heces en una laminilla
de 76 x 26 mm. El frotis puede hacerse de heces frescas, sin
conservar o de heces conservadas con formol neutral al 5% o
10%. Los frotis hechos del sedimento después de la
concentración de formalina-acetato de etilo puede dar un buen
número de oocistos.
2. Deje secar el frotis al aire a temperatura ambiente, o puede
acelerar el proceso de secado incubando a 37-42 °C.
3. Fije el frotis con alcohol metílico absoluto por 30 segundos.
Mantenga la laminilla inclinada, utilizando una pizeta o gotero,
permita que el alcohol bañe la laminilla, O sumerja la laminilla en
un vaso de Coplin con alcohol metílico. Permita secar.
4. Coloque la laminilla en la tinción de carbol-fucsina (en vaso de
Coplin) por 5 minutos a temperatura ambiente.
5. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave.
6. Enjuague con alcohol etílico al 50% alcohol etílico (en vaso de
Coplin) por 5 segundos agitando suavemente.
7. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave.
8. Decolore con alcohol H2SO4 al 10% (en vaso de Coplin) por 1-2
minutos. Ajuste el tiempo dependiendo del grosor del frotis.
9. Enjuague en agua corriente de la llave.
10. Sumerja la laminilla en la tinción de verde malaquita por 2
minutos.
11. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave.
12. Seque perfectamente limpiando la parte de atrás de la laminilla y
suavemente golpeando el frente.
13. Cubra con el cubreobjetos del #1 utilizando un medio para montar
adecuado.
14. Examine con el microscopio de campo brillante en aumento de
400 X y 1000 X.

Los oocistos de Cryptosporidium se tiñen de rojo. A veces se pueden observar

esporozoítos individuales teñidos de rosa a rojo dentro de la pared del oocisto o
en grupos de cuatro sin una pared del oocisto.

Los oocistos de Isospora belli también se tiñen, pero no por completo. La masa
germinal dentro del oocisto se tiñe de rojo y aunque la pared no se tiñe, a veces
se precipita la tinción alrededor, delineando la estructura total. Frecuentemente,
la pared del oocisto se colapsa, pero en presencia de otros oocistos, el parásito
todavía se puede reconocer.

20
V. Tinción ácido-resistente de Auramina O para oocistos de
Cryptosporidium* en heces.

Desde la demostración de que los oocistos de Cryptosporidium son

naturalmente ácido-resistentes, se ha utilizado una variedad de tinciones ácido-
resistentes para distinguir las coccidias de levaduras, otros protozoarios y la
materia fecal normal. Ésta técnica emplea auramina O, un tinte utilizado para
tinción general y procedimientos de microscopía fluorescente. Esta es una
auténtica tinción ácido-resistente y no se debe confundir con el procedimiento de
anticuerpos fluorescentes (FA). Es una adaptación del procedimiento de
auramina O utilizado para detectar Mycobacterium spp. en algunos laboratorios
clínicos.
*Esta técnica también es efectiva para teñir oocistos de Isospora belli.

A. Materiales y soluciones necesarias:

1. Laminillas de vidrio para microscopio, 76 x 26 mm
2. Pipetas Pasteur con bulbos
3. Platina caliente eléctrica a 65 °C (PARA ESPECIMENES FRESCOS)
4. Incubadora a 37-42 °C (PARA ESPECIMENES EN FORMOL)
5. Tren de tinción
6. Pinzas para manipular laminillas.
7. Reloj o cronómetro
8. Microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación BG-12 y un
filtro de barrera OG-l, o un sistema equivalente.
9. Agua de la llave
10. Alcohol metílico absoluto
11. Tinción ácido-resistente
Auramina O, índice de color No. 41000 0.1 g
Alcohol etílico, 95% 10.0 ml
Fenol, cristales 3.0 gm
Agua destilada 87.0 ml
Disuelva la auramina O en alcohol etílico. Disuelva los cristales de fenol en
agua. Mezcle las dos soluciones juntas. Guarde en una botella oscura.

1. Decolorante ácido
Ácido hidroclorhídrico, concentrado 0.5 ml
Alcohol etílico 70% 100.0 ml
Agregue con cuidado el ácido al alcohol.
2. Tinción de contraste
Permanganato de potasio 0.5 g
Agua destilada 100.0 ml
Disuelva el permanganato de potasio en agua.

