GLUCOHEMOGLOBINA (HbA1)

MÉTODO CON RESINA DE INTERCAMBIO IÓNICO NUEVO PROCEDIMIENTO

Para la determinación “in vitro” de Glucohemoglobina en sangre
PRINCIPIO
A un determinado valor de pH, la fracción de hemoglobina HbA0 es fijada en la resina de
intercambio iónico, mientras que la fracción HbA1 (hemoglobinas glucosadas) adopta una
carga neta tal, que permanece en el sobrenadante. La separación de ambas fases (resina
y sobrenadante), por centrifugación, permite una evaluación inmediata de la proporción
relativa de la fracción HbA1 con respecto a la hemoglobina total. (Técnica de “batch”).
PROCEDIMIENTO
A. Hemólisis de la muestra
1. Dispensar 0,5 ml de Reactivo Lisante en un tubo de ensayo.
2. Añadir 0,1 ml de sangre problema, ST o Control.
Mezclar e incubar durante 5 min. a Tª ambiente (20-25ºC).

UTILIDAD DIAGNÓSTICA B. Separación de la HbA1

La determinación de la Glucohemoglobina proporciona información acerca del control, a 1. Homogeneizar correctamente la suspensión de Resina Tamponada y dispensar 3,0 ml
largo plazo, de pacientes diabéticos. La concentración de esta proteína eritrocitaria viene en un tubo de ensayo.
condicionada por la glucemia media, durante un período de semanas, por lo que constituye 2. Añadir 0,1 ml de hemolizado del apartado anterior (A2).
una prueba no influenciada por las fluctuaciones puntuales del nivel de glucosa en suero. 3. Mezclar la suspensión de resina y hemolizado por espacio de 5 min. (agitador
hematológico, vórtex, etc.). Se recomienda tener la resina en agitación continuada
Una única prueba de laboratorio no permite establecer un diagnóstico. Los resultados se para evitar su sedimentación y también para favorecer la reacción en las condiciones
han de evaluar en el contexto de todos los datos clínicos y de laboratorio obtenidos. apropiadas.
4. Centrifugar x 580 g (2000 rpm aprox.) durante 10 min. Separar el sobrenadante, con
REACTIVOS
Kit para 20 det. (Ref. 99 83 90). Contiene: cuidado de no aspirar las partículas de resina, y medir su absorbancia (Abs1).
A. 1 x 60 ml Resina tamponada. Ref. 99 00 54
B. 1 x 10 ml Reactivo lisante. Ref. 99 07 90 C. Hemoglobina total
C. 1 x 1 ml Standard. Ref. 99 03 01 1. Dispensar 20 μl de hemolizado del apartado anterior (A2) en un tubo de ensayo.
2. Añadir 5 ml de agua desionizada y mezclar vigorosamente. Medir la absorbancia (AbsT).
Kit para 100 det. (Ref. 99 50 84). Contiene:
A. 3 x 100 ml Resina tamponada. Ref. 99 80 00 Lectura
B. 1 x 50 ml Reactivo lisante. Ref. 99 76 26 Longitud de onda: 415 nm.
C. 1 x 1 ml Standard. Ref. 99 03 01 Blanco: Agua.
Estabilidad: 1 hora.
Adicionalmente:
Juego de controles (Ref. 99 66 36). Contiene: CÁLCULOS
1 x 1 ml Control nivel bajo. Ref. 99 41 06 Hallar el valor del cociente C = ( Abs1 / AbsT ) de la muestra y del standard.
1 x 1 ml Control nivel alto. Ref. 99 88 07 A partir de aquí:

PREPARACION DEL REACTIVO DE TRABAJO % HbA1 muestra = (Cmuestra / Cst) x %HbA1 ST

Los reactivos A y B están listos para su uso.
Para el Standard y el Control, rehidratar el vial con 1 ml de agua desionizada. Dejar media
hora a Tª ambiente (≤ 25ºC) con alguna suave agitación ocasional, hasta total hidratación.
COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS
A. Resina tamponada: Resina de intercambio iónico tamponada 0,8%; pH 6,85
B. Reactivo lisante: Cianuro potásico 8 mM y tensoactivos.
C. Standard: Liofilizado de eritrocitos. La concentración está indicada en la etiqueta.
Juego de controles: Liofilizado de eritrocitos. La concentración está indicada en la etiqueta.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
La resina y el reactivo lisante almacenados a Tª ambiente (≤ 25ºC) son estables hasta la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta.
El estándar y los controles deberán conservarse a 2-8º C, protegidos de la luz. Una
vez rehidratados son estables 2 semanas a 2 - 8º C o bien 8 semanas si se conservan
congelados a -20º C en partes alícuotas.
Indicaciones de alteración de los reactivos:
Blanco del reactivo A < 0,065
Presencia de partículas o turbidez en el reactivo B, standard y control.
MATERIAL NECESARIO NO SUMINSTRADO
Material común de laboratorio.
Centrífuga.
Espectrofotómetro o fotómetro termostatizado a 37ºC. Cubeta de 1 cm de paso de luz.
MUESTRA
Sangre total con EDTA como anticoagulante. La muestra es estable 1 semana a 2 - 8º C.
PRECAUCIONES
El reactivo lisante contiene cianuro. No mezclar con ácidos. Lavarse las manos después de
manipular. Las indicaciones de seguridad se encuentran en la etiqueta de los productos.
La sangre utilizada en el standard y controles ha resultado negativa en la reacción con
HBsAg y HIV. A pesar de ello, manipular con precaución.
Se aconseja consultar la ficha de datos de seguridad antes de la manipulación del reactivo.
La eliminación de residuos debe hacerse según la normativa local vigente.
(El %HbA1 ST está indicado en la etiqueta del vial del standard).
VALORES DE REFERENCIA
Pacientes no diabéticos: 6,0 - 8,3 %.
Pacientes diabéticos no controlados: los valores pueden superar la cifra del 10 %.
Estos valores son a título orientativo. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus
propios valores de referencia.
PRESTACIONES. CARACTERÍSTICAS DE FUNCIONAMIENTO
Las características de funcionamiento del producto dependen tanto del reactivo como del
sistema de lectura manual o automático empleados.
Los siguientes datos se han obtenido de forma manual:
Sensibilidad, como límite de detección: 2,0%
Linealidad: Hasta 15%. Para concentraciones superiores, diluir la muestra con salina (NaCl
0,9%)
Exactitud, como % de recuperación: 96%
Precisión en la serie, como CV%: 2,5%
Precisión entre series, como CV%: 3,0%
Veracidad. Los resultados obtenidos con el reactivo no presentan diferencias significativas
al compararlo con el reactivo considerado de referencia.
INTERFERENCIAS
Concentraciones elevadas de hemoglobina fetal (HbF) redundarán en un valor
anormalmente elevado de HbA1.
Asimismo, pueden obtenerse valores anormalmente bajos en presencia de hemoglobinas
anormales (HbS,HbC). La fracción inestable (aldimina) queda eliminada en contacto con la
resina y no contribuye al valor final de la glucohemoglobina.
El método es independiente de la Tª de trabajo, dentro de un margen que oscila entre
los 20 ºC y los 30 ºC. Valores muy distantes de este margen, pueden dar lugar a resultados
incorrectos.
CONTROL DE CALIDAD
Es recomendable la inclusión de muestras control, (Juego de controles Ref. 99 66 36), en
cada proceso de medida para verificar los resultados.
Se aconseja que cada laboratorio establezca su propio programa de control de calidad y los
procedimientos de corrección de las desviaciones en las medidas.

BIBLIOGRAFÍA
Trivelli, L.A., Ranney, H.M., Lai, H.(1971) The New Engl. J. Med., 284, 353-357.
Gabbay, K. H., Hasty, K., Breslow, J. L., Ellison, R.C., Bunn, H. F., Gallop, P. M. (1977). J.
Clin. Endocrinol. Metabol., 44, 859-864.
MUY IMPORTANTE
Nathan, D.M., Singer, D.E., Hurxthal, K., Goodson, J.D., (1984) New Engl. J. Med.,310,
Es sumamente importante homogeneizar muy bien la suspensión de
341-346.
resina antes de cada dispensación.
Johnson, M.W., Dobrea, G.M., Bendezu, R., Wieland, R.G. (1980), Clin. Chim. Acta, 104,
De lo contrario, la cantidad dispensada será variable y la separación
319-328.
incorrecta.
Flückiger, R., Woodti, T., (1985) Clin. Chem., 31, 114-117.

