Manual de Procedimientos

Sensibilidad a los antimicrobianos

en Salmonella, Shigella y E. coli

2008
 AUTORES

Bioq. Fernando Pastern

Bioq. Marcelo Galas

Dto. Bacteriologa
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrn
Centro Regional de Referencia WHO-Global Salm Surv para
Amrica del Sur.

Sensibilidad a los antimicrobianos

Las pruebas de sensibilidad deben realizarse sobre microorganismos asociados a infecciones cuando
su sensibilidad no se pueda predecir a partir de su identificacin. La determinacin de la sensibilidad
est indicada en los casos en que el microorganismo causal de la infeccin pertenezca a una especie

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capaz de exhibir resistencia a los antibiticos de uso clnico. Los mecanismos de resistencia a los
agentes antimicrobianos incluyen: produccin de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de
accin y modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas. Para los microorganismos que posean
sensibilidad antibitica predecible se recomienda la aplicacin de la terapia emprica adecuada. Las
pruebas de sensibilidad tambin son importantes en estudios de epidemiologa de la resistencia y de
nuevos agentes antimicrobianos. Para realizar pruebas de sensibilidad e identificacin se debe partir
de un cultivo primario en medio slido y se debe procesar colonias aisladas de cada tipo de
microorganismo que pueda tener rol patgeno. No se deben realizar pruebas de sensibilidad sobre
mezclas de diferentes tipos de microorganismos, ni sobre el material clnico sin procesar, excepto
para emergencias clnicas donde la coloracin de Gram sugiera la presencia de un slo patgeno.
Cuando la prueba de sensibilidad haya sido realizada a partir del material clnico, se debe informar
como resultado preliminar y se debe repetir utilizando la metodologa estandarizada. No es
aconsejable la realizacin de pruebas de sensibilidad cuando no es clara la naturaleza de la infeccin
y la muestra contiene flora normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aislados
probablemente tengan poca relacin con el proceso infeccioso. En estos casos los resultados
obtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento.

1. Difusin por discos

INTRODUCCION
La metodologa empleada en la actualidad para la determinacin de la sensibilidad a los
antimicrobianos es el producto de importantes esfuerzos internacionales que, desde hace ms de
tres dcadas, estn enfocados a estandarizar la tcnica.
Un comit de expertos de la OMS y grupos colaborativos internacionales dirigidos por Ericsson y
Sherris sugirieron recomendaciones que fueron seguidas por la mayor parte de los pases europeos.
Sin embargo, la falta de un acuerdo general sobre los puntos de corte para la interpretacin de estas
pruebas contina siendo un tema de discusin a nivel internacional. Europa est dividida en varias
regiones de influencia con diferentes recomendaciones para la determinacin de sensibilidad
antimicrobiana: Grupo Sueco de Referencia en Antimicrobianos, el Sistema DIN, el de los pases
bajos, la Sociedad Britnica de Antimicrobianos, la Sociedad Francesa de Microbiologa y el Comit
de Estandarizacin de Laboratorios Clnicos (ex NCCLS, hoy denominado CLSI).
En la mayora de los pases de Latinoamrica se siguen las pautas del CLSI, en algunos casos, con
pocas modificaciones.
El siguiente es un resumen de la metodologa referida habitualmente como "Mtodo de la OMS", que
no difiere substancialmente del conocido "Kirby-Bauer". El documento que se ha tomado como base
es el M2 A9 del Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI, del ao 2006 y las Tablas de
interpretacin corresponden al suplemento M100 S17 del ao 2007.
El mtodo recomendado por el Subcomittee on Antimicrobial Susceptibility Testing del CLSI se basa
en los estudios de Bauer y colaboradores (1). Esta metodologa est descrita detalladamente y
cuenta con Tablas de interpretacin que estn respaldadas por una gran cantidad de datos clnicos y
de laboratorio. La modificacin de doble capa de Barry, Garca y Thrupp (2) es un mtodo alternativo
que demostr datos comparables de los dimetros de las zonas de inhibicin, con precisin similar al
del CLSI y con una correlacin satisfactoria con la CIM. Este mtodo es una alternativa aceptable
para la estandarizacin del inculo en las pruebas de sensibilidad de bacterias de rpido crecimiento,
como S. aureus, Enterobacterias y P. aeruginosa. El mtodo de doble capa en agar no es aplicable a
las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos de microorganismos con requerimientos
nutricionales especiales como Streptococcus spp., Haemophilus spp., etc.
Las Tablas para la interpretacin de los dimetros de inhibicin recomendadas por el CLSI (M100-
S17) se pueden utilizar para cualquiera de las dos metodologas descritas.
La difusin con discos es una metodologa muy sencilla pero requiere un estricto control de calidad
interno de cada uno de los pasos y los insumos que intervienen en su realizacin. El control de
calidad interno de las pruebas de sensibilidad por difusin es un requisito indispensable para validar
los resultados de los aislamientos clnicos. En muchos casos, variaciones pequeas en la calidad de
los reactivos o en algunos detalles metodolgicos, se traducen en resultados totalmente distintos a
los reales. El American Type Culture Collection (ATCC, USA) dispone de todas las cepas patrones
necesarias para llevar a cabo este proceso.

Indicaciones para la realizacion de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

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Las pruebas de sensibilidad contribuyen a orientar el tratamiento antimicrobiano de los procesos
infecciosos. No es necesario realizar pruebas de sensibilidad en aquellos casos en los que la
identificacin del microorganismo es suficiente para predecir la sensibilidad a los antimicrobianos (por
ejemplo S. pyogenes vs penicilina).
Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando, a pesar de conocerse la sensibilidad del
germen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicacin.
El antibiograma tambin puede ser indicado con fines epidemiolgicos y en el estudio de nuevos
antibiticos.
Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. No se debera realizar el
antibiograma en forma directa a partir del material clnico, excepto en las emergencias clnicas donde
la coloracin directa de Gram sugiere cultivo monobacteriano. En este caso, debe repetirse luego
usando la metodologa estandarizada.
En el caso particular de Salmonella sp., Shigella spp y Escherichia coli aisladas de materia fecal se
ha descrito resistencia a todos los antibiticos tiles para su tratamiento. Este hecho determina la
necesidad de realizar pruebas de sensibilidad en todos los casos. Estos patogenos producen
fundamentalmente diarreas pero su capacidad invasiva le confiere la posibilidad de hacer infecciones
sistmicas. El tratamiento antimicrobiano en cada una de estas situaciones clnicas es muy distinto y
por lo tanto tambin lo es la eleccin de los antibiticos a ensayar en el antibiograma.

Principios del mtodo

El principio del mtodo involucra la aplicacin de una cantidad determinada de antimicrobiano en un

reservorio (disco de papel, pastillas con drogas en estado cristalino, etc.) en la superficie del agar
sobre la cual se ha distribuido un inculo del microorganismo en cuestin; se formar as, por
difusin, un gradiente de concentracin de antimicrobiano alrededor del reservorio y la sensibilidad
del microorganismo estar indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento bacteriano.
El dimetro obtenido depender no slo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco,
sino tambin del espesor de la capa de agar Mueller Hinton, su pH y composicin, de la capacidad de
difusin de la droga en ese medio, de la temperatura y atmsfera de incubacin, de la velocidad de
duplicacin bacteriana, del tamao del inculo y la fase de crecimiento de la bacteria, etc. Todas
estas son las variables ms importantes que afectan el resultado del antibiograma.
Una vez colocado el disco en la superficie del agar, la difusin del antibitico que contiene comienza
instantneamente y sigue hasta alcanzarse un gradiente continuo de concentraciones alrededor del
reservorio. Este gradiente se alcanza aproximadamente a las 6 hs. El tamao de la zona de inhibicin
depender del equilibrio entre la difusin del antibitico y la velocidad de crecimiento del
microorganismo. Las recomendaciones del CLSI son: colocar los discos dentro de los 15 minutos de
inoculada la placa y proceder a la incubacin de la misma dentro de los 15 minutos posteriores a la
colocacin de los discos. Cualquier variacin en estos tiempos ocasionar un desplazamiento del
equilibrio antes mencionado que se traduce en errores en el tamao de la zona de inhibicin. Como la
difusin del disco comienza instantneamente despus de apoyado sobre el agar, estos nunca deben
levantarse para cambiarlos de lugar en el antibiograma porque seguramente ya no tendrn la carga
de antibitico original.
Para que los resultados sean confiables los procedimientos debern ser controlados cuidadosamente
y las Tablas de interpretacin tendrn validez nicamente cuando la metodologa utilizada en el
laboratorio sea estrictamente comparable con la aplicada en la elaboracin de dichas Tablas.

Fundamentos para la interpretacion de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por

el metodo de difusion

Para cada antimicrobiano se establecen "concentraciones crticas" o "puntos de corte" que permiten
separar a los microorganismos en tres categoras, sensibles, resistentes o de sensibilidad intermedia.
Estas categoras se establecen para cada bacteria frente a cada antibitico comparando la CIM en
cada caso con los puntos de corte establecidos.

*Sensible: Un microorganismo se considera "sensible" a un antibitico cuando se puede esperar que

una infeccin causada por el mismo responda al tratamiento con dicho frmaco a la dosis
recomendada.

*Resistente: este trmino indica que no es probable que la infeccin causada por el microorganismo
responda al antibitico en cuestin, cualesquiera que sean la dosis y la localizacin de la infeccin.

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*La categora sensibilidad intermedia se aplica a dos situaciones. Por un lado, se incluyen en ella las
cepas con sensibilidad disminuida a un antibitico que puede utilizarse con xito, para el tratamiento
en dosis ms altas, por ser poco txico o porque se concentra en el foco de infeccin (por ejemplo,
antibiticos -lactmicos o quinolonas en la orina).
En esta categora se incluyen asimismo las cepas de "sensibilidad intermedia" a antibiticos que, por
ser ms txicos, no puede usarse en dosis ms altas. En este caso, la categora intermedia sirve
como una zona de transicin entre las cepas sensibles y las resistentes y previene pequeos errores
causados por factores tcnicos. Muchas veces un resultado intermedio requiere la definicin de la
sensibilidad mediante el uso de un mtodo cuantitativo como la CIM.

La decisin definitiva sobre el uso de un determinado antibitico y sobre la dosificacin del mismo no
slo depende de los resultados de las pruebas de sensibilidad sino tambin de la interpretacin de
las mismas por el equipo de salud. Tambin habr que tener en cuenta otros factores como el rol
patognico del microorganismo, los efectos secundarios y las propiedades farmacocinticas del
medicamento, su penetracin a los diferentes sitios de infeccin y el estado inmunitario del husped,
etc.

Seleccion de los agentes antimicrobianos para las pruebas de sensibilidad

La seleccin de los agentes antimicrobianos apropiados para la prueba de difusin, es una decisin
de cada laboratorio clnico en consulta con el cuerpo mdico, el comit de farmacia y el comit de
enfermedades infecciosas.
Para la seleccin de los antimicrobianos a ensayar en las pruebas de sensibilidad se deben tener en
cuenta las siguientes consideraciones: eficacia clnica, prevalencia de resistencia, costo, indicaciones
del FDA, recomendaciones consenso para drogas de primera eleccin y alternativos.