21
 B. Técnica:

1. Prepare un frotis delgado de la muestra fecal en una laminilla 76 x

26 mm. El frotis se puede hacer a partir de heces frescas, sin
conservar o de heces en 5% y10% de formol neutral. Los frotis
hechos del sedimento después de la concentración de formalina-
acetato de etilo puede dar un buen número de oocistos. Los frotis
hechos de muestras de heces sin conservar se deben fijar con calor
por lo menos una hora a 65 °C en la platina caliente. Los frotis
conservados con formol pueden fijarse con calor a 37-42 °C hasta
que el frotis se seca o puede ser secado al aire por 2-3 horas.
2. Fije todos los frotis con alcohol metílico absoluto por 30 segundos.
Deje secar.
3. Coloque la laminilla en el tren de tinción e inunde con auramina O
por 15-20 minutos a temperatura ambiente. Asegúrese que la tinción
cubra el frotis.
4. Enjuague con agua y elimine el exceso de agua.
5. Cubra el frotis con alcohol ácido y decolore por 2 minutos.
6. Enjuague con agua y elimine el exceso de agua.
7. Inunde la laminilla con la tinción de contraste, permanganato de
potasio por 2 minutos.
8. Enjuague el frotis, elimine el exceso de agua y seque al aire.
9. Examine el frotis en el microscopio de fluorescencia observando
detalladamente con el objetivo 20-25 X y observe críticamente con
el objetivo 40-63 X.

Los oocistos de Cryptosporidium se tiñen de naranja-amarillento, donde los

materiales que no son ácido-resistentes o son parcialmente ácido-resistentes se
observan pálidos, con un color menos brillante.

Los oocistos de Isospora belli se tiñen de manera parecida a los oocistos de

Cryptosporidium en cuanto a color e intensidad, pero desde luego, muestran su
morfología típica de la especie en relación con el tamaño, forma y contenidos
internos.

22
VI. Bibliografía

Angus KW. Cryptosporidiosis in man, domestic animals and birds: a review. J R

Soc Med. 1983; 76:62-70.

Ash LR, Orihel TC. Parasites: a guide to laboratory procedures and identification.
1a ed. Chicago: Prensa ASCP, 1987:328.

Baxby D, Blundell N. Sensitive, rapid, simple methods for detecting

Cryptosporidium in faeces. Lancet. 1983;ii:1149.

Bogaerts J, Lepage P, Rouvroy D, et al. Cryptosporidium spp., a frequent cause

of diarrhea in Central Africa. 1984;20:874-6.

Bronsdon MA. Rapid Dimethyl Sulfoxide-modified acid-fast stain of

Cryptosporidium oocysts in stool specimens. J Clin Microbiol. 1984;19:952-3.

Brooke MM, Melvin DM. Morphology of diagnostic stages of intestinal parasites

of humans. 2a ed. Atlanta, Georgia: Centros de Control de Enfermedades, 1984;
DHHS publicación No. (CDC)84-8116.

Brooke MM, Melvin DM, Healy GR. Common intestinal protozoa of humans: life
cycle charts. 2a ed. Atlanta, Georgia: Centros de Control de Enfermedades,
1983.

Campbell PN, Current WL. Demonstration of serum antibodies to

Cryptosporidium sp. in normal and immunodeficient humans with confirmed
infections. J Clin Microbiol. 1983;18:165-9.

Casemore DP, Armstrong M, Sands RL. Laboratory diagnosis of

cryptosporidiosis. J Clin Pathol. 1985;38:1337-41.

Casemore DP, Sands RL, Curry A. Cryptosporidium species: a "new" human

pathogen. J Clin Pathol. 1985; 38:1321-36.

Current WL, Reese NC, Ernst JC, et al. Human cryptosporidiosis in

immunocompetent and immunodeficient persons: studies of an outbreak and
experimental transmission. N Engl J Med. 1983;308:1252-7.

DeHovitz JA, Pape JW, Boncy M, et al. Clinical manifestations and therapy of
Isospora belli infection in patients with the acquired immunodeficiency syndrome.
N Engl J Med. 1986;315:87-90.

23
Garcia LS, Brewer TC, Bruckner DA. Fluorescence detection of Cryptosporidium
oocysts in human fecal specimens by using monoclonal antibodies. J Clin
Microbiol. 1987;25:119-21.

Garcia LS, Bruckner DA. Parasitic infection and the compromised host. Diagn
Med. 1984;7:23-35.

Garcia LS, Bruckner DA, Brewer TC, et al. Techniques for the recovery and
identification of Cryptosporidium oocysts from stool specimens. J Clin Microbiol.
1983;18:185-90.

Garza D, Marino B, Wilson M. Cryptosporidiosis: a diagnostic protocol. Lab Med.

1985;16:105-6.

Garza D. Diarrhea caused by a coccidian parasite, Cryptosporidium. Lab Med.

1983;14:283-6.

Hojlyng N, Molbak K, Jepsen S Cryptosporidium spp., a frequent cause of

diarrhea in Liberian children. J Clin Microbiol. 1986;23:1109-13.

