LABORATORIO DE BIORREACTORES ELABORÓ: SALGADO ROMÁN J.M., RODRÍGUEZ SIERRA J. C.

ACTUALIZÓ: JIMÉNEZ CASTILLO R I., MARÍA LOURDES MEJÍA FARFÁN.

PRÁCTICA 8. ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y AIRE.

INTRODUCCIÓN.

En cualquier bioproceso, la esterilización de los medios de cultivo es necesaria para evitar la competencia por el
sustrato entre los microorganismos contaminantes y el microorganismo de interés, con el fin de maximizar el
rendimiento del producto y eliminar el riesgo de perder el lote de producción por causa de la contaminación.

Existen varios métodos de esterilización, entre los cuales se pueden mencionar el calor, la filtración, las
radiaciones de alta energía, las microondas y algunos agentes químicos. Generalmente la esterilización de un
medio de cultivo se efectúa por calor húmedo, en procesos en lote o en continuo. Como se muestra en la figura
5.1, cuando un medio de cultivo se esteriliza en lote, pueden diferenciarse tres etapas durante el proceso:

1. Calentamiento: Tiempo que tarda el total del líquido en alcanzar la temperatura de esterilización (A-B).
2. Mantenimiento: Tiempo que debe mantenerse la temperatura de esterilización (B-C).
3. Enfriamiento: Tiempo que tarda en enfriarse el medio desde la temperatura de esterilización hasta la de
fermentación (C-D).

Figura 5.1. Variación de la temperatura en función del

tiempo en un proceso de esterilización en lote.

CINÉTICA DE MUERTE TÉRMICA.

La velocidad de la muerte térmica, es proporcional al número de individuos presentes, por lo tanto:

𝑑N / 𝑑𝑡 = −𝑘𝑁 (5.1)

Donde N = número de microorganismos o esporas viables al tiempo t y k = constante de

velocidad de reacción.

Si el proceso se realiza a temperatura constante, al integrar la ecuación 5.1 se obtiene:

(5.2)

Donde N0 = número de microorganismos o esporas viables al tiempo t= 0.

1
 LABORATORIO DE BIORREACTORES ELABORÓ: SALGADO ROMÁN J.M., RODRÍGUEZ SIERRA J. C.
ACTUALIZÓ: JIMÉNEZ CASTILLO R I., MARÍA LOURDES MEJÍA FARFÁN.

La ecuación 5.2 indica que si se somete una suspensión de células o esporas viables a un proceso de
esterilización a temperatura constante, al graficar Ln (N/N0) contra el tiempo, la pendiente de la gráfica será el
valor de la constante a dicha temperatura, como se muestra en la figura 5.2.

Figura 5.2. Gráficas de la proporción de los

microorganismos sobrevivientes al ser
sometidos a temperaturas letales (izq.) y su
logaritmo natural (der.), con respecto al
tiempo.

Los estudios han demostrado que el valor de k es una función de la temperatura, esta funcionalidad tiene la
forma de la ecuación de Arrhenius:

(5.3)

Dónde: A = Constante de Arrhenius para la velocidad de muerte térmica [=] min-1, EA = Energía de activación

[=] cal/mol, R = Constante de los gases [=] 1.9872 cal/(mol K); y T = Temperatura absoluta [=]K.

Los valores de EA y A de la ecuación 5.3, son función, entre otras cosas, de la naturaleza del microorganismo y del
medio líquido en que se encuentren durante el proceso de esterilización.

La muerte térmica de los microorganismos ocurre en cada una de las etapas en que está constituido el ciclo de
esterilización, el cual se diseña para reducir la viabilidad de las esporas originalmente presentes en un determinado
material, hasta un nivel aceptable. Con base en lo anterior, se define un criterio de diseño como:

(5.4)

El criterio de diseño representa, además de la medida del grado de destrucción, la medida de trabajo que deberá
realizarse. Si diferentes tamaños de lotes fueran sometidos a esterilización, manteniendo el valor del criterio de
diseño, se asegura que los distintos lotes reciban el mismo tratamiento térmico. Por las consideraciones anteriores,
el valor del criterio de diseño ( ) se elige para obtener una baja "probabilidad" de sobrevivencia de las esporas.

2
 LABORATORIO DE BIORREACTORES ELABORÓ: SALGADO ROMÁN J.M., RODRÍGUEZ SIERRA J. C.
ACTUALIZÓ: JIMÉNEZ CASTILLO R I., MARÍA LOURDES MEJÍA FARFÁN.

