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Tarea 9

Elución isocrática y gradiente

La elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes
fija). Si un disolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes,
se puede usar una elución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del
disolvente B al disolvente A, produciendo un gradiente continuo.

Figura 1. Las moléculas del disolvente y las moléculas del soluto compiten entre sí en su reacción
con los puntos activos de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, más
fácilmente se desplaza el soluto.

En HPLC, para una fase estacionaria concreta, la naturaleza de la fase móvil es el

factor clave en la separación. Puede trabajarse en dos modalidades:

Isocrática

: la composición de la fase móvil permanece constante durante la

separación

En gradiente

: la composición se va modificando durante la separación. Para trabajar

en esta modalidad el cromatógrafo debe disponer de un sistema de programación de

gradiente, que permita la mezcla reproducible de disolventes en distintas proporciones

durante la separación cromatográfica.


Un requisito técnico importante es que los disolventes empleados deben carecer de

gases disueltos, ya que estos pueden provocar serios problemas por formación de

burbujas. Es frecuente por ello la desgasificación de los disolventes.

Cromatograf

ía de afinidad

La

cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad de

fijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de
soporte porque

están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o

matriz inerte que debe de tener una

estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y


agentes

disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase


estacionaria es sólida.

Estos ligandos se

clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención de analitos,

esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas).
Cuando las

proteínas no específicas se han lavado a través de la colum

na, se eluye la proteína ligada con solución

que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva,
generalmente

por el acoplamiento o alteración de los sitios activos inhibidor

ligando, para que esto pueda ser posible,

se

necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones
modifican
las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la
proteína para

continuar con la regeneración de la columna cro

matográfica.

La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención


de

proteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un
campo

restringido para la separación.

. Cromatografía de afinidad

Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas

de soluto y una segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. Por

ejemplo, la molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo específico para un proteína particular.

Cuando una mezcla cruda que contiene miles de proteínas se pasa a través de una columna, sólo

una proteína reacciona con el anticuerpo que está unido a la columna. Después de lavar todos los

otros solutos de la columna, la proteína deseada es desplazada del anticuerpo cambiando el pH ,

la fuerza iónica o la polaridad.

Las interacciones entre las moléculas del ligando y blanco pueden ser el resultado de

interacciones hidrofóbicas o interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals y/o puentes

de hidrógeno.

La purificación por afinidad requiere un ligando bioespecífico que puede ser unido

covalentemente a una matriz cromatográfica. El ligando acoplado debe retener su afinidad

específica de enlace hacia las moléculas blanco, y después de lavar el material no unido, la unión

entre la molécula blanco y el ligando debe ser reversible y permitir que las moléculas blanco sean

removidas en forma activa. Cualquier componente puede ser usado como un ligando para

purificar a su compañero respectivo. Algunas interacciones biológicas típicas usadas

frecuentemente en cromatografía de afinidad son:

¸ Enzima- sustrato análogo, inhibidor, cofactor.

¸ Anticuerpo- antígeno, virus, célula.


¸ Lecitina- polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula.

¸ Ác. Nucleico- secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de ácidos nucleicos, proteína
de unión al DNA.

¸ Hormona, vitamina- receptor, proteína acarreadora.

¸ Glutatión - glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST

¸ Iones metálicos- proteínas de fusión poli (his), proteínas nativas con histidina,

residuos de cisteína y/o triptofano en sus superficies.

La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado.

Algunas características importantes para ésta son:

¸ adsorción no específica extremadamente baja es esencial ya que el éxito de la

cromatografía de afinidad depende de interacciones específicas,

¸ los grupos hidroxilo en los residuos de azúcar pueden servir para unirse a un ligando,

¸ proporcionando una plataforma ideal del desarrollo del medio de afinidad,

¸ la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unión alta, aún para biomoléculas

grandes porque el interior de la matriz estaría disponible para el ataque de ligandos,

¸ propiedades de fluido buenas para la rápida separación,

¸ estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales tales como pH alto y bajo,

detergentes y agentes disociadores.

El ligando. Es la molécula que se une reversiblemente a moléculas específicas o grupo de

moléculas, capacita la purificación por cromatografía de afinidad.

La selección del ligando para cromatografía de afinidad está influenciado por dos factores:

El ligando debe presentar una afinidad de unión específica y reversible para la sustancia blanco y

debe tener grupos químicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su

capacidad de unión.

Brazo espaciador. El sitio de unión de una proteína blanco a menudo se localizan dentro de la

molécula y un medio de afinidad preparado con pequeños ligandos acoplados directamente a la

columna puede exhibir una capacidad de unión baja debido a interferencias estéricas, por

ejemplo, el ligando no podría accesar al sitio de unión de la molécula blanco. En estas

circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para facilitar la unión
específica. El brazo espaciador puede ser diseñado para máximar la unión específica.

Referencias

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cromatografia.pdf

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf

http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica%20ambiental/Tema6.p
df