Ma P, Soave R. Three-step stool examination for cryptosporidiosis in 10

homosexual men with protracted watery diarrhea. J Infect Dis. 1083;147:824-8.

McNabb SJN, Hensel DM, Welch DF, et al. Comparison of sedimentation and
flotation techniques for identification of Cryptosporidium sp. oocysts in a large
outbreak of human diarrhea. J Clin Microbiol. 1985;22:587-9.

Melvin DM, Brooke MM. Laboratory procedures for the diagnosis of intestinal
parasites. 3a ed. Atlanta, Georgia: Centros de Control de Enfermedades, 1982;
DHHS publicación No. (CDC)82-8282.

Miller RA, Wasserheit IN, Kirihara J, et al. Detection of Cryptosporidium oocysts

in sputum during screening for mycobacteria. J Clin Microbiol. 1984;20:1192-3.

Navin TR, Juranek DD. Cryptosporidiosis: clinical, epidemiologic, and

parasitologic review. Rev Infect Dis. 1984;6:313-27.

Ng E, Markell EK, Fleming RL, et al. Demonstration of Isospora belli by acid-fast

stain in a patient with acquired immune deficiency syndrome. J Clin Microbiol.
1984;20:384-6.

Peters CS, Sable R, Janda WM, et al. Prevalence of enteric parasites in

homosexual patients attending an outpatient clinic. J Clin Microbiol. 1986;24:684-
5.

24
Ratnam S, Paddock J, McDonald E, et al. Occurrence of Cryptosporidium
oocysts in fecal samples submitted for routine microbiological examination. J Clin
Microbiol. 1985;22:402-4.

Sheather Al. The detection of intestinal protozoa and mange parasites by a

flotation technique. J Comp Pathol. 1923;36:266-75.

Stehr-Green JK, McCaig L, Remsen HM, et al. Shedding of oocysts in

immunocompetent individuals infected with Cryptosporidium. Am J Trop Med
Hyg. 1987;36:338-42.

Sterling CR, Arrowood MJ. Detection of Cryptosporidium sp. infections using a

direct immunofluorescent assay. Pediatr Infect Dis. 1986;5:S139-42.

Stibbs HH, Ongerth JE. Immunofluorescence detection of Cryptosporidium

oocysts in fecal smears. 1986;24:517-21.

Strong BE, Kubica GP. Isolation and identification of Mycobacterium

tuberculosis: a guide for the level II laboratory. 1a ed. Atlanta, Georgia: Centros
de Control de Enfermedades, 1981; DHHS publicación No. (CDC) 81-8390.

Truant AL, Elliot SH, Kelly MT, et al. Comparison of formalin-ethyl ether
sedimentation, formalin-ethyl acetate sedimentation, and zinc sulfate flotation
techniques for detection of intestinal parasites. J Clin Microbiol. 1981;13:882-4.

Tzipori S. Cryptosporidiosis in animals and humans. Microbiol Rev. 1983;47:84-

96.

Tzipori S. Cryptosporidium: Notes on epidemiology and pathogenesis. Parasitol

Today. 1985;1:159-65.

Waldman E, Tzipori S, Forsyth JRL. Separation of Cryptosporidium species

oocysts from feces by using a percoll discontinuous density gradient. J Clin
Microbiol. 1986;23:199-200.

Young KH, Bullock SL, Melvin DM, et al. Ethyl acetate as a substitute for diethyl
ether in the formalin-ether sedimentation procedure. J Clin Microbiol.
1979;10:852-3.

25
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS
INTESTINAL

ACTUALIZACIÓN – ENERO 1991*

*Actualización de la versión impresa original de 2001.

 ACERCA DEL ORGANISMO

1. Desde que se imprimió éste libro de trabajo, la especie denominada parvum

ha sido aceptada en su generalidad para identificar al Cryptosporidium
recuperado de humano, ej. Cryptosporidium parvum.
2. Se agregó el diagrama del ciclo biológico de Cryptosporidium. Las
siguientes definiciones pueden ayudar a la comprensión del ciclo:

a. Oocistos- es el organismo enquistado producto de la fertilización del

macrogameto y microgameto.
b. Esporozoíto- es un organismo delgado, en forma de huso que es el estadio
infectante de los parásitos esporozoíto.
c. Esporogonia- la parte sexual del ciclo biológico de los parásitos
esporozoíto en donde el cigoto enquistado (oocisto) sufre múltiples
divisiones, dando lugar a los esporozoítos.
d. Esquizontes- es el estadio de desarrollo de los parásitos esporozoíto
después que el núcleo del trofozoíto se divide en varios núcleos de
tamaño menor.
e. Esquizogonia- la parte asexual del ciclo biológico que resulta de la
formación de merozoítos.
f. Merozoíto- el final del estadio de esquizogonia (reproducción asexual), que
es capaz de infectar células del mismo huésped.
g. Gametogenesis- el desarrollo de células sexuales masculinas y femeninas
o gametos.
h. Microgametocito- el gametocito macho que produce microgametos.
i. Macrogametocito- el gametocito hembra que madura en un macrogameto.
j. El cigoto es la célula que resulta de la unión de los gametos masculino y
femenino, es el huevo fertilizado.

