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Manual Sensibilidad Salmshigecoli 2008 PDF
Manual Sensibilidad Salmshigecoli 2008 PDF
2008
AUTORES
Dto. Bacteriología
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”
Centro Regional de Referencia WHO-Global Salm Surv para
América del Sur.
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capaz de exhibir resistencia a los antibióticos de uso clínico. Los mecanismos de resistencia a los
agentes antimicrobianos incluyen: producción de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de
acción y modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas. Para los microorganismos que posean
sensibilidad antibiótica predecible se recomienda la aplicación de la terapia empírica adecuada. Las
pruebas de sensibilidad también son importantes en estudios de epidemiología de la resistencia y de
nuevos agentes antimicrobianos. Para realizar pruebas de sensibilidad e identificación se debe partir
de un cultivo primario en medio sólido y se debe procesar colonias aisladas de cada tipo de
microorganismo que pueda tener rol patógeno. No se deben realizar pruebas de sensibilidad sobre
mezclas de diferentes tipos de microorganismos, ni sobre el material clínico sin procesar, excepto
para emergencias clínicas donde la coloración de Gram sugiera la presencia de un sólo patógeno.
Cuando la prueba de sensibilidad haya sido realizada a partir del material clínico, se debe informar
como resultado preliminar y se debe repetir utilizando la metodología estandarizada. No es
aconsejable la realización de pruebas de sensibilidad cuando no es clara la naturaleza de la infección
y la muestra contiene flora normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aislados
probablemente tengan poca relación con el proceso infeccioso. En estos casos los resultados
obtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento.
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Las pruebas de sensibilidad contribuyen a orientar el tratamiento antimicrobiano de los procesos
infecciosos. No es necesario realizar pruebas de sensibilidad en aquellos casos en los que la
identificación del microorganismo es suficiente para predecir la sensibilidad a los antimicrobianos (por
ejemplo S. pyogenes vs penicilina).
Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando, a pesar de conocerse la sensibilidad del
germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicación.
El antibiograma también puede ser indicado con fines epidemiológicos y en el estudio de nuevos
antibióticos.
Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. No se debería realizar el
antibiograma en forma directa a partir del material clínico, excepto en las emergencias clínicas donde
la coloración directa de Gram sugiere cultivo monobacteriano. En este caso, debe repetirse luego
usando la metodología estandarizada.
En el caso particular de Salmonella sp., Shigella spp y Escherichia coli aisladas de materia fecal se
ha descrito resistencia a todos los antibióticos útiles para su tratamiento. Este hecho determina la
necesidad de realizar pruebas de sensibilidad en todos los casos. Estos patogenos producen
fundamentalmente diarreas pero su capacidad invasiva le confiere la posibilidad de hacer infecciones
sistémicas. El tratamiento antimicrobiano en cada una de estas situaciones clínicas es muy distinto y
por lo tanto también lo es la elección de los antibióticos a ensayar en el antibiograma.
Para cada antimicrobiano se establecen "concentraciones críticas" o "puntos de corte" que permiten
separar a los microorganismos en tres categorías, sensibles, resistentes o de sensibilidad intermedia.
Estas categorías se establecen para cada bacteria frente a cada antibiótico comparando la CIM en
cada caso con los puntos de corte establecidos.
*Resistente: este término indica que no es probable que la infección causada por el microorganismo
responda al antibiótico en cuestión, cualesquiera que sean la dosis y la localización de la infección.
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*La categoría sensibilidad intermedia se aplica a dos situaciones. Por un lado, se incluyen en ella las
cepas con sensibilidad disminuida a un antibiótico que puede utilizarse con éxito, para el tratamiento
en dosis más altas, por ser poco tóxico o porque se concentra en el foco de infección (por ejemplo,
antibióticos ß-lactámicos o quinolonas en la orina).
En esta categoría se incluyen asimismo las cepas de "sensibilidad intermedia" a antibióticos que, por
ser más tóxicos, no puede usarse en dosis más altas. En este caso, la categoría intermedia sirve
como una zona de transición entre las cepas sensibles y las resistentes y previene pequeños errores
causados por factores técnicos. Muchas veces un resultado intermedio requiere la definición de la
sensibilidad mediante el uso de un método cuantitativo como la CIM.
La decisión definitiva sobre el uso de un determinado antibiótico y sobre la dosificación del mismo no
sólo depende de los resultados de las pruebas de sensibilidad sino también de la interpretación de
las mismas por el equipo de salud. También habrá que tener en cuenta otros factores como el rol
patogénico del microorganismo, los efectos secundarios y las propiedades farmacocinéticas del
medicamento, su penetración a los diferentes sitios de infección y el estado inmunitario del huésped,
etc.
La selección de los agentes antimicrobianos apropiados para la prueba de difusión, es una decisión
de cada laboratorio clínico en consulta con el cuerpo médico, el comité de farmacia y el comité de
enfermedades infecciosas.
Para la selección de los antimicrobianos a ensayar en las pruebas de sensibilidad se deben tener en
cuenta las siguientes consideraciones: eficacia clínica, prevalencia de resistencia, costo, indicaciones
del FDA, recomendaciones consenso para drogas de primera elección y alternativos.
Se pueden obtener resultados incorrectos (sensibilidad in vitro, falla terapéutica in vivo) cuando se
ensayan determinados agentes antimicrobianos con ciertos microorganismos. Algunos ejemplos de
estas combinaciones incluyen: cefalosporinas de 1ra. y 2da. generación y aminoglucósidos frente a
Salmonella spp. y Shigella spp. Por ello se resume las drogas con actividad frente a Salmonella y
Shigella spp.:
• Aminopenicilinas (Ampicilina)
• Trimetoprima/sulfametoxazol
• Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina)
• Fosfomicina
• Tetraciclinas (Tetraciclina)
• Cloranfenicol (sólo para aislamientos de infección sistémica de Salmonella)
• Nitrofuranos (solo para aislamientos de Shigella)
• Cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima/ceftriaxona solo para aislamientos de
infección sistémica)
Otras drogas inapropiadas para tratamiento de diarreas pueden ser probadas para proveer datos
taxonómicos o información epidemiológica (como es el caso de la gentamicina). Sin embargo, tales
resultados deberán estar disponibles sólo para el laboratorio o para el comité de control de
infecciones. El ensayo de algunas drogas es muy útil como indicador de la presencia de mecanismos
de resistencia de difícil detección. Son ejemplos de estos casos: ácido nalidixico para detectar
sensibilidad disminuida a las fluorquinolonas y ceftacidima o el disco de amoxicilina/ ac. clavulánico a
30 mm del disco de una cefalosporina de tercera generación o disco de cefpodoxima como
detectores de ß-lactamasas de espectro extendido (Famiglietti A, et al. Consensus for antimicrobial
susceptibility testing for Enterobacteriaceae. Subcommittee on Antimicrobials, SADEBAC (Argentinian
Society of Clinical Bacteriology), Argentinian Association of Microbiology. Rev Argent Microbiol. 2005
Jan-Mar;37(1):57-66.). Una ventaja adicional del disco de cefpodoxima es su alta sensibilidad para
detectar cepas de Salmonella y/o Shigella productoras de ampC plasmidicos (Rapoport etr al, CMY-2
type ß-lactamase finally emerging in Argentina, aceptado para publicacion en Int. J. Antimicrob.
Agents)
Para la realización de una adecuada prueba de sensibilidad, el número de agentes probados debe
ser limitado. En general, deberá incluir sólo un representante de cada grupo de drogas relacionadas
que tengan muy similar actividad y para las cuales la interpretación podría ser la misma.
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MATERIALES
Equipos
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Preparación del Agar Mueller Hinton Comentarios teóricos
(1) Prepar el agar M. Hinton a partir de la base De los medios disponibles se considera al agar M-
deshidratada de acuerdo a las recomendaciones Hinton como el mejor para las pruebas de
del fabricante. sensibilidad de rutina dado que:
• Muestra buena reproducibilidad lote a lote en
(2) Inmediatamente después de esterilizar dejar las pruebas de sensibilidad.
enfriar en baño de agua hasta 45-50ºC. • Contiene bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.