Se pueden obtener resultados incorrectos (sensibilidad in vitro, falla teraputica in vivo) cuando se
ensayan determinados agentes antimicrobianos con ciertos microorganismos. Algunos ejemplos de
estas combinaciones incluyen: cefalosporinas de 1ra. y 2da. generacin y aminoglucsidos frente a
Salmonella spp. y Shigella spp. Por ello se resume las drogas con actividad frente a Salmonella y
Shigella spp.:
Aminopenicilinas (Ampicilina)
Trimetoprima/sulfametoxazol
Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina)
Fosfomicina
Tetraciclinas (Tetraciclina)
Cloranfenicol (slo para aislamientos de infeccin sistmica de Salmonella)
Nitrofuranos (solo para aislamientos de Shigella)
Cefalosporinas de tercera generacin (cefotaxima/ceftriaxona solo para aislamientos de
infeccin sistmica)

Otras drogas inapropiadas para tratamiento de diarreas pueden ser probadas para proveer datos
taxonmicos o informacin epidemiolgica (como es el caso de la gentamicina). Sin embargo, tales
resultados debern estar disponibles slo para el laboratorio o para el comit de control de
infecciones. El ensayo de algunas drogas es muy til como indicador de la presencia de mecanismos
de resistencia de difcil deteccin. Son ejemplos de estos casos: cido nalidixico para detectar
sensibilidad disminuida a las fluorquinolonas y ceftacidima o el disco de amoxicilina/ ac. clavulnico a
30 mm del disco de una cefalosporina de tercera generacin o disco de cefpodoxima como
detectores de -lactamasas de espectro extendido (Famiglietti A, et al. Consensus for antimicrobial
susceptibility testing for Enterobacteriaceae. Subcommittee on Antimicrobials, SADEBAC (Argentinian
Society of Clinical Bacteriology), Argentinian Association of Microbiology. Rev Argent Microbiol. 2005
Jan-Mar;37(1):57-66.). Una ventaja adicional del disco de cefpodoxima es su alta sensibilidad para
detectar cepas de Salmonella y/o Shigella productoras de ampC plasmidicos (Rapoport etr al, CMY-2
type -lactamase finally emerging in Argentina, aceptado para publicacion en Int. J. Antimicrob.
Agents)
Para la realizacin de una adecuada prueba de sensibilidad, el nmero de agentes probados debe
ser limitado. En general, deber incluir slo un representante de cada grupo de drogas relacionadas
que tengan muy similar actividad y para las cuales la interpretacin podra ser la misma.

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MATERIALES

Equipos

Ansas para inocular tipo loop (1-10 l)

Pinzas
Mechero tipo Bunsen
Regla o calibre
Pipetas Pasteur plsticas descartables

Soluciones, reactivos y medios de cultivo

Solucin fisiolgica estril, 3 ml en tubos

Caldo apropiado (tripteina soja (soya) u otro) esteril ,4 5 ml en tubos
Placas con agar Mueller Hinton (profundidad del agar de 4 mm )
Discos de antibiticos
Estndar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland

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 Preparacin del Agar Mueller Hinton
(1) Prepar el agar M. Hinton a partir de la base
deshidratada de acuerdo a las recomendaciones
del fabricante.
(2) Inmediatamente despus de esterilizar dejar
enfriar en bao de agua hasta 45-50C.
(3) Dispensar el medio en las placas de Petri de
fondo plano hasta un nivel aproximado de 4 mm.
Esto corresponde a 60 - 70 ml de medio para
placas de 150 mm. de dimetro y 25 a 30 ml. para
las de 100 mm. de dimetro interno.
(4) Las placas que no se usan en el da pueden
mantenerse en refrigerador (2-8 C.).
(5) Las placas con ms de 7 das de preparacin
no son adecuadas para las pruebas de sensibilidad
salvo que sean envueltas en bolsas de plstico
para evitar la desecacin, de lo contrario debern
controlarse con los microorganismos de referencia
(6) Debe controlarse la esterilidad de una muestra
representativa de cada lote incubando 24 horas o
Comentarios tericos
De los medios disponibles se considera al agar M-
Hinton como el mejor para las pruebas de
sensibilidad de rutina dado que:
Muestra buena reproducibilidad lote a lote en
las pruebas de sensibilidad.
Contiene bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.
Es adecuado para el desarrollo de la mayora
de las bacterias patgenas.
Existen suficientes datos recopilados que
avalan la experiencia de las pruebas de
sensibilidad realizadas en este medio.
Aunque el agar M. Hinton es generalmente
confiable para las pruebas de sensibilidad, los
resultados obtenidos con algunos lotes pueden, en
ocasiones, variar significativamente. Si un lote de
medio no sustenta el adecuado crecimiento de los
microorganismos probados, los halos obtenidos en
las pruebas por difusin podran ser mayores
quedando fuera de los lmites de control de
calidad, conduciendo a resultados errneos.
Se ha demostrado que con volmenes mayores o
menores de agar, la prueba pierde reproducibilidad
ya que pequeas variaciones tienen efectos
significativos. Placas de espesores menores a los
4 mm producirn zonas de inhibicin ms grandes
a las esperadas pudiendo ocasionar falsa
sensibilidad al momento de interpretar los halos
obtenidos. El fenmeno opuesto se obtendr con
espesores mayores a los 4 mm.
Controle la profundidad de entre 2 a 5 placas del
total del lote preparado. Para medir la profundidad
introduzca dentro del agar un elemento fino, estril,
marcado en 3 y 5 mm de uno de sus extremos. El
rango de profundidad aceptado para la prueba de
difusin es de 3 a 5 mm.
Antes de colocar el medio en la placa de petri debe
asegurarse que la mesada donde est trabajando
est perfectamente nivelada. De no ser as, el agar
en las placas quedar inclinado conduciendo a
errores por la heterogeneidad del espesor del
mismo.
Las placas almacenadas en bolsas de plstico
tienen un perodo de uso de hasta 70 das.
7
ms a 30-35 C. Luego descar esas muestras.
pH: El agar Mueller Hinton debe tener un pH 7,2 -
7,4 a temperatura ambiente y debe determinarse
despus de su solidificacin.
Es ideal el uso de electrodos de superficie, pero
tambin resulta satisfactoria la determinacin del
pH del macerado de una alcuota solidificada de
agar, suficiente para que el bulbo del electrodo
quede totalmente sumergido.
Las correcciones necesarias se deben realizar por
el agregado de NaOH 1M o HCl 1M
Humedad: Si justo al momento de usar las placas
hay exceso de humedad en la superficie, stas se
deben colocar a 35C durante 10 - 30 min hasta
que desaparezcan las gotas de humedad
superficiales.
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar
cada lote de Mueller Hinton en su contenido de
Timidina se debe ensayar el Enterococcus faecalis
ATCC 29212 o ATCC 33186 frente al disco de
trimetoprima / sulfametoxazol.
Un medio satisfactorio mostrar un halo de
inhibicin claro y definido de 20 mm o ms.
En caso que se observe una zona de inhibicin <
20 mm podr procederse al agregado de timidina
fosforilasa o sangre lisada de caballo.
No deber observarse crecimiento de colonias
bacterianas o micticas. Para verificar la esterilidad
del medio, tome una muestra equivalente al 5-10%
del total del lote producido. Ignorar cualquier
contaminacin espordica; ej. una fraccin de
medio. Descartar el lote completo, si el nivel de
contaminacin es significativo (>10% del medio
controlado).
El pH para cada lote debe ser controlado cuando
se prepara cada lote de medio. Si el pH est por
debajo de 7,2, ciertas drogas (por ej.
aminoglucsidos, quinolonas y macrlidos)
parecern menos activas; mientras otras (p ej.
tetraciclinas) parecern tener mayor actividad. Si el
pH es demasiado alto se observarn los efectos
opuestos. Ver Tabla 1
Si el pH est muy alejado del rango aceptable
debe controlarse el procedimiento de la
preparacin del medio.
El mtodo a utilizar depender del tipo de equipo
disponible en cada laboratorio
Debe asegurarse que el electrodo de superficie
est adecuadamente calibrado.
El agregado de grandes volmenes de estas
soluciones para correccion del pH puede alterar el
contenido de sales del medio.
Las placas debern estar hmedas pero no
mostrar gotas sobre la superficie del medio ya que
distorsionarn las zonas de inhibicin.
Los medios que contienen excesiva cantidad de
timina o timidina pueden revertir los efectos
inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima,
produciendo as zonas ms pequeas, menos
ntidas o sin halo lo cual puede dar como resultado
un informe de falsa resistencia.
La timidina fosforilasa ya sea en su forma pura
(aislada) o contenida en la sangre lisada de caballo
eliminar los excesos de timidina presentes en el
medio. Este procedimiento mejorar la nitidez de
los halos y la confiabilidad de las pruebas de
sensibilidad para sulfonamidas y trimetoprima
frente a patgenos comunes.
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 Un agar Mueller Hinton con elevado contenido de
timina o timidina no podr ser utilizado para el
ensayo de trimetoprima, sulfonamidas o la
combinacin de ambas drogas pero podr
utilizarse para ensayar la actividad de cualquier
otro antimicrobiano.

Efectos por variacin en la composicin de La variacin en cationes divalentes principalmente

cationes divalentes. Las pruebas de control de
cadidad interno realizadas con cada lote de agar M.
Hinton deben estar de acuerdo con los rangos de
dimetros sugeridos para las correspondientes
cepas ATCC (ver Control de Calidad). Los
resultados de las pruebas con las cepas patrones
deben ser cuidadosamente observados para
detectar cualquier valor aberrante debido a la
composicin de cationes del medio de cultivo.
Ca++ y Mg++ afectarn los resultados con
tetraciclina, colistn y aminoglucsidos sobre todo
frente a P. aeruginosa. Un excesivo contenido de
cationes reducir la zona de inhibicin, mientras
que bajas concentraciones de cationes resultarn
en zonas de inhibicin mayores que las esperadas.
Un exceso de zinc podra reducir las zonas de
inhibicin de los carbapenems
Los rangos aceptables son los siguientes (Mtodo
de absorcin atmica o equivalente):
Ca++ = 20 -25 mg/L; Mg++ = 10 -12.5 mg/L.

Aspecto:
Antes de su utilizacin, se debe controlar que los Descartar los medios que presenten alguna de
medios de cultivo no presenten evidencia de: estas caractersticas
- Decoloracin
- Deshidratacin
- Rotura del agar
- Volumen insuficiente
- Heterogeneidad del espesor de la capa de agar
- Otros signos de deterioro

Tabla1
Variacin de la actividad de diferentes antimicrobianos con el cambio del pH
Se incluyen tambin antibiticos sin actividad frente a Salmonella y Shiegella spp.

AUMENTO DE LA ACTIVIDAD
pH cido pH alcalino

Amoxicilina Amicacina
Amplicilina Netilmicina
Carbenicilina Estreptomicina
Cloxacilina Tobramicina
Piperacilina Claritromicina
Tetraciclina Eritromicina
Doxiciclina Ac. Nalidixico
Minociclina Quinolonas Fluoradas
Nitrofurantoina

DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD
pH cido

Azitromicina
Claritromicina

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 Clindamicina
Metronidazol

CAMBIOS EN LA ACTIVIDAD
CON EL AUMENTO O DISMINUCION DEL pH
Penicilina
Cefalotina
Cefalexina
Cefoperazona
Ceftazidima
Ceftriaxona
Cloranfenicol
Polimixina B
Sulfonamidas
Trimetoprima

Conservacin de los discos Comentarios tericos

Los discos deben mantenerse refrigerados a 2 -
8C (si van a ser utilizados en los siguientes 7 das)
o en congelador (freezer) a -14 C o menos (para
conservacin a largo plazo).
Para mantener su potencia, todos los discos deben
mantenerse en congelador (freezer) especialmente
los que contienen drogas de la familia de los -
lactmicos. Slo los discos que se estn usando
diariamente pueden permanecer en el refrigerador

Los discos deben guardarse en contenedores
hermticos con desecante y ser sacados del
refrigerador o congelador (freezer) 1 2 horas
antes de su uso a fin de lograr un equilibrio en la
temperatura antes de ser abiertos los frascos o
contenedores
Este proceso evita la condensacin que podra
ocurrir cuando la humedad ambiente alcanza los
frascos fros. La mayora de las drogas
antibacterianas son ms sensibles a la exposicin
a un ambiente hmedo que a temperaturas
templadas. Los antimicrobianos ms afectados por
los problemas de conservacin son, en general, los
-lactmicos y dentro de esta familia, los
carbapenemes (meropenem e imipenem),
oxacilina, cefaclor, las combinaciones de -
lactmicos con inhibidores de -lactamasas
(amoxicilina/ac. clavulnico, ampicilina/sulbactam,
ticarcilina/ac. clavulnico, cefoperazona/sulbactam
y piperacilina/tazobactam) son los ms lbiles.

Cuando el indicador del desecante usado (por ej.

gel de slice) cambia de color debe interpretarse
como un exceso de humedad y reemplazarse.