QUIMICA CLINICA APLICADA S.A.

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Revisión: Diciembre 2014 PRO4_REG9_GLUHB_4
GLYCOHEMOGLOBIN (HbA1)
IONIC EXCHANGE RESIN METHOD NEW PROCEDURE
For “in vitro” determination of Glycohemoglobin in blood
PRINCIPLE PROCEDURE
At a certain pH value, the HbA0 hemoglobin fraction is retained by the ion exchange resin, A. Sample hemolysis
while the HbA1 fraction (glycosated hemoglobin) has a net charge that will make it to 1. Dispense 0.5 ml of the ysing reagent into a test tube.
remain in the supernatant. The rapid phase separation of resin from the supernatant by 2. Add 0.1 ml of blood sample, standard or control.
centrifugation, will allow a quick evaluation about the relative proportion of HbA1 with regard Mix and incubate for 5 min. at room temperature (20-25ºC).
to the total hemoglobin (Batch technique).
B. HbA1 separation
DIAGNOSTIC USE 1. Mix thoroughly the resin suspension to guarantee total homogeneity and dispense 3 ml.
Glycohemoglobin determination supplies information about the long-term control of diabetic into a test tube.
patients. The concentration of this red blood cell protein is conditioned by the mean 2. Add 0.1 ml of the hemolyzed sample (A.2.)
blood glucose level, for a period of weeks, for what it turns out as a test not influenced by 3. Mix the resin suspension and the hemolyzed sample for 5 min. (hematological mixer,
occasional sudden fluctuations in the serum glucose concentration. vortex...). Continuous resin mixing is recommended so as to avoid its sedimentation as well
as to let the reaction to proceed under proper conditions.
Single test result could not be used to make a clinical diagnosis. The results are to be
4. Centrifuge x 580 g (2000 rpm aprox.) for 10 min. Take a certain volume of the
evaluated in the context of all clinical and laboratory data obtained.
supernatant out of the tube, with special care of not aspirating the pellet of resin, and read
the absorbance (Abs1).
REAGENTS
Kit for 20 tests. (Ref. 99 83 90). Contents:
C. Total hemoglobin
A. 1 x 60 ml Buffered resin. Ref. 99 00 54
1. Dispense 20 μl of the hemolyzed sample (Abs2) into a test tube.
B. 1 x 10 ml Lysing reagent. Ref. 99 07 90
2. Add 5 ml of deionized water and mix vigorously. Read the absorbance (AbsT).
C. 1 x 1 ml Standard. Ref. 99 03 01
Reading
Kit for 100 tests. (Ref. 99 50 84). Contents:
Wavelength: 415 nm.
A. 3 x 100 ml Buffered resin. Ref. 99 80 00
Blank: Water.
B. 1 x 50 ml Lysing reagent. Ref. 99 76 26
Stability: 1 hour.
C. 1 x 1 ml Standard. Ref. 99 03 01
CALCULATIONS
Optionally: Determine the value of the ratio C = ( Abs1 / AbsT) of the sample and the corresponding to
Set of Controls (Ref. 99 66 36).Contents: standard. Then:
1 x 1 ml Control low level. Ref. 99 41 06
1 x 1 ml Control high level. Ref. 99 88 07 % HbA1 sample = (Csample/Cst) x %HbA1 ST.
(%HbA1 ST is stated on the label of the standard vial).
WORKING REAGENT PREPARATION
Reagents A and B are ready to use. REFERENCE VALUES
Standard and Control: Rehydrate one vial with 1 ml of deionized water. Let stand at room Non-diabetics patients: 6.0-8.3%
temp. (≤ 25 ºC), for 30 min. with occasional mixing until rehydration is complete. Uncontrolled diabetics: values can be higher than 10%.