• Es adecuado para el desarrollo de la mayoría
de las bacterias patógenas.
• Existen suficientes datos recopilados que
avalan la experiencia de las pruebas de
sensibilidad realizadas en este medio.
(3) Dispensar el medio en las placas de Petri de Se ha demostrado que con volúmenes mayores o
fondo plano hasta un nivel aproximado de 4 mm. menores de agar, la prueba pierde reproducibilidad
Esto corresponde a 60 - 70 ml de medio para ya que pequeñas variaciones tienen efectos
placas de 150 mm. de diámetro y 25 a 30 ml. para significativos. Placas de espesores menores a los
las de 100 mm. de diámetro interno. 4 mm producirán zonas de inhibición más grandes
a las esperadas pudiendo ocasionar falsa
sensibilidad al momento de interpretar los halos
obtenidos. El fenómeno opuesto se obtendrá con
espesores mayores a los 4 mm.
Controle la profundidad de entre 2 a 5 placas del
total del lote preparado. Para medir la profundidad
introduzca dentro del agar un elemento fino, estéril,
marcado en 3 y 5 mm de uno de sus extremos. El
rango de profundidad aceptado para la prueba de
difusión es de 3 a 5 mm.
Antes de colocar el medio en la placa de petri debe
asegurarse que la mesada donde está trabajando
esté perfectamente nivelada. De no ser así, el agar
en las placas quedará inclinado conduciendo a
errores por la heterogeneidad del espesor del
mismo.
(4) Las placas que no se usan en el día pueden Las placas almacenadas en bolsas de plástico
mantenerse en refrigerador (2-8 ºC.). tienen un período de uso de hasta 70 días.
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más a 30-35 ºC. Luego descar esas muestras.
No deberá observarse crecimiento de colonias
bacterianas o micóticas. Para verificar la esterilidad
del medio, tome una muestra equivalente al 5-10%
del total del lote producido. Ignorar cualquier
contaminación esporádica; ej. una fracción de
medio. Descartar el lote completo, si el nivel de
contaminación es significativo (>10% del medio
controlado).
pH: El agar Mueller Hinton debe tener un pH 7,2 - El pH para cada lote debe ser controlado cuando
7,4 a temperatura ambiente y debe determinarse se prepara cada lote de medio. Si el pH está por
después de su solidificación. debajo de 7,2, ciertas drogas (por ej.
aminoglucósidos, quinolonas y macrólidos)
parecerán menos activas; mientras otras (p ej.
tetraciclinas) parecerán tener mayor actividad. Si el
pH es demasiado alto se observarán los efectos
opuestos. Ver Tabla 1
Es ideal el uso de electrodos de superficie, pero El método a utilizar dependerá del tipo de equipo
también resulta satisfactoria la determinación del disponible en cada laboratorio
pH del macerado de una alícuota solidificada de Debe asegurarse que el electrodo de superficie
agar, suficiente para que el bulbo del electrodo esté adecuadamente calibrado.
quede totalmente sumergido.
Las correcciones necesarias se deben realizar por El agregado de grandes volúmenes de estas
el agregado de NaOH 1M o HCl 1M soluciones para correccion del pH puede alterar el
contenido de sales del medio.
Humedad: Si justo al momento de usar las placas Las placas deberán estar húmedas pero no
hay exceso de humedad en la superficie, éstas se mostrar gotas sobre la superficie del medio ya que
deben colocar a 35ºC durante 10 - 30 min hasta distorsionarán las zonas de inhibición.
que desaparezcan las gotas de humedad
superficiales.
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar Los medios que contienen excesiva cantidad de
cada lote de Mueller Hinton en su contenido de timina o timidina pueden revertir los efectos
Timidina se debe ensayar el Enterococcus faecalis inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima,
ATCC® 29212 o ATCC® 33186 frente al disco de produciendo así zonas más pequeñas, menos
trimetoprima / sulfametoxazol. nítidas o sin halo lo cual puede dar como resultado
un informe de falsa resistencia.
Un medio satisfactorio mostrará un halo de
inhibición claro y definido de 20 mm o más.
En caso que se observe una zona de inhibición < La timidina fosforilasa ya sea en su forma pura
20 mm podrá procederse al agregado de timidina (aislada) o contenida en la sangre lisada de caballo
fosforilasa o sangre lisada de caballo. eliminará los excesos de timidina presentes en el
medio. Este procedimiento mejorará la nitidez de
los halos y la confiabilidad de las pruebas de
sensibilidad para sulfonamidas y trimetoprima
frente a patógenos comunes.
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Un agar Mueller Hinton con elevado contenido de
timina o timidina no podrá ser utilizado para el
ensayo de trimetoprima, sulfonamidas o la
combinación de ambas drogas pero podrá
utilizarse para ensayar la actividad de cualquier
otro antimicrobiano.
Aspecto:
Antes de su utilización, se debe controlar que los Descartar los medios que presenten alguna de
medios de cultivo no presenten evidencia de: estas características
- Decoloración
- Deshidratación
- Rotura del agar
- Volumen insuficiente
- Heterogeneidad del espesor de la capa de agar
- Otros signos de deterioro
Tabla1
Variación de la actividad de diferentes antimicrobianos con el cambio del pH
Se incluyen también antibióticos sin actividad frente a Salmonella y Shiegella spp.
AUMENTO DE LA ACTIVIDAD
pH ácido pH alcalino
Amoxicilina Amicacina
Amplicilina Netilmicina
Carbenicilina Estreptomicina
Cloxacilina Tobramicina
Piperacilina Claritromicina
Tetraciclina Eritromicina
Doxiciclina Ac. Nalidixico
Minociclina Quinolonas Fluoradas
Nitrofurantoina
DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD
pH ácido
Azitromicina
Claritromicina
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Clindamicina
Metronidazol
CAMBIOS EN LA ACTIVIDAD
CON EL AUMENTO O DISMINUCION DEL pH
Penicilina
Cefalotina
Cefalexina
Cefoperazona
Ceftazidima
Ceftriaxona
Cloranfenicol
Polimixina B
Sulfonamidas
Trimetoprima
Los discos deben mantenerse refrigerados a 2 - Para mantener su potencia, todos los discos deben
8ºC (si van a ser utilizados en los siguientes 7 días) mantenerse en congelador (freezer) especialmente
o en congelador (freezer) a -14 ºC o menos (para los que contienen drogas de la familia de los ß-
conservación a largo plazo). lactámicos. Sólo los discos que se estén usando
diariamente pueden permanecer en el refrigerador
Los discos deben guardarse en contenedores Este proceso evita la condensación que podría
herméticos con desecante y ser sacados del ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los
refrigerador o congelador (freezer) 1 ó 2 horas frascos fríos. La mayoría de las drogas
antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la antibacterianas son más sensibles a la exposición
temperatura antes de ser abiertos los frascos o a un ambiente húmedo que a temperaturas
contenedores templadas. Los antimicrobianos más afectados por
los problemas de conservación son, en general, los
ß-lactámicos y dentro de esta familia, los
carbapenemes (meropenem e imipenem),
oxacilina, cefaclor, las combinaciones de ß-
lactámicos con inhibidores de ß-lactamasas
(amoxicilina/ac. clavulánico, ampicilina/sulbactam,
ticarcilina/ac. clavulánico, cefoperazona/sulbactam
y piperacilina/tazobactam) son los más lábiles.
Para estandarizar la densidad del inóculo se usa Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland
una suspensión de sulfato de bario como estándar representa aproximadamente 108 UFC/ml para
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de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland). bacterias de rápido crecimiento. La estandarización
de inóculo es esencial ya que el tamaño de la zona
de inhibición es muy dependiente de la densidad
del inóculo utilizado.