Patrn de turbidez Comentarios tericos

Para estandarizar la densidad del inculo se usa Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland
una suspensin de sulfato de bario como estndar representa aproximadamente 108 UFC/ml para

10
de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland). bacterias de rpido crecimiento. La estandarizacin
de inculo es esencial ya que el tamao de la zona
de inhibicin es muy dependiente de la densidad
del inculo utilizado.

Preparar dicho estndar agregando 0,5 ml de BaCl2

0,048M (1,175% P/V BaCl2.2H2O) a 99,5 ml de
H2SO4, 0,18 M (0,36 N) (1% V/V). Verificar la
densidad correcta del estndar usando un
espectrofotmetro. La absorbancia a 625 nm debe
ser 0,08 a 0,10, para el estndar 0,5 de Mc
Farland. (Ver Tabla 2)

Distribuir en 4-6 ml dentro de tubos similares a los

usados para la preparacin de los inculos de las
cepas clnicas y mantener guardados a
temperatura ambiente y al abrigo de la luz.
Inmediatamente despus de su preparacin, los
tubos se deben sellar hermticamente para evitar
la evaporacin y concentracin de la suspensin.

Agitar vigorosamente con vortex o manualmente el

estndar antes de su uso para lograr una turbidez
homognea.

Reemplazar o verificar la confiabilidad de los Recordar que los patrones de turbidez de SO4Ba
estndares mensualmente. Descartar los tienen una vida til de aproximadamente un ao.
estndares, que presenten alguna evidencia de Luego de transcurrido este tiempo deben ser
evaporacin. Esto pude controlarse marcando los reemplazados por un nuevo lote.
tubos en el momento de la preparacin con una
marca a la altura del menisco. Si la evaporacin es
evidente, descartar los tubos.

Tabla 2 Preparacin de los estndares de Mc Farland

Estndar Volumen (ml) Equivalente en No de

No BaCl2 (1,175 %) H2SO4 (1 %) bacterias/ml (x108)
0.5 0.5 99.5 1.5
1 1.0 99.0 3
2 2.0 98.0 6
3 3.0 97.0 9
4 4.0 96.0 12
5 5.0 95.0 15
6 6.0 94.0 18
7 7.0 93.0 21
8 8.0 92.0 24
9 9.0 91.0 27
10 10.0 90.0 30

PROCEDIMIENTO

11
 Da 1
a) Preparacin del inoculo
A partir de 4 5 colonias bien aisladas y de igual
morfologa en un medio de aislamiento primario
preparar una suspensin en 4 5 ml de un caldo
apropiado (tripteina soja (soya) u otro) tocando la
parte superior de cada colonia.
Para esta operacin se puede utilizar ansa o
hisopo.
Incubar el tubo de cultivo a 35-37 C hasta que se
alcance o exceda la turbidez del estndar
equivalente al 0,5 de Mc Farland (2 - 4 h).
Alternativamente el inculo puede ser obtenido
directamente a partir de colonias seleccionadas de
una placa de cultivo no selectivo, de no ms de 18
a 24 horas de incubacin. Proceder a ajustar
directamente el inoculo (paso siguiente) sin
incubacin previa.
b) Estandarizacin del inculo
Ajustar la densidad de los cultivos que se
encuentran en fase logartmica, con solucin salina
o caldo, por comparacin visual hasta turbidez
equivalente al tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland.
Para facilitar este procedimiento, mire los tubos
contra un fondo blanco con una lnea negra como
contraste.
Importante: agitar muy bien el estndar de
turbidez antes de proceder a la comparacin
Utilizar para esta operacin las pipetas Pasteur
descartables y transferir unas gotas a un tubo con
solucin fisiolgica estril.
c) Siembra de las placas
Dentro de los 15 minutos despus de ajustado el
inculo, inocular las placas de Mueller Hinton con
un hisopo estril.
Presionar el hisopo contra las paredes del tubo a
fin de escurrir el exceso de inculo.
Sembrar la superficie seca del Mueller Hinton por
hisopado en tres direcciones para asegurar una
Comentarios tericos
Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a
partir de una cepa aislada. Se debera evitar
realizar el antibiograma en forma directa a partir
del material clnico, excepto en las emergencias
clnicas donde la coloracin directa de Gram
sugiere naturaleza monobacteriana. En este caso,
debe repetirse luego usando la metodologa
estandarizada.
Cuando se prueban discos de trimetoprima-
sulfametoxazol con este mtodo de preparacin
del inoculo de colonia aislada sin incubacion previa
en medio liquido, pueden arrastrarse sustancias
antagnicas que producen un crecimiento con
aspecto de niebla dentro de la zona del halo de
inhibicin.
Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland
representa aproximadamente 108 UFC/ml para
bacterias de rpido crecimiento.
La estandarizacin de inculo es esencial ya que el
tamao de la zona de inhibicin depende de la
densidad del inculo. Para la interpretacin de las
pruebas de sensibilidad con las tablas
recomendadas por el CLSI se requiere un inculo
confluente.
Nunca utilice inculos no estandarizados para el
hisopado de las placas. Evitar extremos en la
densidad del inculo. Los excesos o defectos en la
densidad del inculo producen cambios muy
grandes en los resultados finales del ensayo
Para evitar el sobrecrecimiento del inculo
bacteriano no excederse de los 15 minutos
Resultados reproducibles y confiables requieren
una distribucin homognea del inculo en las
12
completa y homognea distribucin del inculo. placas.

Esperar de 3 a 5 minutos, pero no ms de 15 min.

antes de aplicar los discos para que el exceso de
humedad superficial producido por la inoculacin
sea completamente absorbido

d) Colocacin de los discos

Colocar los discos sobre la superficie del agar con
pinza estril aplicando una ligera presin a una
distancia no menor a 24 mm desde un centro al
otro. La distancia al borde de la placa al disco no
debe ser menor de 14 mm
No deben colocarse ms de 5 discos por placa de
90 mm o 12 en placa de 150 mm.
Debido a que todas las drogas difunden casi
instantneamente, un disco no debe ser removido
una vez que tom contacto con la superficie del
agar. Si el disco es desplazado del lugar donde
tom contacto con el agar, la carga de antibitico
del mismo ser menor que la estandarizada, por lo
que se observara una tendencia a la falsa
resistencia.

La colocacin de los discos se realizar segn

figura 1

e) Incubacin de las placas

Llevar las placas a la estufa dentro de los 15

minutos posteriores a la colocacin de los discos.
Estas se deben incubar invertidas, a 35oC2 por 16
a 18 horas y en ambiente aerbico.

Figura 1
Esquema sugerido para la colocacin de los discos

CIP NIT FOS AMP

TET CTX CHL TMS

GEN NAL
Placa 2
Placa 1

CIP: ciprofloxacina; NIT: nitrofurantona; CTX: cefotaxima; GEN: gentamicina; TET: tetraciclina; FOS:
fosfomicina; AMP: ampicilina; TMS: trimetoprima/sulfametoxazol; NAL: cido nalidxico,
CHL: cloranfenicol. Este esquema tiene en cuenta el tamao de las zonas de inhibicin usuales que
producen los distintos antibiticos frente a Salmonella y Shigella spp. y est diseado de manera de
evitar la superposicin de las zonas de inhibicin producidas.

13
 Da 2
f) Lectura de las placas e interpretacin de
resultados
Examinar y verificar la pureza del inculo
Examinar y verificar que el crecimiento sea
confluente.
Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y
el inculo fue el correcto, las zonas de inhibicin
sern uniformemente circulares
Medir los dimetros de las zonas de inhibicin.
Para la lectura de los halos se deber tener en
cuenta el rea que no muestre desarrollo obvio a
ojo desnudo, no incluyendo velo de crecimiento o
colonias muy pequeas que puedan ser detectadas
slo con mucha dificultad en el borde de la zona de
inhibicin.
Cuando se prueban discos de
trimetoprima/sulfametoxazol no considerar en la
lectura un crecimiento del 20% o menos del
desarrollo total.
Los tamaos de las zonas de inhibicin sern
interpretados con las Tabla 2A. Los organismos se
informarn sensibles, intermedios o resistentes al
antimicrobiano ensayado segn corresponda.
Comentarios tericos
Las pruebas de sensibilidad deben ser realizadas
de cultivos puros. Si se produjera contaminacin
durante la realizacin del ensayo puede ser
fcilmente detectado examinando la placa del
antibiograma.
Las zonas de inhibicin debern ser
uniformemente circulares y el desarrollo
confluente. La presencia de colonias aisladas
indica un inculo bacteriano de densidad inferior al
estandarizado. Se deber repetir la prueba. Lo
mismo si el inculo bacteriano fuere ms denso
que el recomendado.
En algunas oportunidades en el antibiograma,
entre discos ubicados cercanos unos de otros
puede producirse alguna distorsin de las zonas de
inhibicin (por ejemplo antagonismo, sinergia,
induccin y/o inhibicin) y estas zonas de inhibicin
no se presentarn por ende uniformemente
circulares. Esta valiosa informacin adicional no
deber considerarse en la lectura de la zona de
inhibicin pero provee importante informacin
adicional sobre posible identidad bacteriana,
mecanismos de resistencia, etc.
Colonias mayores creciendo dentro de la zona de
inhibicin debern ser subcultivadas, identificadas
nuevamente y reevaluadas en cuanto a su
sensibilidad a los antimicrobianos.
Este fenmeno ocurre por que pueden arrastrarse
sustancias antagnicas de la actividad de esta
combinacin de drogas que determinan un
crecimiento con aspecto de niebla dentro de la
zona de inhibicin real.
Las interpretaciones de los dimetros de las zonas
de inhibicin son provistas por CLSI. Estas tablas
de interpretacin fueron obtenidas utilizando un
inculo estandarizado que da como resultado un
crecimiento confluente. Los puntos de corte para la
interpretacin de cada droga se deducen del
anlisis de regresin lineal resultante de mltiples
determinaciones de un amplio nmero de
aislamientos mediante el mtodo de referencia
(CIM) y la difusin por discos.
El documento del CLSI M100-S17 no incluye
puntos de corte para enterobacterias frente a
fosfomicina. En este caso los puntos de corte se
pueden obtener de otras normas (por ej. Sociedad
Francesa de Microbiologa). Del mismo modo, el
uso de pruebas de tamizaje para la presencia de
BLEE surge de la epidemiologia de Argentina con
14
 reportes de presencia de estas enzimas en estos
patogenos (Andres P. et al. Int J Antimicrob
Agents. 2005 Jun;25(6):501-7. Extended-spectrum
-lactamases in Shigella flexneri from Argentina:
first report of TOHO-1 outside Japan)

g) Informe de los resultados

Utilizar la planilla para el registro de los resultados

CONTROL DE CALIDAD

Propsito
El objetivo de un programa de control de calidad interno es el monitoreo de:
La exactitud y precisin de los procedimientos para realizar las pruebas de sensibilidad.
La calidad de los reactivos usados en las pruebas.
El desempeo de las personas que llevan a cabo los ensayos y la lectura de los resultados.
Estos objetivos son alcanzados principalmente por la utilizacin de cepas de referencia
seleccionadas por su estabilidad gentica y por su utilidad en los mtodos a ser controlados.

Cepas Control
Para controlar la precisin y la exactitud de las pruebas de difusin, se deben obtener de una fuente
confiable las siguientes cepas patrones para control de calidad:
E. coli ATCC 25922
P. aeruginosa ATCC 27853
S. aureus ATCC 25923
E. faecalis ATCC 29212
E. coli ATCC 35218
K. pneumoniae ATCC 700603

E. coli ATCC 35218 productor de -lactamasa se recomienda solamente para el control de calidad
de los discos que contengan la combinacin "-lactmico/Inhibidor de -lactamasa", entre estos
inhibidores se encuentran: cido clavulnico, sulbactam y tazobactam.
Cuando se prueben rutinariamente sulfonamidas, trimetoprima trimetoprima-sulfametoxazol, debe
controlarse, para cada lote nuevo de Mueller Hinton, los niveles de timina timidina. Para ello debe
utilizarse E. faecalis ATCC 29212 33186.
Las siguiente Tabla muestran algunas de las cepas utilizadas ms comnmente en el control de
calidad interno, los factores a evaluar y algunas de sus caractersticas.