REAGENT COMPOSITION
A. Buffered resin: Buffered ionic exchange resin 0.8%; pH 6.85
B. Lysing reagent: Potassium cyanide 8 mM and surfactant.
C. Standard: Freeze-dried erythrocytes. The concentration value is stated on the label.
Set of Controls: Freeze-dried erythrocytes. The concentration values (two levels) are stated
on the label.
STORAGE AND STABILITY
The buffered resin and the lysing reagent, stored at room temp. (≤ 25 ºC), will remain stable
until the expiration date stated on the label.
Standard and Controls should be kept at 2-8ºC, protected from light. Once rehydrated
these are stable for two weeks stored at 2-8ºC, or 8 weeks if aliquoted and frozen (-20 ºC).
Signs of reagent deterioration:
Reagent A blank < 0.065.
Presence of particles or turbidity in the reagent B, Standard and Controls.
ADDITIONAL EQUIPMENT
General laboratory equipment.
Centrifuge.
Spectrophotometer or photometer with thermostated cuvette (37 ºC). Light path cuvette:
1 cm.
SAMPLE
Whole blood with EDTA as anticoagulant. Stable 1 week at 2-8º C.
CAUTION
Lysing reagent contains cyanide. Do not mix with acids. Wash hands after handling.
Blood used in the standards and control preparations has been found to be negative in the
reaction with HBsAg and HIV. However they should be handled with care.
The safety statements are on the label. It is advisable to read SDS before reagent manipula-
tion.
The disposal of the residues has to be made according to local regulations.
VERY IMPORTANT
It is very important to homogenize the resin suspension before each
dispensation. Otherwise, the amount dispensed will be variable and the
separation will be erroneous.
The stated values are for guidance. It is advisable that each laboratory determines its own
reference values.
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
The performance characteristics depend on the method used. It is recommended to calcu-
late these data for each particular test protocol. These results have been obtained using a
manual method.
Sensitivity, as detection limit: 2.0%
Linearity: Up to 15%. For higher values, it is recommended to dilute the sample 1/2 in saline
(NaCl 0.9%) and assay once again. Multiply the final result by 2.
Accuracy: 96 %.
Repetitivity, as %CV: 2.5%
Reproducibility, as %CV: 3.0%
Trueness: Results obtained with this reagent did not show systematic differences when
compared with reference reagent.
Details of the performance studies are available on request
INTERFERENCES
High faetal hemoglobin concentrations (HbF) will give abnormally high HbA1 values.
Likewise, abnormally low values can be obtained with samples with a high abnormal
hemoglobin content (HbC,HbS). The unstable fraction (aldimine) is eliminated during resin
mixing and does not contribute to the glycohemoglobin value.
The method is independent of the working temperature, provided the assay is carried
out within a reasonable temperature range, 20 and 30 ºC. If the temperature during the
assay is far from this range the results can be erroneous.
QUALITY CONTROL
Control samples (Set of Controls Ref. 99 66 36) should be included in each test series. Each
particular laboratory should establish its own control program.
REFERENCES
Trivelli, L.A., Ranney, H.M., Lai, H.(1971) The New Engl. J. Med., 284, 353-357.
Gabbay, K. H., Hasty, K., Breslow, J. L., Ellison, R.C., Bunn, H. F., Gallop, P. M. (1977). J.
Clin. Endocrinol. Metabol., 44, 859-864.
Nathan, D.M., Singer, D.E., Hurxthal, K., Goodson, J.D., (1984) New Engl. J. Med.,310,
341-346.
Johnson, M.W., Dobrea, G.M., Bendezu, R., Wieland, R.G. (1980), Clin. Chim. Acta, 104,
319-328.
Flückiger, R., Woodti, T., (1985) Clin. Chem., 31, 114-117.