Reemplazar o verificar la confiabilidad de los Recordar que los patrones de turbidez de SO4Ba
estándares mensualmente. Descartar los tienen una vida útil de aproximadamente un año.
estándares, que presenten alguna evidencia de Luego de transcurrido este tiempo deben ser
evaporación. Esto pude controlarse marcando los reemplazados por un nuevo lote.
tubos en el momento de la preparación con una
marca a la altura del menisco. Si la evaporación es
evidente, descartar los tubos.
PROCEDIMIENTO
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Día 1 Comentarios teóricos
A partir de 4 ó 5 colonias bien aisladas y de igual Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a
morfología en un medio de aislamiento primario partir de una cepa aislada. Se debería evitar
preparar una suspensión en 4 ó 5 ml de un caldo realizar el antibiograma en forma directa a partir
apropiado (tripteina soja (soya) u otro) tocando la del material clínico, excepto en las emergencias
parte superior de cada colonia. clínicas donde la coloración directa de Gram
sugiere naturaleza monobacteriana. En este caso,
debe repetirse luego usando la metodología
estandarizada.
Ajustar la densidad de los cultivos que se Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland
encuentran en fase logarítmica, con solución salina representa aproximadamente 108 UFC/ml para
o caldo, por comparación visual hasta turbidez bacterias de rápido crecimiento.
equivalente al tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland.
Para facilitar este procedimiento, mire los tubos La estandarización de inóculo es esencial ya que el
contra un fondo blanco con una línea negra como tamaño de la zona de inhibición depende de la
contraste. densidad del inóculo. Para la interpretación de las
pruebas de sensibilidad con las tablas
Importante: agitar muy bien el estándar de recomendadas por el CLSI se requiere un inóculo
turbidez antes de proceder a la comparación confluente.
Utilizar para esta operación las pipetas Pasteur Nunca utilice inóculos no estandarizados para el
descartables y transferir unas gotas a un tubo con hisopado de las placas. Evitar extremos en la
solución fisiológica estéril. densidad del inóculo. Los excesos o defectos en la
densidad del inóculo producen cambios muy
grandes en los resultados finales del ensayo
Dentro de los 15 minutos después de ajustado el Para evitar el sobrecrecimiento del inóculo
inóculo, inocular las placas de Mueller Hinton con bacteriano no excederse de los 15 minutos
un hisopo estéril.
Sembrar la superficie seca del Mueller Hinton por Resultados reproducibles y confiables requieren
hisopado en tres direcciones para asegurar una una distribución homogénea del inóculo en las
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completa y homogénea distribución del inóculo. placas.
Colocar los discos sobre la superficie del agar con Debido a que todas las drogas difunden casi
pinza estéril aplicando una ligera presión a una instantáneamente, un disco no debe ser removido
distancia no menor a 24 mm desde un centro al una vez que tomó contacto con la superficie del
otro. La distancia al borde de la placa al disco no agar. Si el disco es desplazado del lugar donde
debe ser menor de 14 mm tomó contacto con el agar, la carga de antibiótico
del mismo será menor que la estandarizada, por lo
que se observara una tendencia a la falsa
resistencia.
No deben colocarse más de 5 discos por placa de
90 mm o 12 en placa de 150 mm.
Figura 1
Esquema sugerido para la colocación de los discos
GEN NAL
Placa 2
Placa 1
CIP: ciprofloxacina; NIT: nitrofurantoína; CTX: cefotaxima; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina; FOS:
fosfomicina; AMP: ampicilina; TMS: trimetoprima/sulfametoxazol; NAL: ácido nalidíxico,
CHL: cloranfenicol. Este esquema tiene en cuenta el tamaño de las zonas de inhibición usuales que
producen los distintos antibióticos frente a Salmonella y Shigella spp. y está diseñado de manera de
evitar la superposición de las zonas de inhibición producidas.
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Día 2 Comentarios teóricos
Examinar y verificar que el crecimiento sea Las zonas de inhibición deberán ser
confluente. uniformemente circulares y el desarrollo
confluente. La presencia de colonias aisladas
indica un inóculo bacteriano de densidad inferior al
estandarizado. Se deberá repetir la prueba. Lo
mismo si el inóculo bacteriano fuere más denso
que el recomendado.
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reportes de presencia de estas enzimas en estos
patogenos (Andres P. et al. Int J Antimicrob
Agents. 2005 Jun;25(6):501-7. Extended-spectrum
ß-lactamases in Shigella flexneri from Argentina:
first report of TOHO-1 outside Japan)
CONTROL DE CALIDAD
Propósito
El objetivo de un programa de control de calidad interno es el monitoreo de:
• La exactitud y precisión de los procedimientos para realizar las pruebas de sensibilidad.
• La calidad de los reactivos usados en las pruebas.
• El desempeño de las personas que llevan a cabo los ensayos y la lectura de los resultados.
Estos objetivos son alcanzados principalmente por la utilización de cepas de referencia
seleccionadas por su estabilidad genética y por su utilidad en los métodos a ser controlados.
Cepas Control
Para controlar la precisión y la exactitud de las pruebas de difusión, se deben obtener de una fuente
confiable las siguientes cepas patrones para control de calidad:
• E. coli ATCC® 25922
• P. aeruginosa ATCC® 27853
• S. aureus ATCC® 25923
• E. faecalis ATCC® 29212
• E. coli ATCC® 35218
• K. pneumoniae ATCC® 700603
E. coli ATCC® 35218 productor de ß-lactamasa se recomienda solamente para el control de calidad
de los discos que contengan la combinación "ß-lactámico/Inhibidor de ß-lactamasa", entre estos
inhibidores se encuentran: ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam.
Cuando se prueben rutinariamente sulfonamidas, trimetoprima ó trimetoprima-sulfametoxazol, debe
controlarse, para cada lote nuevo de Mueller Hinton, los niveles de timina ó timidina. Para ello debe
utilizarse E. faecalis ATCC® 29212 ó 33186.
Las siguiente Tabla muestran algunas de las cepas utilizadas más comúnmente en el control de
calidad interno, los factores a evaluar y algunas de sus características.
Tabla 3. Microorganismos sugeridos para el control de calidad de las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos
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- pH: Aumento de resistencia a aminoglucósidos cuando el pH del
medio disminuye.
• No subcultivar, se seleccionan mutantes resistentes a las
penicilinas activas frente a Pseudomonas spp
• Frente a un doble halo alrededor del disco de imipenem,
cambiar el lote de Mueller Hinton.
Escherichia coli
- Calidad de la prueba de sensibilidad
ATCC 25922
- Mide la carga de inhibidores de ß-lactamasas de los discos para
antibiograma. Probar sólo frente a combinaciones de antibióticos
Escherichia coli
ß-lactámicos e inhibidores de ß-lactamasas como
ATCC 35218
ampicilina/sulbactama, amoxicilina/ácido clavulánico, ticarcilina/
ácido clavulánico, etc.
Staphylococcus aureus
- Calidad de la prueba de sensibilidad
ATCC 25923
Enterococcus faecalis - Concentración de timidina: Este compuesto interfiere con la
ATCC 29212 actividad de trimetoprima y de sulfametoxazol.
Las cepas patrones para el control de calidad se deben probar y mantener de la siguiente
manera:
• Las cepas de control de calidad se deben probar por la técnica estandarizada de difusión en agar
descrita anteriormente. Los antibióticos a ensayar deben ser los mismos que se utilizan para los
aislamientos clínicos.
• Las cepas de control de calidad de trabajo se deben conservar a 4 - 8ºC en agar tripticasa de soja
(soya) (no exigentes o fastidiosas) y se deben subcultivar semanalmente. Si las quiere almacenar por
tiempo prolongado, puede hacerlo de la siguiente manera: mantenga los cultivos a -20 ºC ó menos (p
ej.: Nitrógeno líquido) en medios adecuados (p ej.: 10-15 % de glicerol en caldo Tripticasa - Soja
(Soya), caldo al 50 % de Suero fetal bovino, en sangre de oveja defibrinada ó en leche descremada)
o en estado liofilizado minimizando de esta manera el riesgo de alterar su sensibilidad a los
antibióticos.