Tabla 3. Microorganismos sugeridos para el control de calidad de las pruebas de sensibilidad a los
antimicrobianos

Cepa - Factores a evaluar: Propiedades

- Concentracin de cationes: Aumento de resistencia a
Pseudomonas aeruginosa
aminoglucsidos cuando aumenta la concentracin de calcio y
ATCC 27853
magnesio.

15
 - pH: Aumento de resistencia a aminoglucsidos cuando el pH del
medio disminuye.
No subcultivar, se seleccionan mutantes resistentes a las
penicilinas activas frente a Pseudomonas spp
Frente a un doble halo alrededor del disco de imipenem,
cambiar el lote de Mueller Hinton.
Escherichia coli
- Calidad de la prueba de sensibilidad
ATCC 25922
- Mide la carga de inhibidores de -lactamasas de los discos para
antibiograma. Probar slo frente a combinaciones de antibiticos
Escherichia coli
-lactmicos e inhibidores de -lactamasas como
ATCC 35218
ampicilina/sulbactama, amoxicilina/cido clavulnico, ticarcilina/
cido clavulnico, etc.
Staphylococcus aureus
- Calidad de la prueba de sensibilidad
ATCC 25923
Enterococcus faecalis - Concentracin de timidina: Este compuesto interfiere con la
ATCC 29212 actividad de trimetoprima y de sulfametoxazol.

Las cepas patrones para el control de calidad se deben probar y mantener de la siguiente
manera:
Las cepas de control de calidad se deben probar por la tcnica estandarizada de difusin en agar
descrita anteriormente. Los antibiticos a ensayar deben ser los mismos que se utilizan para los
aislamientos clnicos.

Las cepas de control de calidad de trabajo se deben conservar a 4 - 8C en agar tripticasa de soja
(soya) (no exigentes o fastidiosas) y se deben subcultivar semanalmente. Si las quiere almacenar por
tiempo prolongado, puede hacerlo de la siguiente manera: mantenga los cultivos a -20 C menos (p
ej.: Nitrgeno lquido) en medios adecuados (p ej.: 10-15 % de glicerol en caldo Tripticasa - Soja
(Soya), caldo al 50 % de Suero fetal bovino, en sangre de oveja defibrinada en leche descremada)
o en estado liofilizado minimizando de esta manera el riesgo de alterar su sensibilidad a los
antibiticos.

Los cultivos de trabajo deben ser reemplazados por lo menos una vez al mes a partir de cultivos
congelados, liofilizados o comerciales.

Antes de su utilizacin, las cepas patrones se deben sembrar sobre una placa de agar con el fin de
obtener colonias aisladas.

Los inculos para realizar los ensayos de sensibilidad con las cepas de referencia se deben
preparar siguiendo las mismas indicaciones que se utilizan para los aislamientos clnicos ya sea
permitiendo que el cultivo alcance fase logartmica o bien resuspender colonias provenientes de una
placa de 18-24 h de incubacin.

Las cepas de control de calidad pueden ser utilizadas para ensayar la precisin y la exactitud de las
pruebas de sensibilidad hasta tanto no presenten un cambio significativo en los dimetros de las
zonas de inhibicin que no puedan ser atribuidos a fallas metodolgicas o de calidad de los reactivos.
Si aparecen resultados inexplicables que sugieran un cambio en la sensibilidad propia del
microorganismo, se debe obtener un nuevo cultivo a partir de las cepas almacenadas.

Parmetros que se evaluan con las Parmetros que NO se evaluan

cepas de referencia para el control de eficientemente con las cepas de referencia
calidad para el control de calidad

A) Potencia de los antimicrobianos A) Problemas concernientes al antimicrobiano en

las pruebas de sensibilidad (por ej. discos, pocillos
B) Medios de cultivo o tubos: vacos, secos, sobre o subcargados).

16
1. pH
2. Cationes Ca++ y Mg++ B) Contaminacin espordica de los medios de
3. Contenido de timidina cultivo.
4. Factores de crecimiento, composicin del medio
5. Profundidad del agar para la prueba de difusin C) Mal funcionamiento momentneo del
por discos instrumental.

C) Condiciones de incubacin (temperatura y D) Presencia de NaCl en los caldos para la prueba

atmsfera) de oxacilina para Staphylococcus spp.

D) Inculo y tcnica de inoculacin. E) Lectura subjetiva de puntos finales poco

definidos (pej. halos de inhibicin difusos).
E) Contaminacin de los medios de cultivo.
F) Interpretacin de resultados, uso de criterios
F) Funcionamiento del instrumental. apropiados de interpretacin.

G) Medida del punto final G) Errores de transcripcin.

H) Errores tcnicos individuales.

Son numerosos los factores que pueden dar como resultado una alteracin en el tamao final de las
zonas de inhibicin. Las causas probables de algunas de ellas se indican a continuacin.

Efecto observado
Causas probables
con las cepas de referencia

Bajo inculo
Agrandamiento general de las zonas de inhibicin Volumen insuficiente del medio de cultivo
Sobrecarga de los discos

Alto inculo
Volumen excesivo del medio de cultivo
Disminucin general de las zonas de inhibicin
Inactivacin de la droga de los discos
Discos vencidos

Trimetoprima-Sulfametoxasol, disminucin del Exceso de timidina en el medio de cultivo. Se

tamao de la zona y/o aparicin de colonias corrige con el agregado (5%V/V) de sangre lisada
internas de caballo, rica en timidina fosforilasa.

Tetraciclinas, quinolonas fluoradas, colistina o

aminoglucsidos
- Disminucin de las zonas, especialmente -Exceso del contenido de cationes divalentes:
frente a Pseudomonas aeruginosa Ca++ y Mg++

- Aumento de las zonas - Escaso contenido de cationes divalentes

Aminoglucsidos, macrlidos
- Disminucin de las zonas pH menor a 7,2

Penicilinas y tetraciclinas
- Aumento de las zonas pH menor a 7,2

17
 Frecuencia de Realizacin de las pruebas de control de calidad con las cepas de referencia

Frecuencia de las pruebas Comentario

Cada vez que se introduce un nuevo lote de discos
de antimicrobianos a la rutina, este se debe
ensayar con las cepas patrn de control de calidad
apropiadas.
Las cepas patrn de control de calidad se deben
probar semanalmente y cada vez que se cambie
cualquier reactivo que intervenga en la realizacin
de las pruebas de sensibilidad; los discos de
antibitico a ensayar deben ser los mismos que se
utilizan de rutina para los aislamientos clnicos
En general se acepta que en una serie de pruebas
uno de cada veinte ensayos consecutivos de
control de calidad est fuera de los rangos
establecidos. Si aparece ms de un resultado fuera
de dichos rangos, se deben tomar medidas
correctivas.
Cuando un ensayo d como resultado halos de
inhibicin que estn fuera del rango aceptable, se
deben tomar medidas correctivas. Si la desviacin
se puede atribuir a un error obvio, como por
ejemplo discos o cepas de control anmalos,
contaminacin de la cepa control o atmsfera de
incubacin incorrecta, se debe repetir la prueba de
control de calidad.

Si dicha desviacin no se puede atribuir a un error

obvio, se debe continuar con los controles de
calidad diariamente hasta detectar la fuente de
error y documentar la solucin del problema.

La obtencin de resultados aceptables con las cepas de control de calidad no garantiza que
los resultados obtenidos con los aislamientos clnicos sean correctos.
Cuando se obtienen resultados de sensibilidad atpicos en un aislamiento clnico se debe
repetir la prueba y/o confirmar la tipificacin del mismo.

En la Tabla 4 se presentan las resistencias naturales de las enterobacterias ms comunes en la

clnica diaria. Estas resistencias muchas veces puede ayudar al bacterilogo a confirmar o no la
identificacin bacteriana. Cabe destacar que todos estos microorganismos pueden tener adems
resistencias adquiridas a varios de los antimicrobianos para los cuales las cepas salvajes son
sensibles.

Resistencias inusuales

Por otra parte se debe tener en cuenta que la resistencia a algunos antibiticos en determinados
microorganismos es sumamente inusual y debe, por lo tanto, repetirse. Si dicha resistencia se
confirma, el aislamiento debe derivarse a un centro de referencia para su confirmacin y
caracterizacin del mecanismo involucrado. Algunos ejemplos de estas combinaciones
microorganismo-droga incluyen resistencia a:

carbapenemes en cualquier enterobacteria.

cefalosporinas de tercera generacin en Shigella spp.
cefpodoxima en Salmonella o Shigella spp.
quinolonas fluoradas en Shigella spp. o Salmonella spp.

La deteccin temprana de este tipo de cepas permitir dar la voz de alarma y de esa manera elaborar
estrategias para evitar su diseminacin.
Cada laboratorio debera desarrollar sus propias reglas para detectar las posibles fallas en las
pruebas de sensibilidad y proceder as a su correccin.

18
 Tabla 4
Resistencias naturales en el gnero enterobacterias
GEN
AMP/ CAR MEZ TE
Organismo AMP CPG FOX CTG CFP IMP TOB AKN CHL SXT CIP NAL NTI POL
SUL TIC PIP T
NET
Citrobacter
Rc S-R R S S-R S S S S S S S S S S S S S
koserib
Citrobacter
Rc S-R S S R R S S S S S S S S S S S S
freundii
Enterobacter
c
aerogenes R S-R S S R R S S S S S S S S S S S S
y E. cloacae
Enterobacter
S-R S-R S S S-R S-R S S S S S S S S S S S S
agglomerans

E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S

Klebsiella spp. Rc S-R Rc S-R S S S S S S S S S S S S S S

Morganella
Rc S-R S S Rc S-R S S S S S S S S S S Rc Rc
morganii
Proteus
S S S S S S S S S S S S Rc S S S Rc Rc
mirabilis
Proteus
c c c c c
vulgaris y P. R S-R S S R S S S S S S S R S S S R R
penneri
Providencia c c c c c
R S-R S S R S-R S S S S S S R S S R R R
spp.
Salmonella
S S S S S S S S S S S S S S S S S S
spp.
c c c c
Serratia spp. R R S S R S-R S S S S S S R S S S R R

Shigella spp. S S S S S S S S S S S S S S S S S S
a Abreviaturas: S, sensible; R, resistente; S-R, sensible o resistente; AMP, ampicilina; AMP/SUL, ampicilina/sulbactam; CAR,
carbenicilina; TIC, ticarcilina; MEZ, mezlocilina; PIP, piperacilina; CPG, cefalosporinas de primera generacin; FOX, cefoxitina;
CTG, cefalosporinas de tercera generacin; CFP, cefoperazona; IMP, imipenem; GEN, gentamicina; TOB, tobramicina; NET,
netilmicina; AKN, amicacina; CHL, cloranfenicol; TET, tetraciclina; SXT, trimetoprima/sulfametoxazol; CIP, ciprofloxacina; NAL,
cido nalidxico; NTI, nitrofurnatoina; POL, polimixina.
b Ex C. diversus
c Muy inusual encontrar aislamientos sensibles a esta droga.

LIMITACIONES DEL METODO DE DIFUSION POR DISCOS

Grupos de microorganismos donde se puede aplicar la prueba de difusin por discos

El mtodo de difusin descripto en este documento ha sido estandarizado para patgenos de rpido
desarrollo.