3. La fotografía del extremo superior derecho de la página 7 no está completa.

Le estructura en la mitad superior está ligeramente hacia la derecha del
centro de este oocisto maduro, y los esporozoítos se detectan en un examen
cuidadoso. Las levaduras en gemación están en la mitad inferior ligeramente
hacia la izquierda del centro.

2
ACERCA DE LAS TÉCNICAS

1. Aunque la mayoría de las levaduras no son ácido-resistentes y toman el

color de la tinción de contraste en los procesos ácidos-resistentes, se
pueden encontrar ocasionalmente levaduras que son ácido-resistentes. Si
no se observan cuidadosamente se pueden confundir con oocistos de
Cryptosporidium parvum. Las características diferenciales entre los
oocistos de Cryptosporidium, es que estos contienen esporozoítos mientras
que las levaduras no. En las preparaciones ácido-resistentes, observe
cuidadosamente la presencia de esporozoítos (“salchichas rosadas”) en
aquellos organismos sospechosos de ser oocistos. Si encuentran
esporozoítos, aunque sean pocos en algunos oocistos, puede usted hacer
una identificación positiva de Cryptosporidium.
2. Las instrucciones para la técnica ácido-resistente indican que se debe
realizar un frotis “delgado” a partir de las heces concentradas. Un frotis
"delgado" es cuestión de juicio, generalmente significa más delgado que el
frotis directo para el examen de heces concentradas. No significa que sea
tan delgado que se cuestione si la preparación está en la laminilla. La
materia fecal debe ser visible.
3. Otras tinciones útiles para detectar oocistos de Cryptosporidium incluyen la
técnica ácido-resistente de Ziehl-Neelsen, la tinción fluorescente de
auramina-rodamina y la técnica de safranina-azul de metileno. Cualquiera
de estas se pueden utilizar además de este libro de entrenamiento, si esto
acelera el proceso de aprendizaje. Las técnicas que se presentan en el
libro de trabajo representan aquellas que son confiables, fáciles de utilizar y
económicas. Cualquiera que sea la técnica, asegúrese de que sea capaz
de detectar esporozoítos individuales en algunos de los oocistos teñidos.
4. Una prueba comercial que detecta oocistos de Cryptosporidium con
anticuerpos monoclonales/fluorescencia directa informa una sensibilidad de
100% y una especificidad de 100%. Sin embargo, se requiere de un
microscopio de fluorescencia y el costo por prueba es relativamente más
elevado que los otros métodos que se han ofrecido aquí.
5. Los oocistos de Cryptosporidium han sido recuperados de otros órganos
además de las heces como: biopsias de pulmón, esputo, vesicular biliar,
aspirado duodenal y otros especimenes directa o indirectamente asociados
con el tracto gastro-intestinal. La detección de oocistos en estos
especimenes se puede realizar utilizando técnicas similares a las que se
han ofrecido en este paquete, las instrucciones específicas para dichas
técnicas no están contempladas aquí.
6. Existen pruebas comerciales para detectar coproantígenos de oocistos de
Cryptosporidium.

3
 CICLO BIOLÓGICO de Cryptosporidium spp.

Esquizontes maduros de
Trofozoíto de segunda generación
segunda generaci ón (4 merozoítos)

A
NI
GO
ZO
UI
Merozoíto libre
Q
ES Merozoíto libre

Esq ui zont es
mad uros d e p ri mera
generaci ón con 8
merozoít os
Microgametocito

G
Macrogametocito

AM
ET
O
G
EN
ES
Microgameto
Esquizontes

IS
(inmaduros)
tempranos
Macrogameto Cigoto

HUM ANO *

ESPOROGONIA
Trofozoíto

Oocisto
inmaduro
Se adhiere a la superficie de la c élula epit elial

Esporozoíto

Ingerido
Oocisto maduro en heces

Oocistos maduros (est ad i o d i agn óst i co)

(4 esporozoítos)
(estadio infectante)

AM BI ENTE EXTERNO

*Probable desarrollo (basado en estudios en animales y exámenes de tejido

de biopsia intestinal humano en el microscopio electrónico).