• Los cultivos de trabajo deben ser reemplazados por lo menos una vez al mes a partir de cultivos
congelados, liofilizados o comerciales.
• Antes de su utilización, las cepas patrones se deben sembrar sobre una placa de agar con el fin de
obtener colonias aisladas.
• Los inóculos para realizar los ensayos de sensibilidad con las cepas de referencia se deben
preparar siguiendo las mismas indicaciones que se utilizan para los aislamientos clínicos ya sea
permitiendo que el cultivo alcance fase logarítmica o bien resuspender colonias provenientes de una
placa de 18-24 h de incubación.
• Las cepas de control de calidad pueden ser utilizadas para ensayar la precisión y la exactitud de las
pruebas de sensibilidad hasta tanto no presenten un cambio significativo en los diámetros de las
zonas de inhibición que no puedan ser atribuidos a fallas metodológicas o de calidad de los reactivos.
Si aparecen resultados inexplicables que sugieran un cambio en la sensibilidad propia del
microorganismo, se debe obtener un nuevo cultivo a partir de las cepas almacenadas.
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1. pH
2. Cationes Ca++ y Mg++ B) Contaminación esporádica de los medios de
3. Contenido de timidina cultivo.
4. Factores de crecimiento, composición del medio
5. Profundidad del agar para la prueba de difusión C) Mal funcionamiento momentáneo del
por discos instrumental.
Son numerosos los factores que pueden dar como resultado una alteración en el tamaño final de las
zonas de inhibición. Las causas probables de algunas de ellas se indican a continuación.
Efecto observado
Causas probables
con las cepas de referencia
Bajo inóculo
Agrandamiento general de las zonas de inhibición Volumen insuficiente del medio de cultivo
Sobrecarga de los discos
Alto inóculo
Volumen excesivo del medio de cultivo
Disminución general de las zonas de inhibición
Inactivación de la droga de los discos
Discos vencidos
Aminoglucósidos, macrólidos
- Disminución de las zonas pH menor a 7,2
Penicilinas y tetraciclinas
- Aumento de las zonas pH menor a 7,2
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Frecuencia de Realización de las pruebas de control de calidad con las cepas de referencia
Cada vez que se introduce un nuevo lote de discos En general se acepta que en una serie de pruebas
de antimicrobianos a la rutina, este se debe uno de cada veinte ensayos consecutivos de
ensayar con las cepas patrón de control de calidad control de calidad esté fuera de los rangos
apropiadas. establecidos. Si aparece más de un resultado fuera
de dichos rangos, se deben tomar medidas
Las cepas patrón de control de calidad se deben correctivas.
probar semanalmente y cada vez que se cambie
cualquier reactivo que intervenga en la realización Cuando un ensayo dé como resultado halos de
de las pruebas de sensibilidad; los discos de inhibición que estén fuera del rango aceptable, se
antibiótico a ensayar deben ser los mismos que se deben tomar medidas correctivas. Si la desviación
utilizan de rutina para los aislamientos clínicos se puede atribuir a un error obvio, como por
ejemplo discos o cepas de control anómalos,
contaminación de la cepa control o atmósfera de
incubación incorrecta, se debe repetir la prueba de
control de calidad.
La obtención de resultados aceptables con las cepas de control de calidad no garantiza que
los resultados obtenidos con los aislamientos clínicos sean correctos.
Cuando se obtienen resultados de sensibilidad atípicos en un aislamiento clínico se debe
repetir la prueba y/o confirmar la tipificación del mismo.
Resistencias inusuales
Por otra parte se debe tener en cuenta que la resistencia a algunos antibióticos en determinados
microorganismos es sumamente inusual y debe, por lo tanto, repetirse. Si dicha resistencia se
confirma, el aislamiento debe derivarse a un centro de referencia para su confirmación y
caracterización del mecanismo involucrado. Algunos ejemplos de estas combinaciones
microorganismo-droga incluyen resistencia a:
La detección temprana de este tipo de cepas permitirá dar la voz de alarma y de esa manera elaborar
estrategias para evitar su diseminación.
Cada laboratorio debería desarrollar sus propias reglas para detectar las posibles fallas en las
pruebas de sensibilidad y proceder así a su corrección.
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Tabla 4
Resistencias naturales en el género enterobacterias
GEN
AMP/ CAR MEZ TE
Organismo AMP CPG FOX CTG CFP IMP TOB AKN CHL SXT CIP NAL NTI POL
SUL TIC PIP T
NET
Citrobacter
Rc S-R R S S-R S S S S S S S S S S S S S
koserib
Citrobacter
Rc S-R S S R R S S S S S S S S S S S S
freundii
Enterobacter
c
aerogenes R S-R S S R R S S S S S S S S S S S S
y E. cloacae
Enterobacter
S-R S-R S S S-R S-R S S S S S S S S S S S S
agglomerans
E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S
Morganella
Rc S-R S S Rc S-R S S S S S S S S S S Rc Rc
morganii
Proteus
S S S S S S S S S S S S Rc S S S Rc Rc
mirabilis
Proteus
c c c c c
vulgaris y P. R S-R S S R S S S S S S S R S S S R R
penneri
Providencia c c c c c
R S-R S S R S-R S S S S S S R S S R R R
spp.
Salmonella
S S S S S S S S S S S S S S S S S S
spp.
c c c c
Serratia spp. R R S S R S-R S S S S S S R S S S R R
Shigella spp. S S S S S S S S S S S S S S S S S S
a Abreviaturas: S, sensible; R, resistente; S-R, sensible o resistente; AMP, ampicilina; AMP/SUL, ampicilina/sulbactam; CAR,
carbenicilina; TIC, ticarcilina; MEZ, mezlocilina; PIP, piperacilina; CPG, cefalosporinas de primera generación; FOX, cefoxitina;
CTG, cefalosporinas de tercera generación; CFP, cefoperazona; IMP, imipenem; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina; NET,
netilmicina; AKN, amicacina; CHL, cloranfenicol; TET, tetraciclina; SXT, trimetoprima/sulfametoxazol; CIP, ciprofloxacina; NAL,
ácido nalidíxico; NTI, nitrofurnatoina; POL, polimixina.
b Ex C. diversus
c Muy inusual encontrar aislamientos sensibles a esta droga.
Resultados incorrectos
Se pueden obtener resultados incorrectos cuando se ensayan determinados agentes antimicrobianos
con ciertos microorganismos. Algunos ejemplos de estas combinaciones incluyen: cefalosporinas de
1ra. y 2da. generación y aminoglucósidos con Salmonella spp y Shigella spp. En estos casos si se
ensaya alguna de las drogas enumeradas el resultado de éstas no deberá incluirse en el informe al
médico. Esto se debe a que pueden inducir a errores en la elección del tratamiento (falsa
sensibilidad)
Emergencia de resistencia
Algunos agentes antimicrobianos están asociados con la emergencia de resistencia durante terapias
prolongadas. Más aún, aislamientos inicialmente sensibles podrían transformarse en resistentes
dentro de los tres a cuatro días de haberse iniciado la terapia antimicrobiana
19
Planilla - Registro de Resultados: Prueba de Difusión por discos
E. coli ATCC®
Antimicrobiano Cepa Cepa Cepa Cepa
25922
Diámetro S,I, Diámetro S,I, Diámetro S,I, Diámetro S,I, Diámetro Rang
mm R mm R mm R Mm R mm o
Ampicilina 16-22
Trimtoprima-
sulfametoxazol 24-32
Acido
22-28
nalidixico*
Cloranfenicol 21-27
Fosfomicina -
Nitrofurantoina 20-25
Cefotaxima** 29-35
Gentamicina 19-26
Tetraciclina 18-25
Ciprofloxacina* 30-40
* Resistencia a Acido nlidixico indica generalmente sensibilidad disminuida a ciprofloxacina. Es importante que
esta sensibilidad disminuida sea informada al equipo medico ya que se han descrito fallas de tratamiento en
infecciones por Salmonella spp. con estas características (CLSI). Si se detectara un aislamiento de Salmonella
spp. o Shigella spp. con sensibilidad disminuida o resistencia, confirmar el hallazgo y enviarlo a un centro de
referenci para su estudio.