Resultados incorrectos
Se pueden obtener resultados incorrectos cuando se ensayan determinados agentes antimicrobianos
con ciertos microorganismos. Algunos ejemplos de estas combinaciones incluyen: cefalosporinas de
1ra. y 2da. generacin y aminoglucsidos con Salmonella spp y Shigella spp. En estos casos si se
ensaya alguna de las drogas enumeradas el resultado de stas no deber incluirse en el informe al
mdico. Esto se debe a que pueden inducir a errores en la eleccin del tratamiento (falsa
sensibilidad)

Emergencia de resistencia
Algunos agentes antimicrobianos estn asociados con la emergencia de resistencia durante terapias
prolongadas. Ms an, aislamientos inicialmente sensibles podran transformarse en resistentes
dentro de los tres a cuatro das de haberse iniciado la terapia antimicrobiana

19
 Planilla - Registro de Resultados: Prueba de Difusin por discos

E. coli ATCC
Antimicrobiano Cepa Cepa Cepa Cepa
25922
Dimetro S,I, Dimetro S,I, Dimetro S,I, Dimetro S,I, Dimetro Rang
mm R mm R mm R Mm R mm o

Ampicilina 16-22

Trimtoprima-
sulfametoxazol 24-32

Acido
22-28
nalidixico*

Cloranfenicol 21-27

Fosfomicina -

Nitrofurantoina 20-25

Cefotaxima** 29-35

Gentamicina 19-26

Tetraciclina 18-25

Ciprofloxacina* 30-40

* Resistencia a Acido nlidixico indica generalmente sensibilidad disminuida a ciprofloxacina. Es importante que
esta sensibilidad disminuida sea informada al equipo medico ya que se han descrito fallas de tratamiento en
infecciones por Salmonella spp. con estas caractersticas (CLSI). Si se detectara un aislamiento de Salmonella
spp. o Shigella spp. con sensibilidad disminuida o resistencia, confirmar el hallazgo y enviarlo a un centro de
referenci para su estudio.
** Las cefalosporinas de tercera generacin se deben informar nicamente frente a aislamientos causantes de
infecciones sistmicas. Descartar previamente presencia de BLEE: Cefpodoxima se puede incorporar como
prueba de tamizaje de -lactamasas de espectro extendido y resistencia a cefalosporinas de tercera generacin.
En caso de presentarse resistencia a esta droga (halos < 17mm) se debe confirmar la presencia de BLEE
mediante el ensayo de CTX y CAZ con el disco de AMC entre ambos o en paralelo con los discos de
cefotaxima/ac. clav (CTC) y ceftazidima/ac. clav (CAC). Para la sospecha de BLEE en Salmonella spp y
Shigella spp., utilizar los puntos de corte especiales recomendados por CLSI para E. coli, Klebsiella spp. y P.
mirabilis frente a CTX y CAZ. Evaluar en un segundo paso tambin la sensibilidad a cefoxitina con el objetivo
de diferenciar la resistencia a cefpodoxima mediada por BLEE de la mediada por enzimas tipo AMP-C
plasmdico.

20
2. Mtodos de Dilucin
INTRODUCCION
Las tcnicas de dilucin en caldo o agar, se pueden utilizar para medir cuantitativamente la actividad
"in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Estos mtodos se basan en la
preparacin de una serie de tubos o placas con caldo o agar, respectivamente, a los cuales se les
agrega el antibitico (ATB) en distintas concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o
placas con una suspensin estandarizada del microorganismo en estudio. Las pruebas se examinan
despus de incubar 18 a 24 hs. a 35C y se determina la concentracin inhibitoria mnima (CIM) del
antimicrobiano frente al microorganismo ensayado. El resultado final no ende significativamente de la
metodologa empleada. Por ello, para obtener valores reproducibles intra e interlaboratorios, cada
detalle tcnico debe ser cuidadosamente controlado.
Las bases para la realizacin de estas metodologas derivan, en gran parte, de la informacin
generada por un estudio colaborativo internacional (1). Aunque estos mtodos son referenciales,
algunos son lo suficientemente prcticos para ser desarrollados tanto en los laboratorios clnicos
como en los de investigacin. Existen tambin sistemas comerciales que se basan, al menos en
parte, en los mismos conceptos y dan resultados equivalentes a los obtenidos con las tcnicas
descriptas en este documento...
El documento que se ha tomado como base es el M7 A7 del Clinical Laboratory Standards Institute
(CLSI) del ao 2006. Las Tablas de interpretacin corresponden al suplemento M100 S17 del ao
2007.
Las tcnicas que se describen en este documento fueron diseadas para ensayar bacterias de fcil
desarrollo despus de 18 - 20 hs. de incubacin en medio M. Hinton sin suplementos.

Indicaciones para realizar la prueba sensibilidad a los antimicrobianos por el metodo de CIM

La realizacin de una CIM esta justificada en las siguientes situaciones

1. Ausencia de metodologa ms sencilla por ejemplo, mtodo de difusin
2. Falta de estandarizacin
3. Uso de nuevos antibiticos
4. Falla inesperada de tratamiento
5. Perfiles inusuales (confirmacin)
6. Para vigilancia cuantitativa de la resistencia a los antimicrobianos
7. Infecciones severas que requieran la realizacin de pruebas bactericidas tales como poder
bactericida del suero, velocidad bactericida del suero, curva de muerte (endocarditis no
respondedoras a la terapia, uso de esquemas no convencionales, bacteriemias y meningitis en
inmunocomprometidos, osteomielitis crnicas, bsqueda de actividad sinrgica)

El valor de CIM obtenido por el mtodo de dilucin, orienta al medico tratante sobre que
concentracin de antibitico necesita alcanzarse en el sitio de infeccin para inhibir el desarrollo del
microorganismo infectante. La CIM, sin embargo, no representa un valor absoluto. La CIM real puede
estar entre la menor concentracin de antibitico que inhibe al microorganismo y la siguiente dilucin
inmediatamente inferior donde se observa desarrollo del mismo. Si por ejemplo, fueran probadas
diluciones al medio y se determina una CIM de 16 g/ml, el verdadero valor podra estar entre 16 y 8
g/ml. Debe tenerse en cuenta que a pesar de realizar las pruebas de dilucin bajo condiciones
cuidadosamente controladas, no siempre se obtienen los mismos resultados. Generalmente, la
reproducibilidad de esta prueba es de +/- 1 dilucin.
La metodologa ms comn para la determinacin de La CIM es la que utiliza diluciones seriadas al
medio (por ej. 1, 2, 4, 8,16 g/ml, etc.). Tambin existen otros esquemas de dilucin, que utilizan
unas pocas concentraciones (hasta dos), concentraciones "Breakpoint" o que agregan
concentraciones entre las que se ensayan normalmente (por ej. 4, 6, 8, 12, 16 g/ml) Los resultados
de estos mtodos alternativos pueden ser igualmente tiles; sin embargo, a veces son ms difciles
de controlar. Cuando se produce inhibicin del crecimiento con la menor concentracin utilizada, el
verdadero valor de la CIM no se puede determinar exactamente y debe informarse como igual o
menor que dicha concentracin. Cuando se ensayan concentraciones adicionales entre las usuales y
la CIM es una de esas concentraciones intermedias, la interpretacin de la prueba se debe hacer
despus de redondear el valor a la prxima superior dilucin al medio del esquema normal (por ej.
Una CIM de 6 g/ml se debe redondear a 8 g/ml y luego proceder a interpretar).

21
Cuando se informa al mdico el resultado de la CIM, el valor debe ser acompaado por su
correspondiente interpretacin (por ej. SENSIBLE, INTERMEDIO o RESISTENTE) que se obtiene
aplicando los criterios enumerados en las Tablas del CLSI. Cuando las CIMs se realizan con 4 o
menos concentraciones consecutivas, o con concentraciones no consecutivas, se debe informar la
correspondiente interpretacin. Si se desea se puede informar adems el rango de CIM ensayado

Eleccion del numero de concentraciones a ensayar

Las concentraciones a ensayar para un determinado antibitico, en general, deberan determinarse

de acuerdo a los puntos de corte que se enumeran en la Tabla 2A del documento M100-S17del CLSI,
pero el nmero final de concentraciones deber ser elegido por quien realiza la prueba. Se
recomienda elegir el rango de concentraciones de manera tal que incluya el rango de CIM de al
menos una cepa patrn de control de calidad. La eleccin del rango deber considerar los siguientes
puntos:

1. CIM usual de la combinacin germen/droga (CIM50 y 90),

2. Break point de sensibilidad y resistencia y
3. Rango aceptable de al menos una de las cepas ATCC ensayadas en paralelo con la/s cepa/s
incgnita/s (Tabla 3A del documento M100-S17 del CLSI)

2.1 Dilucin en agar

La dilucin en agar es un mtodo bien establecido para la determinacin de la sensibilidad a los
antimicrobianos (3,4). El agente antimicrobiano se incorpora dentro del medio con agar, de manera tal
que cada placa contenga una concentracin de antibitico diferente. Los inculos estandarizados de
los distintos microorganismos se pueden aplicar rpida y simultneamente sobre la superficie del
agar utilizando un replicador de Steers (5). La mayora de los replicadores existentes transfieren de
25 a 36 inculos a la vez por cada placa.

La preparacin, propiedades y control del agar M. Hinton y los estndares de turbidez se describen
en detalle para el mtodo de difusin. Para la dilucin en agar valen los mismos considerandos
descripto ut supra

MATERIALES

Equipos
Estndar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
Ansas para inocular tipo loop (1-10 l)
Mechero tipo Bunsen
Placas de Petri (9 cm de dimetro)
Pipetas Pasteur plsticas descartables
Pipetas de 0.1 ml (podrn utilizarse pipetas automticas)
Pipetas de 1 ml
Pipetas de 5 ml
Micropipetas hasta 1000l
Bao termostatizado (50-55 oC)
Replicador tipo Stern

Soluciones, reactivos y medios de cultivo

Solucin fisiolgica estril, 3 ml en tubos 13X100 mm (para la preparacin del inculo
estandarizado)
Tubos con 0.9 ml de caldo o solucin fisiolgica estril (para la dilucin 1/10 del inculo)
Placas de agar nutritivo (9 cm de dimetro)
Gradilla de 11 tubos 13x100mm con 3 ml de agua destilada (para la dilucin del ATB)
19 tubos con 19 ml de agar Mueller Hinton
Placas de Petri con Agar Mueller Hinton que contengan diluciones del ATB
Patrn de turbidez equivalente al 0.5 Mc Farland
Antimicrobianos de potencia conocida

22
 PROCEDIMIENTO
Da 1
a) Preparacin de las diluciones del antibitico
Las figuras 2 a 9 muestran los pasos secuenciales
para la preparacin de las diluciones de los
antibioticos comnmente utilizados para Salmonella
y Shigella
A modo de ejemplo se indican en la Tabla 5
columna 2 los rangos sugeridos para distintos atb
con actividad frente a Samonella
Para las pruebas de sensibilidad se debe conocer
el lote, la potencia (generalmente expresada en
g/ml, % UI/mg de polvo) y la fecha de
vencimiento de los antimicrobianos de referencia
b) Preparacin de la Solucin de Antibitico de
trabajo (SAT)
Para preparar la solucin de antibitico de trabajo
se debe tener presente el peso de droga activa y la
concentracin ms alta del rango deseado
corregido segn el volumen final requerido para el
ensayo (ver Tabla 5).
Se debe tener en cuenta que para la dilucin en
agar cada solucin de atb preparada debe ser 20
veces ms concentrada que la deseada en la
placa.
Por ello para considerar la pesada a efectuar
deber tenerse presente en primer lugar que la
solucin de antibitico a preparar deber ser de
una concentracin 20 veces superior a la del
rango superior deseado (20X). (Tabla 5, columna
3)
Para el caso particular de trimeptroprima/
sulfametoxazol (TMS) la solucin de antibitico a
preparar deber ser de una concentracin 40
veces superior a la del rango superior deseado de
cada uno de los componentes individuales (40X).
(Tabla 5, columna 3)
El volumen final de SAT requerido depender del
esquema de dilucin a seguir
En el caso propuesto en el ejemplo de la Tabla 5
las diluciones seriadas al involucran la
transferencia de 3 ml de la SAT para obtener la
dilucin al correspondiente (figuras 2-9) Puesto
Comentarios tericos
Los antibiticos estndar o de referencia se
pueden obtener directamente del laboratorio
productor o de otras fuentes comerciales. No se
recomienda la utilizacin de las preparaciones para
aplicacin parenteral.
La eleccin de la rangos deber tener en
consideracin la epidemiologa local
El almacenamiento de la droga debe hacerse
segn las recomendaciones del laboratorio
productor, o a una temperatura igual o menor a -
20C en un desecador (preferiblemente con vaco)
provisto de algn material desecante como gel de
slice o cloruro de calcio. Cuando se saca el
desecador del freezer se debe esperar que tome
temperatura ambiente antes de abrirlo para evitar
que el agua de condensacin humedezca las
drogas. Las tertraciclinas debern protegerse al
abrigo de la luz.
En general los antimicrobianos se obtienen como
sales. Esto significa que no todo el peso de la
droga en polvo ser activo. El dato de potencia
expresa la proporcin de droga activa en el total
del polvo
Ello es por que la solucin del antibitico se diluir
1/20 al ser incorporada al agar (1 ml de la solucin
de ATB + 19 ml del agar)
Puesto que para obtener la solucion de antibiotico
de trabajo (SAT) de TMS se mezclaran volmenes
iguales de las soluciones de trimetoprima (TMP) y
sulfametozaxol (SMZ). De esta manera ambas
soluciones se diluirn 1:2, obtenindose la SAT de
TMS
Esquemas alternativos de dilucin de las
soluciones de ATB se encuentran en la Tabla 5 del
documento M100-S17 del CLSI (2002). El volumen
final de SAT a preparar deber contemplar el
esquema de diluciones a realizar
23
que 1 ml de la SAT tambin ser necesario para
preparar la primera placa del rango, se requiere un
volumen de SAT superior a los 4 ml. (Tabla 5,
columna 4)