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Revision: December 2014 PRO4_REG9_GLUHB_4
HÉMOGLOBINE GLYQUÉE (HbA1)
MÉTHODE UTILISANT LA RÉSINE ÉCHANGEUSE D’IONS NOUVELLE PROCÉDURE
Pour la détermination in vitro de l’hémoglobine glyquée dans le sang
PRINCIPE TECHNIQUE
À une valeur de pH déterminée, la fraction d’hémoglobine HbA0 est fixée sur la résine A. Hémolyse de l’échantillon
échangeuse d’ions, tandis que la fraction de HbA1c (hémoglobine glyquée) a une charge
1. Verser 0,5 ml de réactif lysant dans un tube à essai.
nette telle qu’elle reste dans le surnageant. La séparation des deux phases (résine et
2. Ajouter 0,1 ml de sang à analyser, étalon ou contrôle.
surnageant), par centrifugation, permet d’évaluer immédiatement la proportion relative de
la fraction HbA1 par rapport à l’hémoglobine totale. (Technique de « batch »). Mélanger et incuber pendant 5 minutes à temp. ambiante (20-25ºC).
B. Séparation de l’HbA1
UTILITÉ DE DIAGNOSTIC 1. Homogénéiser correctement la suspension de résine tamponnée et verser 3,0 ml dans
La détermination de l’hémoglobine glyquée apporte des informations concernant le contrôle, un tube à essai.
à long terme, de patients diabétiques. La concentration de cette protéine érythrocytaire est 2. Ajouter 0,1 ml d’hémolysat de l’étape précédente (A2) .
conditionnée par la glycémie moyenne sur une période de semaines. Par conséquent, les 3. Mélanger la suspension de résine et d’hémolysat pendant 5 minutes (agitateur
fluctuations ponctuelles du taux de glucose dans le sérum n’influent pas sur cet essai. hématologique, vortex, etc.). Un mélange continu de la résine est recommandé
Un test de laboratoire unique ne permet pas d’établir un diagnostic. Les résultats doivent afin d’éviter sa sédimentation et pour permettre la réaction de se dérouler dans des
être évalués dans le contexte de toutes les données cliniques et de laboratoire obtenues. conditions appropriées.
4. Centrifuger x 580 g (environ 2000 tr/min) pendant 10 min. Séparer le surnageant, avec
RÉACTIFS un soin particulier de ne pas aspirer la résine, et mesurer l’absorbance (Abs1).
Kit pour 20 déterminations. (Réf. 99 83 90). Contenu:
C. Hemoglobine totale
A. 1 x 60 ml Résine tamponnée. Réf. 99 00 54
1. Verser 20 μl d’hémolysat de l’étape précédente (A2) dans un tube à essai.
B. 1 x 10 ml Réactif lysant. Réf. 99 07 90
2. Ajouter 5 ml d’eau déionisée et mélanger vigoureusement. Mesurer l’absorbance (AbsT ).
C. 1 x 1 ml Étalon. Réf. 99 03 01
Lecture
Kit pour 100 déterminations. (Réf. 99 50 84). Contenu: Longueur d’onde: 415 nm
A. 3 x 100 ml Résine tamponnée. Réf. 99 80 00 Blanc: eau
B. 1 x 50 ml Réactif lysant. Réf. 99 76 26 Stabilité: 1 heure.
C. 1 x 1 ml Étalon. Réf. 99 03 01
CALCULS
Calculer la valeur du rapport C = ( Abs1 / AbsT ) de l’échantillon .
En option:
et de l’étalon, puis:
Kit de contrôles (Réf. 99 66 36). Contenu:
1 x 1 ml Contrôle Concentration basse. Réf. 99 41 06
% HbA1 échantillon = (Céchantillon/C étalon) x %HbA1 ÉTALON
1 x 1 ml Contrôle Concentration élevée. Réf. 99 88 07
(òu %HbA1 ÉTALON est indiqueé sur l’ètiquette du flacon de l’etalon).
PRÉPARATION DU RÉACTIF DE TRAVAIL
Le réactifs A et B son prêts à l’emploi. VALEURS DE RÉFÉRENCE
Préparation de l’étalon et du contrôle: réhydrater le contenu de la fiole avec 1 ml d’eau Patients non diabétiques: 6,0 à 8,3 %.
déionisée. Laisser une demi-heure à température ambiante (≤ 25 ºC) sous agitation douce En cas de patients diabétiques non contrôlés, les valeurs peuvent dépasser le chiffre de
intermittente jusqu’à hydratation complète. 10 %.
Il est recommandé que chaque laboratoire établisse ses propres valeurs de référence.
COMPOSITION DU RÉACTIF
A. Résine tamponnée: résine échangeuse d’ions tamponnée 0,8%; pH 6,85 PERFORMANCE. CARACTÉRISTIQUES DE FONCTIONNEMENT
B. Réactif lysant: cyanure de potassium 8 mM et tensio-actif. Le fonctionnement du produit dépend tant du réactif que du système de lecture manuel ou