** Las cefalosporinas de tercera generación se deben informar únicamente frente a aislamientos causantes de
infecciones sistémicas. Descartar previamente presencia de BLEE: Cefpodoxima se puede incorporar como
prueba de tamizaje de ß-lactamasas de espectro extendido y resistencia a cefalosporinas de tercera generación.
En caso de presentarse resistencia a esta droga (halos < 17mm) se debe confirmar la presencia de BLEE
mediante el ensayo de CTX y CAZ con el disco de AMC entre ambos o en paralelo con los discos de
cefotaxima/ac. clav (CTC) y ceftazidima/ac. clav (CAC). Para la sospecha de BLEE en Salmonella spp y
Shigella spp., utilizar los puntos de corte especiales recomendados por CLSI para E. coli, Klebsiella spp. y P.
mirabilis frente a CTX y CAZ. Evaluar en un segundo paso también la sensibilidad a cefoxitina con el objetivo
de diferenciar la resistencia a cefpodoxima mediada por BLEE de la mediada por enzimas tipo AMP-C
plasmídico.
20
2. Métodos de Dilución
INTRODUCCION
Las técnicas de dilución en caldo o agar, se pueden utilizar para medir cuantitativamente la actividad
"in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Estos métodos se basan en la
preparación de una serie de tubos o placas con caldo o agar, respectivamente, a los cuales se les
agrega el antibiótico (ATB) en distintas concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o
placas con una suspensión estandarizada del microorganismo en estudio. Las pruebas se examinan
después de incubar 18 a 24 hs. a 35ºC y se determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) del
antimicrobiano frente al microorganismo ensayado. El resultado final no ende significativamente de la
metodología empleada. Por ello, para obtener valores reproducibles intra e interlaboratorios, cada
detalle técnico debe ser cuidadosamente controlado.
Las bases para la realización de estas metodologías derivan, en gran parte, de la información
generada por un estudio colaborativo internacional (1). Aunque estos métodos son referenciales,
algunos son lo suficientemente prácticos para ser desarrollados tanto en los laboratorios clínicos
como en los de investigación. Existen también sistemas comerciales que se basan, al menos en
parte, en los mismos conceptos y dan resultados equivalentes a los obtenidos con las técnicas
descriptas en este documento...
El documento que se ha tomado como base es el M7 – A7 del Clinical Laboratory Standards Institute
(CLSI) del año 2006. Las Tablas de interpretación corresponden al suplemento M100 – S17 del año
2007.
Las técnicas que se describen en este documento fueron diseñadas para ensayar bacterias de fácil
desarrollo después de 18 - 20 hs. de incubación en medio M. Hinton sin suplementos.
Indicaciones para realizar la prueba sensibilidad a los antimicrobianos por el metodo de CIM
El valor de CIM obtenido por el método de dilución, orienta al medico tratante sobre que
concentración de antibiótico necesita alcanzarse en el sitio de infección para inhibir el desarrollo del
microorganismo infectante. La CIM, sin embargo, no representa un valor absoluto. La CIM real puede
estar entre la menor concentración de antibiótico que inhibe al microorganismo y la siguiente dilución
inmediatamente inferior donde se observa desarrollo del mismo. Si por ejemplo, fueran probadas
diluciones al medio y se determina una CIM de 16 µg/ml, el verdadero valor podría estar entre 16 y 8
µg/ml. Debe tenerse en cuenta que a pesar de realizar las pruebas de dilución bajo condiciones
cuidadosamente controladas, no siempre se obtienen los mismos resultados. Generalmente, la
reproducibilidad de esta prueba es de +/- 1 dilución.
La metodología más común para la determinación de La CIM es la que utiliza diluciones seriadas al
medio (por ej. 1, 2, 4, 8,16 µg/ml, etc.). También existen otros esquemas de dilución, que utilizan
unas pocas concentraciones (hasta dos), concentraciones "Breakpoint" o que agregan
concentraciones entre las que se ensayan normalmente (por ej. 4, 6, 8, 12, 16 µg/ml) Los resultados
de estos métodos alternativos pueden ser igualmente útiles; sin embargo, a veces son más difíciles
de controlar. Cuando se produce inhibición del crecimiento con la menor concentración utilizada, el
verdadero valor de la CIM no se puede determinar exactamente y debe informarse como igual o
menor que dicha concentración. Cuando se ensayan concentraciones adicionales entre las usuales y
la CIM es una de esas concentraciones intermedias, la interpretación de la prueba se debe hacer
después de redondear el valor a la próxima superior dilución al medio del esquema normal (por ej.
Una CIM de 6 µg/ml se debe redondear a 8 µg/ml y luego proceder a interpretar).
21
Cuando se informa al médico el resultado de la CIM, el valor debe ser acompañado por su
correspondiente interpretación (por ej. SENSIBLE, INTERMEDIO o RESISTENTE) que se obtiene
aplicando los criterios enumerados en las Tablas del CLSI. Cuando las CIMs se realizan con 4 o
menos concentraciones consecutivas, o con concentraciones no consecutivas, se debe informar la
correspondiente interpretación. Si se desea se puede informar además el rango de CIM ensayado
La preparación, propiedades y control del agar M. Hinton y los estándares de turbidez se describen
en detalle para el método de difusión. Para la dilución en agar valen los mismos considerandos
descripto ut supra
MATERIALES
Equipos
• Estándar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
• Ansas para inocular tipo loop (1-10 µl)
• Mechero tipo Bunsen
• Placas de Petri (9 cm de diámetro)
• Pipetas Pasteur plásticas descartables
• Pipetas de 0.1 ml (podrán utilizarse pipetas automáticas)
• Pipetas de 1 ml
• Pipetas de 5 ml
• Micropipetas hasta 1000µl
• Baño termostatizado (50-55 oC)
• Replicador tipo Stern
22
PROCEDIMIENTO
Las figuras 2 a 9 muestran los pasos secuenciales Los antibióticos estándar o de referencia se
para la preparación de las diluciones de los pueden obtener directamente del laboratorio
antibioticos comúnmente utilizados para Salmonella productor o de otras fuentes comerciales. No se
y Shigella recomienda la utilización de las preparaciones para
aplicación parenteral.
Para las pruebas de sensibilidad se debe conocer El almacenamiento de la droga debe hacerse
el lote, la potencia (generalmente expresada en según las recomendaciones del laboratorio
µg/ml, % ó UI/mg de polvo) y la fecha de productor, o a una temperatura igual o menor a -
vencimiento de los antimicrobianos de referencia 20ºC en un desecador (preferiblemente con vacío)
provisto de algún material desecante como gel de
sílice o cloruro de calcio. Cuando se saca el
desecador del freezer se debe esperar que tome
temperatura ambiente antes de abrirlo para evitar
que el agua de condensación humedezca las
drogas. Las tertraciclinas deberán protegerse al
abrigo de la luz.
Se debe tener en cuenta que para la dilución en Ello es por que la solución del antibiótico se diluirá
agar cada solución de atb preparada debe ser 20 1/20 al ser incorporada al agar (1 ml de la solución
veces más concentrada que la deseada en la de ATB + 19 ml del agar)
placa.