El peso de droga activa de cada antibitico (Tabla

5 columna 5) (deber posteriormente corregirse
con el dato de potencia) resulta de multiplicar el
volumen final necesario (Tabla 5 Columna 4) por
20 veces la concentracin superior del rango de
SAT (Tabla 5 Columna 3) por 20 veces el valor de
la concentracin superior del rango

Tabla 5 Ejemplo de rango sugeridos y clculo de las pesadas

Peso del
Concentracin Volumen Peso del
antibitico activo
de solucin a final antibitico
Rango de (deber
preparar necesario total corregido
Antibitico diluciones posteriormente Solvente Fig.
(rango superior de solucin por el dato de
(g/ml) corregirse con el
x 20) de ATB potencia
dato de potencia)
(g/ml) (ml) (mg)
(mg)
Ampicilina 5120*
0.12-256 5 25,6 (5 x5120) Ver formula 1 Agua 2
(AMP) (256X20)
c
1.6 (5 x640)
Cefotaxima 320
0.008-16 5a Pesar 10 veces Ver formula 1 Agua 3
(CTX) (16X20)
mas
Cloranfenicol 10240*
0.25-512 5 51,2 (5 x10240) Ver formula 1 Metanol 4
(CHL) (512X20)
c
4,0 (5 x800)
Ciprofloxacina 80
0.002-4 5a Pesar 10 veces Ver formula 1 Agua 5
(CIP) (4X20)
mas
TMP: 2560 b TMP:
3 7,680 (3 x2560)
Trimetoprima/ (64X40) metanol
0.03/57-
sulfametoxazol Ver formula 1 6
64/1216
(TMS) SMZ: 48640 b SMZ:
3 145,38 (3 x48640)
(1216X40) agua
Tetraciclina 10240*
0.25-512 5 51,2 (5 x10240) Ver formula 1 Metanol 7
(TET) (512X20)
Gentamicina 2560*
0.06-128 5 12,8 (5 x2560) Ver formula 1 Agua 8
(GEN) (128X20)
Estos rangos se establecieron en base a la epidemiologa de la resistencia de Argentina
* Estas soluciones representan las soluciones de antibitico de trabajo (SAT).
a: Estas soluciones requieren un paso previo (dilucin o mezcla) para convertirse en la SAT por lo
que se podra prepara un volumen final menor a 5 ml (ver mas adelante).
b: De esta manera ambas soluciones se diluirn 1:2, obtenindose la SAT de TMS con un volumen
final superior a los 5 ml requeridos para el ensayo del ejemplo

c) Clculo de la cantidad de droga activa.

Para saber cual es exactamente la cantidad de En general los antimicrobianos se obtienen como
droga activa hay que calcularla utilizando el dato de sales. Esto significa que no todo el peso de la
potencia. (EJEMPLO: que un antibitico tenga una droga en polvo ser activo.
potencia de 930 g/mg, implica que por cada
miligramo de polvo pesado slo 930 g sern
activos o tendrn actividad antimicrobiana)
(FORMULA 1)

El resultado de esta formula estima finalmente la

cantidad de droga a pesar

24
 FORMULA 1

Peso del antibitico total: _______(colunma 5 de Tabla 5)

Potencia: _________

Clculo:

________ g de droga activa (dato de potencia) --------------- 1mg droga

____ mg droga activa calculados (Tabla 5 columna 5) -------------- X= _____ g de droga a pesar
(Tabla 5 columna 6)

Para pesar el antibitico a ensayar se debe hacer Se debe evitar pesar cantidades muy pequeas de
en balanza analtica bien calibrada, con una droga ya que estas acarrean alto error
precisin igual o superior al dcimo de miligramo, Se recomienda utilizar el mtodo de doble arresto
para efectuar la pesada
Generalmente al realizar la pesada se obtiene un
exceso o defecto de la droga activa , en tal caso se
debe aplicar la frmula 2 para conocer el exacto
volumen de solvente a agregar para obtener la
concentracin deseada

FORMULA 2

Clculo:
Clculo del solvente necesario para obtener la concentracin deseada:

______ g de droga activa (Tabla 5 columna 3) ---------------- 1 ml

(Concentracin del antibitico en la primer placa 20X)

________ g (cantidad de droga pesada) ---------------- X=_________ ml (vol. de solvente para disolver
(Dato experimental que surge de la pesada) la droga)

Agregar el volumen calculado del solvente apropiado (Tabla 5 columna 7)

** Asegrese de tomar todos los recaudos necesarios para el manejo de solventes distintos del agua
segn indicaciones del fabricante **

El solvente a utilizar depender del tipo de droga. En algunos casos el lmite de solubilidad del
antimicrobiano slo permite preparar soluciones de
concentraciones bajas

Para las drogas que no son solubles en agua

(Tabla 5, columna 7), se debe proceder de la
siguiente manera:
1- Use solamente la cantidad mnima del solvente
(metanol, acetona, cloroformo, etc) necesaria para
solubilizar la droga.
2- Diluya hasta alcanzar el volumen final calculado,
con agua estril o con el buffer estril adecuado
como se indica en la formula 2 .

La mayora de las soluciones preparadas en el En general cuando se preparan soluciones de

ejemplo sern directamente las SAT con excepcin antibitico, se busca obtener soluciones madres

25
de CTX, CIP, TMP, SMZ que deben realizar algn stock concentradas que luego se deben diluir para
paso previo antes de conseguir la SAT (ver a bajo). alcanzar la concentracin necesaria para preparar
el rango deseado

En el caso de CTX y CIP la SAT se obtiene En el ejemplo de la Tabla 5 se pesan diez veces
diluyendo las soluciones preparadas (1/10 en el mas CTX y CIP para evitar pesar cantidades muy
ejemplo para CTX de la Tabla 5) y para pequeas de droga ya que estas acarrean alto
trimetoprima / sulfametoxazol se debe mezclar un error.
volumen de cada droga para obtener la mezcla de
la concentracin deseada (3 ml de c/u en el
ejemplo de la Tabla 5)

d) Preparacin de las diluciones del antibitico (ver

figuras 2 a 8 correspondientes a cada droga)

La SAT ser en todos los casos la primera dilucin
del rango (la ms concentrada). El objetivo en este
paso es obtener 11 diluciones al sucesivas de la
SAT.
Para determinar el nmero de concentraciones a
incluir en las pruebas de sensibilidad se
recomienda elegir el rango de concentraciones de
manera tal que incluya: los puntos de corte que se
enumeran en la Tabla 2 A de CLSI (M100-S17), el
rango de CIM de al menos una cepa patrn de
control de calidad (Tabla 3 de CLSI M100-S17) y
la CIM 50 y 90 para bacterias de caractersticas
similares a las cepas incgnitas (previamente
reportadas en la literatura o basadas en la
experiencia previa)

Para el ejemplo de la Tabla 5, tomar una gradilla Un esquema alternativo de dilucin del antibitico
con 11 tubos conteniendo 3 ml de agua. Colocar 3 se puede obtener en la Tabla 5 de CLSI M100-S17
ml de la SAT en el primero de los 11 tubos y
homogeneizar correctamente. Tomar 3 ml de este
tubo y transferirlos al segundo tubo de la serie,
homogenizar y pasar 3 ml al tercero. Repetir este
procedimiento hasta el ltimo tubo. De esta manera
se deben obtener, incluida la SAT, 12 diluciones
consecutivas al del antibitico

e) Colocacin del antibitico en el agar y

preparacin de las placas para la CIM (ver figuras 2
a 8 correspondiente a cada droga)

Tomar 12 tubos con 19 ml de agar Mueller Hinton

fundido y enfriado a 50-55 C (mantenerlos en el
bao termostatizado hasta su utilizacin). De a una
a la vez y empezando por la ms diluida, tomar las
diluciones preparadas en el punto 2.1.4 transferir
1ml de cada solucin a un tubo con 19 ml de agar
(dilucin 1/20)

Importante: no descartar el sobrante de las

soluciones de antibitico antes de finalizar el
ensayo. En caso de error durante la preparacin
de las placas (solidificacin total o parcial en el
tubo, etc) podria llegar a utilizarlas nuevamente

Homogeneizar correctamente cada tubo por La mezcla agar-antibitico debe ser colocada
inversin evitando la formacin de burbujas y vierta rpidamente en las placas para evitar la

26
el contenido completo a una placa de Petri de 9 cm
de dimetro. Si se formaran burbujas en la placa,
pasar ligeramente la llama del mechero por la
superficie de la placa para eliminarlas.
solidificacin total o parcial de la misma dentro del
recipiente de mezclado
La placa de Petri debe alcanzar una profundidad de
3-4 mm con la mezcla agar-antibitico

Importante: rotular cada placa con el valor de la
concentracin final resultante (Tabla 5 columna
2). Se debe marcar adems cada placa de agar
para conocer la ubicacin de los inculos en la
misma
Si las placas no se usan de inmediato se pueden
guardar a 4 - 8C por no mas de 3 das El
almacenamiento de las placas se debe hacer en
bolsas de plstico para evitar su desecacin. Las
placas conteniendo cido clavulanico o
carbapenemes se deben preparar el dia de
realizacin de la CIM debido a la rpida
degradacin (hidrlisis) de la droga. Otros
antimicrobianos particularmente lbiles son: -
lactmicos en general, y sulbactam y tazobactam
No se puede asegurar que todos los antibiticos
mantengan su actividad en estas condiciones, por
lo tanto siempre es necesario evaluar el estado de
los antibiticos mediante la prueba de cepas
patrones de control de calidad.

Este control (placa sin antibitico) permitir conocer

la viabilidad de los microorganismos a los cuales se
le evaluar la sensibilidad.
Preparar adems una placa con 20 ml de agar sin
antibitico Esta placa sin antibitico servir como
control de crecimiento. De esta manera se deben
obtener, por atb, 12 placas con las concentraciones
de antibitico comprendidas en el rango de la
segunda columna de la Tabla 2 y una placa sin
antibitico que se utilizar como control.

f) Secado de las placas

Antes de realizar la prueba, colocar las placas, Evite la sobre desecacin de las placas
abiertas e invertidas, en una estufa de 35 C o en
un equipo de flujo laminar por al menos 30 minutos
para eliminar el exceso de humedad que pudieran
contener.

g) Preparacin de los inculos (ver figura 9)

El inculo estandarizado para el mtodo de dilucin
en agar, se puede preparar permitiendo el
crecimiento del microorganismo hasta la turbidez
0,5 de la escala de McFarland o bien
resuspendiendo colonias directamente hasta
alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusin por
discos
Para la inoculacin de las placas para la dilucin en
agar se puede utilizar un replicador tipo Stern (que
deposita simultneamente mltiples inculos) o
tambin puede realizarse con pipeta o ansa
calibrada. La siembra de los inculos se realiza por
spot en la superficie del agar (aproximadamente 2
l de suspensin). Cada spot debe contener una
cantidad neta de 104 bacterias.

La inoculacin de las placas se realizar utilizando

un replicador de Stern

Control de calidad
Juntamente con las cepas incgnitas debern
ensayarse las cepas de referencia que se
describen mas adelante para el control de calidad
del ensayo.

h) Ajuste del inoculo al patrn de 0.5 Mc Farland

27
 A partir del tubo con crecimiento logartmico de Las suspensiones bacterianas preparadas
cada aislamiento, transferir pequeos volmenes contendrn 1 x 108 UFC/ml.
(gotas) a un tubo con 3 ml de solucin fisiolgica
hasta obtener una turbidez comparable al estndar
0.5 de Mc Farland. Utilice para esta operacin
pipetas Pasteur descartables.

