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SG 3
SG 3
PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
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Taller de Genética III: Pruebas de diagnóstico molecular
Para resolver los problemas de este Taller se recomienda estudiar previamente los
fundamentos moleculares de la electroforesis de ácidos nucleicos y su uso en las técnicas de
Southern blot, PCR y secuenciación.
Ejercicio 1
Problema. Una pareja ha tenido dos hijos: una niña de diez años sana y un niño de cuatro
años con anemia de células falciformes. La mujer está esperando un nuevo hijo y se ha
realizado un muestreo de vellosidades coriónicas para determinar si su nuevo hijo (el
probando), heredará la enfermedad.
Se muestra el resultado de la prueba de diagnóstico tal como se describió previamente:
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A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de
cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cómo interpreta
el patrón de bandas en cada caso.
B- Con los datos obtenidos, dibuje el árbol genealógico de la familia
Ejercicio 2
Una vez identificada la amplificación en el número de repeticiones CTG como la base genética
de la DM, se ha realizado un gran esfuerzo para desentrañar cómo la expansión podría
producir la enfermedad.
Algunos grupos de investigación han demostrado que en células en cultivo, la expansión del
número de tripletes conduce a la ausencia del ARNm de la proteína MDPK i.
El mecanismo molecular responsable de este hecho se desconoce, aunque se cree que un
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elevado número de repeticiones CTG en el extremo 3’ del gen podría de algún modo producir
una disminución en la tasa de síntesis o de procesamiento del ARNm correspondiente.
Para realizar un estudio detallado de los portadores, a los individuos que figuran en el árbol
genealógico se les realizó una prueba de diagnóstico molecular. Partiendo de sangre periférica,
la prueba consiste en realizar un Southern blot, digiriendo al ADN con la enzima de restricción
NcoI y usando como sonda específica una secuencia que hibrida con una región del gen MDPK
muy cercana a la ubicación de los tripletes CTG.
El resultado se muestra a continuación. Los números corresponden con los individuos del árbol
genealógico. M: marcador de peso molecular
Problema. Una niña recién nacida presenta signos compatibles con la fibrosis quística, pero el
diagnóstico es controversial. Se decide realizar una prueba de diagnóstico molecular para
determinar la presencia de la mutación F508. La prueba consiste en amplificar mediante PCR una
región del gen que contiene el triplete CTT del exón 10. Los productos de amplificación se resuelven
luego en un gel de poliacrilamida.
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“Se utilizan primers adecuados para amplificar una región que contenga a la
zona de la sustitución. Los productos de amplificación se resuelven en un gel de
poliacrilamida”
Para realizar la búsqueda de la mutación G551D se utilizó PCR alelo específica. En este
abordaje experimental uno de los primers del par utilizado sólo puede hibridar con la secuencia
si está presente la mutación buscada. De modo tal que sólo habrá amplificación en ese caso, y
de allí viene el nombre de esta variante de la técnica de PCR.
El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica (los números hacen referencia los
individuos analizados):
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E- ¿Por qué hay un ‘doble pico’ en la posición mutada?
F- ¿Puede concluirse que la mutación hallada explica el diagnóstico clínico de
fibrosis quística? Discuta
Ejercicio 4
existen entonces, 6 109 bases diferentes entre dos personas ii . Esa variabilidad interindividual
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puede ser estudiada a nivel fenotípico, es decir, a través del producto génico, o a nivel
genotípico mediante el análisis directo del ADN. Uno de los objetivos del estudio de la
variabilidad humana de interés cada vez mayor con el curso de los años, es su aplicación en
pruebas de paternidad y otras relaciones genéticas y para la identificación de seres humanos
involucrados en hechos delictivos, ya sea como víctimas o criminales. Con esos objetivos, la
identificación se realizaba inicialmente con análisis morfológicos, bioquímicos e inmunológicos,
correspondientes éstos últimos a productos de genes ubicados en una fracción del genoma
menor del 10%. Quedaba así un 90% de ADN, no codificante, cuyo potencial para el estudio de
la variabilidad humana empezó a ser descubierto a partir de los años 80, cuando se reconoció
que estaba repleto de polimorfismos de secuencia que fueron puestos en evidencia con el uso
de las enzimas de restricción y los fragmentos de longitud variable que éstas generaban
(RFLP)iii.
El genoma humano nuclear extragénico está constituido por secuencias únicas y repetidas. Un
subgrupo de secuencias repetidas que representan aproximadamente el 60% de ellas, son las
secuencias repetidas en tándem, que constituyen un ADN altamente polimórfico y que abrieron
nuevas posibilidades, inimaginables para la identificación de marcadores con elevado poder de
discriminacióniv
;
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Metodología. Este proceso involucra la digestión del ADN por una enzima de restricción,
seguida por la separación de los fragmentos mediante una electroforesis, transferencia del ADN
y la hibridación con una sonda marcada que reconoce la unidad repetitiva (Southern
propiamente dicho).
La identificación de individuos, mediante el análisis de ADN, se basa en el alto nivel de
polimorfismo existente en los loci analizados, que generan un número muy alto de genotipos
posibles, a diferencia de los sistemas biológicos de identificación clásicos proteicos, tales como
enzimas, grupos sanguíneos, etc, permitiendo distinguir un individuo de otro, prácticamente en
cada caso Otra ventaja del análisis del ADN con respecto a los marcadores proteícos, es su
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Problema. Los casos 1 y 2, que se muestran más abajo, intentan determinar si un individuo
que alega ser el padre de un niño es su padre biológico. A tal fin se ha analizado los VNTR de
un locus de minisatélite con la metodología descripta previamente.
A- Explique por qué el patrón de bandas de cada individuo consta de dos bandas
B- Teniendo en cuenta los patrones de bandas ¿Qué conclusiones puede sacar en
cada uno de los casos acerca del lazo biológico entre el padre** y el niño?
C- Las conclusiones obtenidas con esta prueba ¿Son un 100% certeras? Discutir
Ejercicio 5
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Determine para cada uno de los siguientes casos si haría alguna prueba molecular para realizar el
diagnóstico. En caso afirmativo, diga cuál es la prueba que considera más adecuada, y describa
brevemente como discrimina un diagnóstico positivo de uno negativo.
1- Enfermedad monogénica con gen identificado. La mutación más frecuente es una sustitución (A
por T) en una posición puntual.
2- Enfermedad monogénica con patrón de herencia ligado al X recesivo y gen no descripto.
3- Enfermedad autosómica dominante con gen identificado. Una de las mutaciones más frecuentes
es una inserción de un par de bases en una posición particular.
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i
Carango P, et al. Absence of myotonic dystrophy protein kinase (MDPK) mRNA as a result of a triplet repeat expansion in myotonic
dystrophy. Genomics 1993; 18: 340-348.
ii
Pena, S.D.J, et al. DNA diagnosis of human genetic individuality. J. Mol. Med. 73: 555-564, 1995.
iii
Bohm, I, et al. Oligonucleotide DNA fingerprinting: Results of a multicenter study on realiability and validity. In: DNA fingerprinting:
State of Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basiléia, Birkhäuser Verlag, 1993, pp. 257-260.
iv
Stratan, T. The human genome BIOS Scientific publishers,1972, p. 160.
v
Jeffreys, A.J., et al. The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualization and establishment of family relationship,
determined from extensive casework. Am. J. Hum. Genet. 48: 824-840,1991.