Para el caso particular de trimeptroprima/ Puesto que para obtener la solucion de antibiotico
sulfametoxazol (TMS) la solución de antibiótico a de trabajo (SAT) de TMS se mezclaran volúmenes
preparar deberá ser de una concentración 40 iguales de las soluciones de trimetoprima (TMP) y
veces superior a la del rango superior deseado de sulfametozaxol (SMZ). De esta manera ambas
cada uno de los componentes individuales (40X). soluciones se diluirán 1:2, obteniéndose la SAT de
(Tabla 5, columna 3) TMS
El volumen final de SAT requerido dependerá del Esquemas alternativos de dilución de las
esquema de dilución a seguir soluciones de ATB se encuentran en la Tabla 5 del
En el caso propuesto en el ejemplo de la Tabla 5 documento M100-S17 del CLSI (2002). El volumen
las diluciones seriadas al ½ involucran la final de SAT a preparar deberá contemplar el
transferencia de 3 ml de la SAT para obtener la esquema de diluciones a realizar
dilución al ½ correspondiente (figuras 2-9) Puesto
23
que 1 ml de la SAT también será necesario para
preparar la primera placa del rango, se requiere un
volumen de SAT superior a los 4 ml. (Tabla 5,
columna 4)
Peso del
Concentración Volumen Peso del
antibiótico activo
de solución a final antibiótico
Rango de (deberá
preparar necesario total corregido
Antibiótico diluciones posteriormente Solvente Fig.
(rango superior de solución por el dato de
(µg/ml) corregirse con el
x 20) de ATB potencia
dato de potencia)
(µg/ml) (ml) (mg)
(mg)
Ampicilina 5120*
0.12-256 5 25,6 (5 x5120) Ver formula 1 Agua 2
(AMP) (256X20)
c
1.6 (5 x640)
Cefotaxima 320
0.008-16 5a Pesar 10 veces Ver formula 1 Agua 3
(CTX) (16X20)
mas
Cloranfenicol 10240*
0.25-512 5 51,2 (5 x10240) Ver formula 1 Metanol 4
(CHL) (512X20)
c
4,0 (5 x800)
Ciprofloxacina 80
0.002-4 5a Pesar 10 veces Ver formula 1 Agua 5
(CIP) (4X20)
mas
TMP: 2560 b TMP:
3 7,680 (3 x2560)
Trimetoprima/ (64X40) metanol
0.03/57-
sulfametoxazol Ver formula 1 6
64/1216
(TMS) SMZ: 48640 b SMZ:
3 145,38 (3 x48640)
(1216X40) agua
Tetraciclina 10240*
0.25-512 5 51,2 (5 x10240) Ver formula 1 Metanol 7
(TET) (512X20)
Gentamicina 2560*
0.06-128 5 12,8 (5 x2560) Ver formula 1 Agua 8
(GEN) (128X20)
Estos rangos se establecieron en base a la epidemiología de la resistencia de Argentina
* Estas soluciones representan las soluciones de antibiótico de trabajo (SAT).
a: Estas soluciones requieren un paso previo (dilución o mezcla) para convertirse en la SAT por lo
que se podría prepara un volumen final menor a 5 ml (ver mas adelante).
b: De esta manera ambas soluciones se diluirán 1:2, obteniéndose la SAT de TMS con un volumen
final superior a los 5 ml requeridos para el ensayo del ejemplo
Para saber cual es exactamente la cantidad de En general los antimicrobianos se obtienen como
droga activa hay que calcularla utilizando el dato de sales. Esto significa que no todo el peso de la
potencia. (EJEMPLO: que un antibiótico tenga una droga en polvo será activo.
potencia de 930 µg/mg, implica que por cada
miligramo de polvo pesado sólo 930 µg serán
activos o tendrán actividad antimicrobiana)
(FORMULA 1)
24
FORMULA 1
Cálculo:
____ mg droga activa calculados (Tabla 5 columna 5) -------------- X= _____ µg de droga a pesar
(Tabla 5 columna 6)
Para pesar el antibiótico a ensayar se debe hacer Se debe evitar pesar cantidades muy pequeñas de
en balanza analítica bien calibrada, con una droga ya que estas acarrean alto error
precisión igual o superior al décimo de miligramo, Se recomienda utilizar el método de doble arresto
para efectuar la pesada
Generalmente al realizar la pesada se obtiene un
exceso o defecto de la droga activa , en tal caso se
debe aplicar la fórmula 2 para conocer el exacto
volumen de solvente a agregar para obtener la
concentración deseada
FORMULA 2
Cálculo:
Cálculo del solvente necesario para obtener la concentración deseada:
________ µg (cantidad de droga pesada) ---------------- X=_________ ml (vol. de solvente para disolver
(Dato experimental que surge de la pesada) la droga)
** Asegúrese de tomar todos los recaudos necesarios para el manejo de solventes distintos del agua
según indicaciones del fabricante **
El solvente a utilizar dependerá del tipo de droga. En algunos casos el límite de solubilidad del
antimicrobiano sólo permite preparar soluciones de
concentraciones bajas
25
de CTX, CIP, TMP, SMZ que deben realizar algún stock concentradas que luego se deben diluir para
paso previo antes de conseguir la SAT (ver a bajo). alcanzar la concentración necesaria para preparar
el rango deseado
En el caso de CTX y CIP la SAT se obtiene En el ejemplo de la Tabla 5 se pesan diez veces
diluyendo las soluciones preparadas (1/10 en el mas CTX y CIP para evitar pesar cantidades muy
ejemplo para CTX de la Tabla 5) y para pequeñas de droga ya que estas acarrean alto
trimetoprima / sulfametoxazol se debe mezclar un error.
volumen de cada droga para obtener la mezcla de
la concentración deseada (3 ml de c/u en el
ejemplo de la Tabla 5)
La SAT será en todos los casos la primera dilución Para determinar el número de concentraciones a
del rango (la más concentrada). El objetivo en este incluir en las pruebas de sensibilidad se
paso es obtener 11 diluciones al ½ sucesivas de la recomienda elegir el rango de concentraciones de
SAT. manera tal que incluya: los puntos de corte que se
enumeran en la Tabla 2 A de CLSI (M100-S17), el
rango de CIM de al menos una cepa patrón de
control de calidad (Tabla 3 de CLSI M100-S17) y
la CIM 50 y 90 para bacterias de características
similares a las cepas incógnitas (previamente
reportadas en la literatura o basadas en la
experiencia previa)
Para el ejemplo de la Tabla 5, tomar una gradilla Un esquema alternativo de dilución del antibiótico
con 11 tubos conteniendo 3 ml de agua. Colocar 3 se puede obtener en la Tabla 5 de CLSI M100-S17
ml de la SAT en el primero de los 11 tubos y
homogeneizar correctamente. Tomar 3 ml de este
tubo y transferirlos al segundo tubo de la serie,
homogenizar y pasar 3 ml al tercero. Repetir este
procedimiento hasta el último tubo. De esta manera
se deben obtener, incluida la SAT, 12 diluciones
consecutivas al ½ del antibiótico
Homogeneizar correctamente cada tubo por La mezcla agar-antibiótico debe ser colocada
inversión evitando la formación de burbujas y vierta rápidamente en las placas para evitar la
26
el contenido completo a una placa de Petri de 9 cm solidificación total o parcial de la misma dentro del
de diámetro. Si se formaran burbujas en la placa, recipiente de mezclado
pasar ligeramente la llama del mechero por la
superficie de la placa para eliminarlas. La placa de Petri debe alcanzar una profundidad de
3-4 mm con la mezcla agar-antibiótico
Importante: rotular cada placa con el valor de la Si las placas no se usan de inmediato se pueden
concentración final resultante (Tabla 5 columna guardar a 4 - 8ºC por no mas de 3 días El
2). Se debe marcar además cada placa de agar almacenamiento de las placas se debe hacer en
para conocer la ubicación de los inóculos en la bolsas de plástico para evitar su desecación. Las
misma placas conteniendo ácido clavulanico o
carbapenemes se deben preparar el dia de
realización de la CIM debido a la rápida
degradación (hidrólisis) de la droga. Otros
antimicrobianos particularmente lábiles son: ß-
lactámicos en general, y sulbactam y tazobactam
No se puede asegurar que todos los antibióticos
mantengan su actividad en estas condiciones, por
lo tanto siempre es necesario evaluar el estado de
los antibióticos mediante la prueba de cepas
patrones de control de calidad.