IMPORTANTE: agitar muy bien el estndar antes Evitar extremos en la densidad del inculo.
de proceder a la comparacin.
i) Dilucin 1/10 de la suspensin bacteriana (0.5 Mc
Farland)

Transferir 0.1 ml de cada inculo ajustado en el Se obtendr as una suspensin de ~1 x 107

punto h a un tubo con 0.9 ml de caldo o solucin UFC/ml que ser el inculo de trabajo.
fisiolgica. De esta manera se realiza una dilucin
1/10 del inculo ajustado,

Una vez ajustado, el inculo debe utilizarse dentro Para evitar sobrecrecimiento bacteriano
de los 15 min.

j) Colocacin de los inculos (ver figura 9 y 10)

La colocacin de los inculos obtenidos en el punto
2.1 en el pocillo del replicador.8 se realizar con
pipeta automtica, depositando con mucho cuidado
400 l de cada uno de ellos en el pocillo
correspondiente.
IMPORTANTE: asegurarse de no salpicar y
contaminar los pocillos continuos al que se
est cargando. Y de anotar la posicin del
pocillo en el que se deposita cada inoculo (ver
esquema en la Figura10)
Recuerde agitar muy bien el inculo de trabajo
antes de proceder a colocarlo en el pocillo del
replicador
Se recomienda distribuir las cepas de referencia en
varias posiciones de los pocillos (preferentemente
distantes uno de otro) para monitorear toda la
extensin de la placa

Pocillo del
Cepa Nro.
Replicador

Figura 10.
Esquema de distribucin de los inculos

28
k) Siembra de las placas

IMPORTANTE: Se debe rotular cada placa de

agar antes de comenzar con la siembra para
conocer la ubicacin de los inculos en la
misma

Se debe comenzar con la placa control que slo
contiene agar Mueller Hinton y luego se
continuar con la serie de placas con
antibitico comenzando con aquella que posea
la menor concentracin.
Verifique que todas las placas estn secan antes
de la siembra.
Sembrando desde la placa con menor
concentracin de antibitico se reduce la
posibilidad de efecto carry over. De todas
maneras se debe inocular una segunda placa
control de viabilidad al finalizar la serie
(corresponde a la placa sin antibitico del la droga
siguiente), para confirmar que no hubo
contaminacin un significativo efecto "carry over"
de antibitico durante el procedimiento

IMPORTANTE: mirar peridicamente que todos
los clavos estn depositando la microgota de
inculo.
Cada clavo del replicador de Stern deposita
aproximadamente 2 l, como el inculo utilizado
tiene 1 x 107 UFC/ml (ver punto 2.1.9), por cada
spot quedarn aproximadamente 2 x 104
bacterias que es el inculo recomendado.

Las placas inoculadas se deben mantener a

temperatura ambiente hasta que el agar absorba el
lquido que acompaa al inculo pero no ms de 15
minutos

IMPORTANTE: no invertir ni inclinar las placas

hasta que la microgota de inculo se haya
absorbido.

l) Incubacin

Incubar las placas invertidas durante 16-18 hs a

35C en ambiente aerbico

Da 2 Comentarios tericos

m) Lectura e interpretacin

Para determinar el punto final, las placas se deben Si persisten dos o ms colonias en
colocar sobre una superficie oscura y opaca. La concentraciones superiores al aparente punto final,
CIM se registrar como el valor de la menor o si se encuentra desarrollo a altas
dilucin que inhibe completamente el desarrollo concentraciones y no a bajas, se debe controlar la
bacteriano pureza del cultivo y probablemente deba repetirse
la prueba.

No se debe considerar el desarrollo de una simple

colonia o una tenue pelcula causada por el
depsito del inculo.

29
Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden
permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se
ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final
en estos casos corresponder a la concentracin
en la que haya ms del 80 % de reduccin del
crecimiento comparando con el control.
Los resultados de CIM obtenidos sern
interpretados con la Tabla 2A, y los organismos se
informarn sensibles, intermedios o resistentes
frente al antimicrobiano ensayado
n) Informe de los resultados
Utilizar la planilla para el registro de los resultados
Este fenmeno ocurre por que pueden arrastrarse
sustancias antagnicas de la sntesis del cido
flico
El documento de la CLSI M100-S17no incluye
puntos de corte para todos los antibiticos
ensayados. En estos casos los puntos de corte son
asignados de acuerdo a un anlisis de la
distribucin poblacional y segn las propiedades
farmacocinticas y farmacodinamia del antibitico
30
Figuras

Figura 2
Dilucin en Agar - AMPICILINA
1. Preparacin de la dilucin (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

3 ml

____ml
de H20

3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*

SAT 2560 1280 640 320 160 80 40 20 10 5 2.5

5120 g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
AMP activa g/ml
___mg

l
l

l
l
m

m
m

m
m
1

1
1

1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*

SAT (*) agar MH

256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

3.
Colocacin 256
g/ml
del ATB/
ATB/agar
en la placa

Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

Figura 3
Dilucin en Agar - CEFOTAXIMA
1. Preparacin de la dilucin (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml

____ ml
Dil 1/10
de H20

3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*

SAT 160 80 40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.31 0.015

Sol Interm.
Interm. 320 g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
CTX activa 1920 g/ml
___mg g/ml
l

l
l

l
l
m

m
m

m
m
1

1
1

1
1

2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*

SAT (*) agar MH

16 8 4.0 2.0 1.0 0.5 0.25 0.12 0.06 0.03 0.016 0.008
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

3.
Colocacin
del ATB/
ATB/agar
16
en la placa g/ml

Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

31
 Dilucin en Agar - CLORANFENICOL Figura 4
1. Preparacin de la dilucin (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

3 ml

____ml
de Metanol

3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*

SAT 5120 2560 1280 640 320 160 80 40 20 10 5

10240 g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
CHL activo g/ml
___mg

l
l

l
l
m

m
m

m
m
1

1
1

1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*

SAT (*) agar MH

512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

3.
Colocacin
del ATB/
ATB/agar 512
en la placa g/ml

Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

Figura 5
Dilucin en Agar - CIPROFLOXACINA
1. Preparacin de la dilucin (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
3 ml

____ ml
de H20

Dil 1/10 3 ml* 3 ml*

9 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*

SAT 40 20 10 5 2.5 1.25 0.625 0.31 0.15 0.08 0.04

Sol. Intermedia 80 g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
CIP activa 800 g/ml
___mg g/ml
l

l
l

l
l
m

m
m

m
m
1

1
1

1
1

2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*

SAT (*) agar MH

4 2 1 0.5 0.25 0.12 0.06 0.03 0.015 0.008 0.004 0.002
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

3.
Colocacin
del ATB/
ATB/agar
4
en la placa g/ml

Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

32
 Dilucin en Agar TRIMETOPRIMA (TMP) / SULFAMETOXASOL (SUL) Fig. 6
1. Preparacin de la dilucin (*) caldo, agua
____ ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml
de Metanol 3 ml

3 ml
TMP act._____mg
Dil 1/2
3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*
____ ml
de H20 3 ml SAT 640/12160 160/3040 40/760 10/190 2.5/47.5 0.625/11.875
1280/24320 g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
g/ml 320/6080 80/1520 20/380 5/95 1.25/23.75
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
SUL act._____mg

l
l

l
l
m

m
m

m
m
1

1
1

1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*

SAT
32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 ____ ____ (*) agar
____MH
64
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

3.
Colocacin 64
g/ml
del ATB/
ATB/agar
en la placa
Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

Figura 7
Dilucin en Agar - TETRACICLINA
1. Preparacin de la dilucin (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

3 ml

____ml
de Metanol

3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*

SAT 5120 2560 1280 640 320 160 80 40 20 10 5

10240 g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
TET activa g/ml
___mg
l

l
l

l
l
m

m
m

m
m
1

1
1

1
1

2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*

SAT (*) agar MH

512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

3.
Colocacin
del ATB/
ATB/agar
en la placa 512
g/ml

Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

33
 Figura 8
Dilucin en Agar - GENTAMICINA
1. Preparacin de la dilucin (*) caldo, agua
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

3 ml

____ml
de H20

3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*

SAT 1280 640 320 160 80 40 20 10 5 2.5 1.25

2560 g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
GEN activa g/ml
___mg

l
l

l
l
m

m
m

m
m
1

1
1

1
1
2.
Colocacion
del ATB
en el agar
19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml* 19ml*

SAT (*) agar MH

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.12 0.06
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml) Volcar la totalidad del contenido del tubo (20ml)

3.
Colocacin
del ATB/
ATB/agar
en la placa 128
g/ml

Al volcar el contenido de los tubos en las placas evite la formacin de burbujas

Figura 9 Dilucin en Agar

Preparacin y colocacin del inculo
Gotas 0.1 ml

Dilucion 1/10

Bacteria 0.5 de 0.9 ml

en fase
logartmica McFarland de SF o caldo 400 l
Cc:1x108 UFC/ml Cc:1x107 UFC/ml

Policubetas de inculos
del Replicador de Stenr

Servicio ANTIMICROBIANOS INEI - Dr. Carlos G. Malbrn

34
 Planilla - Registro de Resultados: Mtodo de dilucin en agar y microdilucin (CIM)

AISLAMIENTOS

Antibitico Mtodo E. coli ATCC

Cepa Cepa Cepa Cepa
25922
CIM CIM CIM CIM CIM Rango
S,I,R S,I,R S,I,R S,I,R
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

AMP 2-8
CIM g/ml Concentracin inhibitoria

0.03-
CTX
0.12

CHL 2-8
mnima

0.004-
CIP
0.016
<0.5
TMS
/9.5

TET 0.5-2

GEN 0.25-1

35
 2.2 Microdilucin en caldo
Este mtodo se denomina microdilucin porque se utilizan pequeos volmenes de caldo. La prueba
se realiza en policubetas de plstico estriles de fondo cnico o redondo.
MATERIALES
Equipos
Mechero tipo Bunsen
Pipetas Pasteur plsticas descartables
1 Reservorio con 12 compartimientos
5 Reservorios sin compartimientos
Micropipeta multicanal para 12 y 8 puntas
Microplacas de 96 pocillos fondo redondo esteriles

Soluciones, reactivos y medios de cultivo

Solucin fisiolgica estril, 3 ml en tubos 13X100
Placas de agar Mueller Hinton (9 cm de dimetro, profundidad del agar de 4 mm )
Placas de agar nutritivo (9 cm de dimetro)
12 Tubos 13x100mm con 4,5 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes
Tubo con 9,9 ml de caldo Mueller Hinton ajustado en cationes
Estndar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland

Preparacin del caldo Mueller Hinton Comentarios tericos

(1) Preparar el caldo M. Hinton a partir de la base
deshidratada de acuerdo a las recomendaciones
del fabricante. Esterilizar en autoclave.
De los medios disponibles se considera al caldo M-
Hinton el mejor para las pruebas de sensibilidad de
rutina dado que:
Muestra buena reproducibilidad lote a lote en
las pruebas de sensibilidad.
Contiene bajo nivel de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.
Es adecuado para el desarrollo de la mayora
de las bacterias patgenas.
Existen suficientes datos recopilados que
avalan la experiencia de las pruebas de
sensibilidad realizadas en este medio.

(2) El caldo que no se usa en el da puede

mantenerse en refrigerador (2-8 C.).