C. Étalon: Lyophilisat d’érythrocytes. La concentration est indiquée sur l’étiquette. automatique utilisé. Les résultats suivants ont été obtenues avec une technique manuelle.
Kit de contrôles:Lyophilisat d’érythrocytes. La concentration est indiquée sur l’étiquette.
La sensibilité, en tant que la limite de détection: 2,0%
CONSERVATION ET STABILITÉ Linéarité: jusqu’à 15%. Pour des concentrations supérieures, diluer l’échantillon au 1/2 avec
Conservés à température ambiante (≤ 25ºC), la résine et le réactif lysant sont stables une solution saline (NaCl 0,9 %). Multiplier le résultat par 2.
jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette. Exactitude: le pourcentage de récupération est de 96 %.
Conserver l’étalon et les contrôles sous forme lyophilisée à une température comprise entre Coefficient de variation dans la série: 2,5 %
2 et 8 ºC à l’abri de la lumière. Après réhydratation, ils sont stables pendant 2 semaines à Coefficient de variation entre les séries: 3,0 %
2 - 8 ºC ou pendant 8 semaines s’ils sont conservés congelés à -20 ºC en parties aliquotes. Justesse. Les résultats obtenus avec le réactif ne sont pas significativement différents par
rapport au réactif de référence considéré.
Indications d’altération du réactif: L’étude détaillée de la performance du réactif est disponible sur demande.
Blanc du réactif A < 0,065
La présence de particules dans le réactif B, Étalon et Contrôles. . INTERFÉRENCE
Des concentrations élevées de l’hémoglobine fœtale (HbF) se traduiront par une valeur
MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI anormalement élevée de l’HbA1. Par ailleurs, des valeurs anormalement basses peuvent
Matériel courant de laboratoire. être détectées en présence d’hémoglobines anormales (HbS ou HbC). La fraction instable
Centrifuge. (aldimine) est éliminée en contact avec la résine et ne contribue pas à la valeur finale de
Spectrophotomètre ou photomètre thermostaté à 37 °C. Cuvette de 1 cm de trajet optique. l’hémoglobine glyquée.
La méthode est indépendante de la température de travail, dans les limites comprises
ÉCHANTILLON entre 20 et 30 ºC. Des valeurs en dehors de ces limites peuvent donner des résultats
Sang total sur EDTA comme anticoagulant. Conservé entre 2 et 8 ºC, l’échantillon est stable erronés.
pendant 1 semaine.
CONTRÔLE DE QUALITÉ
Nous recommandons l’inclusion des contrôles, Kit de contrôles (Réf. 99 66 36), dans
PRÉCAUTIONS
chaque processus de mesure pour vérifier les résultats.
Le réactif lysant contient du cyanure. Ne pas mélanger avec des acides. Se laver les
Nous suggérons que chaque laboratoire d’établir son propre programme et les procédures
mains après chaque manipulation. Consulter la fiche des données de sécurité avant de
de correction des écarts dans les mesures de contrôle qualité.
manipuler le réactif.
Le sang utilisé pour l’étalon et les contrôles a donné un résultat négatif lors de la réaction BIBLIOGRAPHIE
avec l’Ag HBs et l’HIV. Malgré cela, ils doivent être manipulés avec précaution. Les Trivelli, L.A., Ranney, H.M., Lai, H.(1971) The New Engl. J. Med., 284, 353-357.
indications de sécurité sont sur l’étiquette des produits. Gabbay, K. H., Hasty, K., Breslow, J. L., Ellison, R.C., Bunn, H. F., Gallop, P. M. (1977). J.
L’élimination des déchets doit être effectuée conformément aux normes en vigueur. Clin. Endocrinol. Metabol., 44, 859-864.
Nathan, D.M., Singer, D.E., Hurxthal, K., Goodson, J.D., (1984) New Engl. J. Med.,310,
341-346.
Johnson, M.W., Dobrea, G.M., Bendezu, R., Wieland, R.G. (1980), Clin. Chim. Acta, 104,
319-328.
Flückiger, R., Woodti, T., (1985) Clin. Chem., 31, 114-117.

REMARQUE TRÈS IMPORTANTE

Il est extrêmement important de très bien homogénéiser la suspension de
résine avant chaque utilisation.
Sinon, la quantité de résine utilisée sera variable et la séparation
incorrecte.

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