Antes de realizar la prueba, colocar las placas, Evite la sobre desecación de las placas
abiertas e invertidas, en una estufa de 35º C o en
un equipo de flujo laminar por al menos 30 minutos
para eliminar el exceso de humedad que pudieran
contener.
El inóculo estandarizado para el método de dilución Para la inoculación de las placas para la dilución en
en agar, se puede preparar permitiendo el agar se puede utilizar un replicador tipo Stern (que
crecimiento del microorganismo hasta la turbidez deposita simultáneamente múltiples inóculos) o
0,5 de la escala de McFarland o bien también puede realizarse con pipeta o ansa
resuspendiendo colonias directamente hasta calibrada. La siembra de los inóculos se realiza por
alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusión por “spot” en la superficie del agar (aproximadamente 2
discos µl de suspensión). Cada “spot” debe contener una
cantidad neta de 104 bacterias.
Control de calidad
Juntamente con las cepas incógnitas deberán
ensayarse las cepas de referencia que se
describen mas adelante para el control de calidad
del ensayo.
27
A partir del tubo con crecimiento logarítmico de Las suspensiones bacterianas preparadas
cada aislamiento, transferir pequeños volúmenes contendrán 1 x 108 UFC/ml.
(gotas) a un tubo con 3 ml de solución fisiológica
hasta obtener una turbidez comparable al estándar
0.5 de Mc Farland. Utilice para esta operación
pipetas Pasteur descartables.
IMPORTANTE: agitar muy bien el estándar antes Evitar extremos en la densidad del inóculo.
de proceder a la comparación.
i) Dilución 1/10 de la suspensión bacteriana (0.5 Mc
Farland)
Transferir 0.1 ml de cada inóculo ajustado en el Se obtendrá así una suspensión de ~1 x 107
punto h a un tubo con 0.9 ml de caldo o solución UFC/ml que será el inóculo de trabajo.
fisiológica. De esta manera se realiza una dilución
1/10 del inóculo ajustado,
Una vez ajustado, el inóculo debe utilizarse dentro Para evitar sobrecrecimiento bacteriano
de los 15 min.
La colocación de los inóculos obtenidos en el punto Recuerde agitar muy bien el inóculo de trabajo
2.1 en el pocillo del replicador.8 se realizará con antes de proceder a colocarlo en el pocillo del
pipeta automática, depositando con mucho cuidado replicador
400 µl de cada uno de ellos en el pocillo
correspondiente.
Se recomienda distribuir las cepas de referencia en
IMPORTANTE: asegurarse de no salpicar y varias posiciones de los pocillos (preferentemente
contaminar los pocillos continuos al que se distantes uno de otro) para monitorear toda la
está cargando. Y de anotar la posición del extensión de la placa
pocillo en el que se deposita cada inoculo (ver
esquema en la Figura10)
Pocillo del
Cepa Nro….
Replicador
Figura 10.
Esquema de distribución de los inóculos
28
k) Siembra de las placas
Se debe comenzar con la placa control que sólo Verifique que todas las placas estén secan antes
contiene agar Mueller Hinton y luego se de la siembra.
continuará con la serie de placas con Sembrando desde la placa con menor
antibiótico comenzando con aquella que posea concentración de antibiótico se reduce la
la menor concentración. posibilidad de efecto “carry over”. De todas
maneras se debe inocular una segunda placa
control de viabilidad al finalizar la serie
(corresponde a la placa sin antibiótico del la droga
siguiente), para confirmar que no hubo
contaminación ó un significativo efecto "carry over"
de antibiótico durante el procedimiento
IMPORTANTE: mirar periódicamente que todos Cada clavo del replicador de Stern deposita
los clavos estén depositando la microgota de aproximadamente 2 µl, como el inóculo utilizado
inóculo. tiene 1 x 107 UFC/ml (ver punto 2.1.9), por cada
“spot” quedarán aproximadamente 2 x 104
bacterias que es el inóculo recomendado.
l) Incubación
m) Lectura e interpretación
Para determinar el punto final, las placas se deben Si persisten dos o más colonias en
colocar sobre una superficie oscura y opaca. La concentraciones superiores al aparente punto final,
CIM se registrará como el valor de la menor o si se encuentra desarrollo a altas
dilución que inhibe completamente el desarrollo concentraciones y no a bajas, se debe controlar la
bacteriano pureza del cultivo y probablemente deba repetirse
la prueba.
29
Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden Este fenómeno ocurre por que pueden arrastrarse
permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se sustancias antagónicas de la síntesis del ácido
ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final fólico
en estos casos corresponderá a la concentración
en la que haya más del 80 % de reducción del
crecimiento comparando con el control.
30
Figuras
Figura 2
Dilución en Agar - AMPICILINA
1. Preparación de la dilución (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml
____ml
de H20
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
l
l
l
l
m
m
m
m
m
1
1
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación 256
µg/ml
del ATB/
ATB/agar
en la placa
Figura 3
Dilución en Agar - CEFOTAXIMA
1. Preparación de la dilución (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml
____ ml
Dil 1/10
de H20
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
l
l
l
l
m
m
m
m
m
1
1
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
16
en la placa µg/ml
31
Dilución en Agar - CLORANFENICOL Figura 4
1. Preparación de la dilución (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml
____ml
de Metanol
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
l
l
l
l
m
m
m
m
m
1
1
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar 512
en la placa µg/ml
Figura 5
Dilución en Agar - CIPROFLOXACINA
1. Preparación de la dilución (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml
____ ml
de H20
l
l
l
l
m
m
m
m
m
1
1
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
4
en la placa µg/ml
32
Dilución en Agar – TRIMETOPRIMA (TMP) / SULFAMETOXASOL (SUL) Fig. 6
1. Preparación de la dilución (*) caldo, agua
____ ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
de Metanol 3 ml
3 ml
TMP act._____mg
Dil 1/2
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
____ ml
de H20 3 ml SAT 640/12160 160/3040 40/760 10/190 2.5/47.5 0.625/11.875
1280/24320 µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml
µg/ml 320/6080 80/1520 20/380 5/95 1.25/23.75
µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml
SUL act._____mg
l
l
l
l
m
m
m
m
m
1
1
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*
SAT
32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 ____ ____ (*) agar
____MH
64
µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación 64
µg/ml
del ATB/
ATB/agar
en la placa
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formación de burbujas
Figura 7
Dilución en Agar - TETRACICLINA
1. Preparación de la dilución (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml
____ml
de Metanol
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
l
l
l
l
m
m
m
m
m
1
1
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa 512
µg/ml
33
Figura 8
Dilución en Agar - GENTAMICINA
1. Preparación de la dilución (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml
____ml
de H20
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
l
l
l
l
m
m
m
m
m
1
1
1
1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*
Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)
3.
Colocación
del ATB/
ATB/agar
en la placa 128
µg/ml
Dilucion 1/10
Policubetas de inóculos
del Replicador de Stenr
34
Planilla - Registro de Resultados: Método de dilución en agar y microdilución (CIM)
AISLAMIENTOS
AMP 2-8
CIM µg/ml Concentración inhibitoria
0.03-
CTX
0.12
CHL 2-8
mínima
0.004-
CIP
0.016
<0.5
TMS
/9.5
TET 0.5-2
GEN 0.25-1
35
2.2 Microdilución en caldo
Este método se denomina microdilución porque se utilizan pequeños volúmenes de caldo. La prueba
se realiza en policubetas de plástico estériles de fondo cónico o redondo.