(3) Controlar la esterilidad de una muestra No deber observarse crecimiento bacterianas o

representativa de cada lote incubando 24 horas o
mas a 30-35 C. Luego descar esas muestras.
mictico. Para verificar la esterilidad del medio,
tome una muestra equivalente al 5-10% del total
del lote producido. Ignorar cualquier contaminacin
espordica; ej. una fraccin de medio. Descartar el
lote completo, si el nivel de contaminacin es
significativo (>10% del medio controlado).

pH: El caldo debe tener un pH 7,2 - 7,4 a El pH para cada lote debe ser controlado cuando
temperatura ambiente. Determinar el pH despus se prepara cada lote de medio. Si el pH es
de su preparacin. demasiado bajo, ciertas drogas (p ej.
Aminoglucsidos, quinolonas y macrlidos)
parecern menos activas; mientras otras (p ej.
tetraciclinas) parecern tener mayor actividad. Si el
pH es demasiado alto se podran esperar los
efectos opuestos. Ver Tabla 1

36

El mtodo a utilizar depender del tipo de equipo
disponible en cada laboratorio
Las correcciones necesarias sern realizadas por
el agregado de NaOH 1M o HCl 1M
Efecto de la Timina o Timidina: Para evaluar
cada lote de Mueller Hinton en su contenido de
Timidina se debe realizar la CIM de trimetoprima /
sulfametoxazol frente a Enterococcus faecalis
ATCC 29212 o ATCC 33186. El punto final en
estos casos corresponder a la concentracin en la
que haya ms del 80 % de reduccin del
crecimiento comparando con el control.
El medio se considera adecuado si el valor de la
CIM es < 0.5/9.5 g/ml.
En caso que se observe una CIM > 0.5/9.5 g/ml
podr procederse al agregado de timidina
fosforilasa o sangre lisada de caballo.
Efectos por variacin en la composicin de
cationes divalentes. Las pruebas realizadas con
cada lote de caldo M. Hinton deben estar de
acuerdo con los lmites de control para las
correspondientes cepas ATCC (ver Control de
Calidad). Los resultados de las pruebas con las
cepas patrones deben ser cuidadosamente
observados para detectar cualquier valor aberrante
debido a la composicin de cationes del medio de
cultivo.
Si el pH est muy alejado del rango aceptable
debe controlarse el procedimiento de la
preparacin del medio.
El agregado de largos volumenes de estas
soluciones para correccion del pH puede alterar el
contenido de sales del medio.
Los medios que contienen excesiva cantidad de
timina o timidina pueden revertir los efectos
inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima,
produciendo as CIMes mas altas, lo cual puede
dar como resultado un informe de falsa resistencia.
La timidina fosforilasa ya sea en su forma pura
(aislada) o contenida en la sangre lisada de caballo
inactivar los excesos de timidita presentes en el
medio y la confiabilidad de las pruebas para
sulfonamidas y trimetoprima frente a patgenos
comunes, excepto para enterococos
La variacin en cationes divalentes principalmente
Ca++ y Mg++ afectarn los resultados con
tetraciclina, colistn y aminoglucsidos frente a P.
aeruginosa. Un excesivo contenido de cationes
aumentar las CIMes, mientras que bajas
concentraciones de cationes resultarn en CIMes
menores a las esperadas. Un exceso de zinc
podra aumentar las CIMes de los carbapenems
Los rangos aceptados son los siguientes (Mtodo
de absorcin atmica o equivalente):
Ca++ = 20 -25 mg/L; Mg++ = 10 -12.5 mg/L.
37
 PROCEDIMIENTO

Da 1 Comentarios tericos

a) Preparacin de las soluciones de antibitico

(figura 11)

Se debe tener en cuenta que para la microdilucion, La solucin de antibitico se debe preparar de una
cada solucin de antibitico debe ser preparada 2 concentracin tal que duplique la deseada (2X). De
veces ms concentrada que la deseada en el esta forma, los pocillos sern cargados con 50 l
pocillo de la solucin del antibitico y 50 l del inoculo.

Para pesar las drogas podrn utilizarse los

conceptos y formulas descriptos para la dilucin en
agar con la salvedad que la solucin de
antibitico a preparar deber ser de una
concentracin 2 veces superior a la del rango
superior deseado (2X). (Tabla 5)

Una vez preparada las diluciones del antibitico,

homegeinicelas perfectamente y con la misma
pipeta llene el correspondiente compartimiento del
reservorio de la pipeta multicanal comenzando por
la solucin mas diluida (Se debern utilizar
reservorios con 12 divisiones). Proceda de la
misma manera para las otras 11 diluciones. (ver
figura 11)

IMPORTANTE: Rotular los reservorios con el

nombre del antibitico que esta colocando y al
menos la ubicacin de la menor y mayor
concentracin del rango preparado.

Al finalizar todos los compartimientos (12) del

reservorio de la pipeta multicanal quedarn llenos.

Se utilizar un reservorio de 12 compartimientos

por cada antibitico a ensayar

b) Llenado de las policubetas con las diluciones del

antibitico (Figuras 11 y 12)

Este procedimiento se llevar a cabo mediante la Se deber preparar una policubeta por cada cepa
utilizacin de la pipeta multicanal de doce puntas y a ensayar. Cada una ser idntica con respecto a
el correspondiente reservorio. los antibiticos que contengan.
De una vez se cargan las 12 diluciones del
antibitico en la lnea de la policubeta
correspondiente (ver figura 12). Rotular cada lnea
de las policubetas con el nombre del antibitico que
le coloc y las ubicaciones de la dilucin menor y
mayor del rango.

c) Preparacin del inculo (ver figura 13)

38
El inculo estandarizado para el mtodo de
microdilucin, se puede preparar permitiendo el
crecimiento del microorganismo hasta la turbidez
0,5 de la escala de McFarland o bien
resuspendiendo colonias directamente hasta
alcanzar dicha turbidez (ver Prueba de difusin por
discos

Importante: agitar muy bien el estndar de

turbidez antes de proceder a la comparacin

Con pipeta de 0.1 o 0.2 ml, colocar 0.1 ml del
inculo ajustado al 0.5 de Mc Farland (1 x 108
UFC/ml) en un tubo con 9.9 ml de caldo Mueller
Hinton ajustado en cationes.
Con esto se logra una dilucin 1/100 del inculo
6
ajustado (1 x 10 UFC/ml). Cuando se colocan 50
l de esta suspensin a cada pocillo se obtendr
una concentracin final de bacterias de
aproximadamente 5 x 105 UFC/ml (inculo
recomendado) al ser diluida al medio por el
agregado de igual volumen de la dilucin del
antibitico

Control de calidad
Juntamente con las cepas incgnitas debern
ensayarse las cepas de referencia para el
control de calidad del ensayo.

d) Siembra de las policubetas de la microdilucin

(ver figura 13)

Tomar reservorios para pipetas multicanal sin La aplicacin del inculo se debe realizar dentro de
compartimientos (o placas de petri) y volcar en los 15 minutos posteriores a su ajuste
cada uno la dilucin 1/100 de cada una de las
cepas preparadas en el punto 3.3

Una vez cargados los reservorios, tomar de a uno

por vez y, con pipeta multicanal de 8 puntas,
colocar 50 l del inculo en todos los pocillos de
una de las policubetas preparadas

Importante: recordar que hay un pocillo control
de caldo que slo lleva 100 l del caldo utilizado
para preparar las diluciones del antibitico
Cada policubeta debe incluir un pocillo de control
de crecimiento (sin antibitico), y un control
negativo (caldo sin inocular):
Control de caldo: contendr 100 l de caldo
Mueller Hinton ajustado con cationes.
Control de inculo: contendr 50 l del inculo de
trabajo preparado en el punto 2.2.3. y 50 l de
caldo Mueller Hinton ajustado en cationes.

Repetir esta operacin con todas las cepas a

ensayar en sus respectivas policubetas

Importante: rotular cada policubeta con el

nombre de la cepa que le coloc.

39
e) Incubacin
Apilar las policubetas terminadas y colocar en la de
arriba un film plstico. Incubar 16-20 hs a 35 C en
ambiente aerbico.
f) Lectura e interpretacin
La CIM es la menor concentracin de antibitico
capaz de inhibir completamente el desarrollo
bacteriano en el pocillo, el punto final queda
definido a simple vista por la falta de turbidez del
caldo.
Cuando en una prueba de microdilucin se obtiene
un pocillo salteado, se debe leer la CIM ms alta.
Algunos antagonistas del medio de cultivo pueden
permitir un leve desarrollo bacteriano cuando se
ensaya trimetoprima o sulfonamidas. El punto final
en estos casos corresponder a la concentracin
en la que haya ms del 80 % de reduccin del
crecimiento comparando con el control.
Los resultados de CIM obtenidos sern
interpretados con la Tabla 2A y los organismos se
informarn sensibles, intermedios o resistentes
frente al antimicrobiano ensayado
g) Informe de los resultados
Utilizar la planilla para el registro de los resultados
Al finalizar la prueba, se debe sellar cada
policubeta con tapa plstica, pelcula plstica
autoadhesiva o bolsa plstica para evitar la
desecacin. Esta cubierta plstica debe permitir el
intercambio de temperatura
Para mantener una temperatura de incubacin
uniforme, se recomienda no apilar ms de cuatro
policubetas.
Para determinar el punto final de desarrollo, debe
compararse cada pocillo de la CIM con el pocillo
control de crecimiento. El ensayo se considera
vlido si en el pocillo control de crecimiento se
observa un botn de crecimiento o turbidez neta.
Si apareciera ms de un pocillo salteado con
alguna droga, esta no se debera informar.
Este fenmeno ocurre por que pueden arrastrarse
sustancias antagnicas de la sntesis del cido
flico
40
Figuras

Figura 11
Microdilucin:
Microdilucin:
diluciones del ATB

3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

3 ml

____ml

3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*

SAT ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____
____ g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml
Antibitico:_________ g/ml

2 ml

Reservorio para pipeta multicanal

(12 divisiones)

(*) Caldo
Mueller
Hinton
ajustado en
cationes

Servicio ANTIMICROBIANOS INEI - Dr. Carlos G. Malbrn

Microdilucin: Colocacin del ATB Fig 12

50 l

Servicio ANTIMICROBIANOS INEI - Dr. Carlos G. Malbrn

AMP 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12

CTX 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 ,015 ,008

512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25

CHL

CIP 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03 ,015 ,008 ,004 ,002

TMS* 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06 0,03

TET 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25

GEN 128 64 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 0,12 0,06

Caldo Inoc.
Controles (-) (+)

(*) Se indica rango de TMP

Se deber preparar una placa de microdilucin por cada cepa a estudiar

41
Figura 13
Microdilucin
Preparacin y Colocacin del Pipeta multicanal
inculo
5 ml

0,1 ml
1/100

Cc final del
Reservorio Inoculo
0.5 de 9.9 ml
McFarland de Caldo Mueller 5x105 UFC/ml
Hinton ajustado en
Cc:1x108 UFC/ml
cationes 50 l
Cc:1x106 UFC/ml

Policubetas
Control de caldo
No agregar inculo

Servicio ANTIMICROBIANOS INEI - Dr. Carlos G. Malbrn

42
 Planilla - Registro de Resultados: Mtodo de dilucin en agar y microdilucin (CIM)

AISLAMIENTOS

Antibitico Mtodo E. coli ATCC

Cepa Cepa Cepa Cepa
25922
CIM CIM CIM CIM CIM Rango
S,I,R S,I,R S,I,R S,I,R
g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml g/ml

AMP 2-8
CIM g/ml Concentracin inhibitoria

0.03-
CTX
0.12

CHL 2-8
mnima

0.004-
CIP
0.016
<0.5
TMS
/9.5

TET 0.5-2

GEN 0.25-1

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Referencias

1. Bauer A.W., Kirby W.M.M., Sherris J.C., Turck M. Antibiotic susceptibility testing by standardized
single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 1966, 45:493-496

2. NCCLS. Evaluating production lots of dehydrated Mueller Hinton agar; Approved standard NCCLS
document M6-A. Wayne, Pennsylvania;1996.

3. Ericsson H.M., Sherris J,C,. Antibiotic susceptibility testing. Report of an international collaborative
study. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1971, 217(suppl B):1-90

4. Woods G.L., Washington J.A., Antibacterial Susceptibility test: dilution and disk diffusion methods.
In: Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A. y cols. Manual of Clinical Microbiol., 6ta ed. Washington DC:
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7. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2006. Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing; approved standard 9th ed. M2-A9. Clinical and Laboratory Standards Institute,
Wayne, PA.

8. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2007. Performance standards for antimicrobial
susceptibility testing; 17th informational supplement. M100-S17. Clinical and Laboratory Standards
Institute, Wayne, PA.

44