MATERIALES
Equipos
• Mechero tipo Bunsen
• Pipetas Pasteur plásticas descartables
• 1 Reservorio con 12 compartimientos
• 5 Reservorios sin compartimientos
• Micropipeta multicanal para 12 y 8 puntas
• Microplacas de 96 pocillos fondo redondo esteriles
(1) Preparar el caldo M. Hinton a partir de la base De los medios disponibles se considera al caldo M-
deshidratada de acuerdo a las recomendaciones Hinton el mejor para las pruebas de sensibilidad de
del fabricante. Esterilizar en autoclave. rutina dado que:
• Muestra buena reproducibilidad lote a lote en
las pruebas de sensibilidad.
• Contiene bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.
• Es adecuado para el desarrollo de la mayoría
de las bacterias patógenas.
• Existen suficientes datos recopilados que
avalan la experiencia de las pruebas de
sensibilidad realizadas en este medio.
pH: El caldo debe tener un pH 7,2 - 7,4 a El pH para cada lote debe ser controlado cuando
temperatura ambiente. Determinar el pH después se prepara cada lote de medio. Si el pH es
de su preparación. demasiado bajo, ciertas drogas (p ej.
Aminoglucósidos, quinolonas y macrólidos)
parecerán menos activas; mientras otras (p ej.
tetraciclinas) parecerán tener mayor actividad. Si el
pH es demasiado alto se podrían esperar los
efectos opuestos. Ver Tabla 1
36
Si el pH está muy alejado del rango aceptable
debe controlarse el procedimiento de la
preparación del medio.
Las correcciones necesarias serán realizadas por El agregado de largos volumenes de estas
el agregado de NaOH 1M o HCl 1M soluciones para correccion del pH puede alterar el
contenido de sales del medio.
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar Los medios que contienen excesiva cantidad de
cada lote de Mueller Hinton en su contenido de timina o timidina pueden revertir los efectos
Timidina se debe realizar la CIM de trimetoprima / inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima,
sulfametoxazol frente a Enterococcus faecalis produciendo así CIMes mas altas, lo cual puede
ATCC® 29212 o ATCC® 33186. El punto final en dar como resultado un informe de falsa resistencia.
estos casos corresponderá a la concentración en la
que haya más del 80 % de reducción del
crecimiento comparando con el control.
37
PROCEDIMIENTO
Se debe tener en cuenta que para la microdilucion, La solución de antibiótico se debe preparar de una
cada solución de antibiótico debe ser preparada 2 concentración tal que duplique la deseada (2X). De
veces más concentrada que la deseada en el esta forma, los pocillos serán cargados con 50 µl
pocillo de la solución del antibiótico y 50 µl del inoculo.
Este procedimiento se llevará a cabo mediante la Se deberá preparar una policubeta por cada cepa
utilización de la pipeta multicanal de doce puntas y a ensayar. Cada una será idéntica con respecto a
el correspondiente reservorio. los antibióticos que contengan.
De una vez se cargan las 12 diluciones del
antibiótico en la línea de la policubeta
correspondiente (ver figura 12). Rotular cada línea
de las policubetas con el nombre del antibiótico que
le colocó y las ubicaciones de la dilución menor y
mayor del rango.
38
El inóculo estandarizado para el método de
microdilución, se puede preparar permitiendo el
crecimiento del microorganismo hasta la turbidez
0,5 de la escala de McFarland o bien
resuspendiendo colonias directamente hasta
alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusión por
discos
Con pipeta de 0.1 o 0.2 ml, colocar 0.1 ml del Con esto se logra una dilución 1/100 del inóculo
inóculo ajustado al 0.5 de Mc Farland (1 x 108 6
ajustado (1 x 10 UFC/ml). Cuando se colocan 50
UFC/ml) en un tubo con 9.9 ml de caldo Mueller µl de esta suspensión a cada pocillo se obtendrá
Hinton ajustado en cationes. una concentración final de bacterias de
aproximadamente 5 x 105 UFC/ml (inóculo
recomendado) al ser diluida al medio por el
agregado de igual volumen de la dilución del
antibiótico
Control de calidad
Juntamente con las cepas incógnitas deberán
ensayarse las cepas de referencia para el
control de calidad del ensayo.
Tomar reservorios para pipetas multicanal sin La aplicación del inóculo se debe realizar dentro de
compartimientos (o placas de petri) y volcar en los 15 minutos posteriores a su ajuste
cada uno la dilución 1/100 de cada una de las
cepas preparadas en el punto 3.3
Importante: recordar que hay un pocillo control Cada policubeta debe incluir un pocillo de control
de caldo que sólo lleva 100 µl del caldo utilizado de crecimiento (sin antibiótico), y un control
para preparar las diluciones del antibiótico negativo (caldo sin inocular):
Control de caldo: contendrá 100 µl de caldo
Mueller Hinton ajustado con cationes.
Control de inòculo: contendrá 50 µl del inóculo de
trabajo preparado en el punto 2.2.3. y 50 µl de
caldo Mueller Hinton ajustado en cationes.
39
e) Incubación
Apilar las policubetas terminadas y colocar en la de Al finalizar la prueba, se debe sellar cada
arriba un film plástico. Incubar 16-20 hs a 35º C en policubeta con tapa plástica, película plástica
ambiente aeróbico. autoadhesiva o bolsa plástica para evitar la
desecación. Esta cubierta plástica debe permitir el
intercambio de temperatura
Para mantener una temperatura de incubación
uniforme, se recomienda no apilar más de cuatro
policubetas.
f) Lectura e interpretación
La CIM es la menor concentración de antibiótico Para determinar el punto final de desarrollo, debe
capaz de inhibir completamente el desarrollo compararse cada pocillo de la CIM con el pocillo
bacteriano en el pocillo, el punto final queda control de crecimiento. El ensayo se considera
definido a simple vista por la falta de turbidez del válido si en el pocillo control de crecimiento se
caldo. observa un botón de crecimiento o turbidez neta.
Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden Este fenómeno ocurre por que pueden arrastrarse
permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se sustancias antagónicas de la síntesis del ácido
ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final fólico
en estos casos corresponderá a la concentración
en la que haya más del 80 % de reducción del
crecimiento comparando con el control.
40
Figuras
Figura 11
Microdilución:
Microdilución:
diluciones del ATB
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml
____ml
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
SAT ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____
____ µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml
Antibiótico:_________ µg/ml
2 ml
(*) Caldo
Mueller
Hinton
ajustado en
cationes
50 µl
CIP 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 ,015 ,008 ,004 ,002
Caldo Inoc.
Controles (-) (+)
41
Figura 13
Microdilución
Preparación y Colocación del Pipeta multicanal
inóculo
5 ml
0,1 ml
1/100
Cc final del
Reservorio Inoculo
0.5 de 9.9 ml
McFarland de Caldo Mueller 5x105 UFC/ml
Hinton ajustado en
Cc:1x108 UFC/ml
cationes 50 µl
Cc:1x106 UFC/ml
Policubetas
Control de caldo
No agregar inóculo
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Planilla - Registro de Resultados: Método de dilución en agar y microdilución (CIM)
AISLAMIENTOS
AMP 2-8
CIM µg/ml Concentración inhibitoria
0.03-
CTX
0.12
CHL 2-8
mínima
0.004-
CIP
0.016
<0.5
TMS
/9.5
TET 0.5-2
GEN 0.25-1
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Referencias
1. Bauer A.W., Kirby W.M.M., Sherris J.C., Turck M. Antibiotic susceptibility testing by standardized
single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 1966, 45:493-496
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document M6-A. Wayne, Pennsylvania;1996.
3. Ericsson H.M., Sherris J,C,. Antibiotic susceptibility testing. Report of an international collaborative
study. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1971, 217(suppl B):1-90
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In: Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A. y cols. Manual of Clinical Microbiol., 6ta ed. Washington DC:
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test for bacteria that grow aerobically; approved standard. 7th ed. M7-A7. Clinical and Laboratory
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7. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2006. Performance standards for antimicrobial
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8. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2007. Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing; 17th informational supplement. M100-S17. Clinical and Laboratory Standards
Institute, Wayne, PA.
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