Puesto que un ciclo de esterilización se compone de tres partes, el criterio total de diseño estará constituido por:

(5.5)

donde: Ɩπtot= criterio de diseño del ciclo de esterilización, = criterio de diseño de la etapa de calentamiento,
m = criterio de diseño de la etapa de mantenimiento de temperatura y = criterio de diseño de la etapa de
enfriamiento.

De tal manera que al realizar integraciones de cada etapa del ciclo se obtiene:

(5.6)

(5.7)

(5.8)

Para obtenerse la solución analítica de las ecuaciones deben sustituirse en ellas perfiles temperatura-tiempo para
diferentes formas de calentamiento de medios contenidos en biorreactores. Un proceso de esterilización también
puede calcularse utilizando un método gráfico o bien, mediante el método de Richards.

OBJETIVOS.
El alumno aplicará procedimientos para la esterilización de medios de cultivo.
El alumno diseñará un filtro de aire empacado.
El alumno aplicará procedimientos para la esterilización de filtros de aire empacados.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

Campana de flujo laminar. 20 Cajas de Petri desechables y estériles
Balanza analítica. 4 Racks con puntas para micropipeta de 1000 µL
Olla de esterilización 4 Barras magnética
Agitador orbital a 35°C y 250 150 Tubos eppendorf de 1.5 mL
rpm, con base para 4 matraces 4 pliegos de Papel filtro
de 500 mL Gasa doble para 10 matraces
Incubadora para placas de agar 25 Ligas amarillas
a 35°C 16 Frascos de jugo limpios y con tapa, de 250 mL
4 Parrillas de calentamiento y 4 Varillas de vidrio en L (varilla y cortador de vidrio)
agitación 2 mecheros Fisher
Baño maría a 50°C 2 mecheros de bunsen
Bomba de aire tipo pecera Agua destilada
4 Micropipetas de 1000 µL 4 espátulas
8 charolas para pesado
1 L de alcohol etílico al 70%
Agar nutritivo. 4 probetas de 100 mL
Caldo nutritivo. 4 probetas de 250 mL
NaCl 1 paquete de algodón y 100 g de fibra de vidrio
6 Matraces Earlenmeyer de 500 1 cerillos. cofias y cubrebocas, guantes térmicos y
mL tijeras

3
LABORATORIO DE BIORREACTORES ELABORÓ: SALGADO ROMÁN J.M., RODRÍGUEZ SIERRA J. C.
ACTUALIZÓ: JIMÉNEZ CASTILLO R I., MARÍA LOURDES MEJÍA FARFÁN.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Importante: Todo el procedimiento experimental se realizará bajo la supervisión y asistencia de los
profesores.

a. Preparación de placas de agar nutritivo.

1.- Prepare el agar nutritivo suficiente para 20 placas, siguiendo las instrucciones del proveedor.
2.- Esterilice el medio agar nutritiva.
3.- Vacíe 20 mL de medio a 45-50°C en cajas de Petri en campana de flujo laminar, utilizando alcohol etílico al
70% para sanitizar la mesa de la campana y manos. Utilice cofia y cubreboca.
4.- Al solidificar mantenga a temperatura ambiente por 24 horas. (Las placas con agar invertidas y sostenidas
con “masking tape” de 6 en 6) en incubadora sanitizada.
5.- A las 24 horas revise en la campana de flujo laminar y descarte las placas de agar contaminadas.

b. Esterilización del medio de cultivo en matraces.

1. Preparar 100 mL de caldo nutritivo en un matráz Earlenmeyer de 500 mL (por duplicado)
2. Tomar 1 mL de muestra inicial y sembrar en placas de agar nutritivo 250 µL de muestra en dilución
10-3 y 10-5 en la campana de flujo laminar, distribuya con varilla de vidrio esteril.
3.- Al finalizar la esterilización de caldo nutritivo deje enfriar y tome una muestra de 1 mL en tubos
eppendorf estériles y siembre en placa de agar nutritivo 250 µL de diluciones 100 y 10-1 .
4.- Incube las placas de agar a 35°C por 24 horas, tome nota del número de Unidades formadoras de
colonias/mL UFC/mL y confirme su lectura a las 48 horas.
Nota importante. Al realizar la siembra de las diluciones exponga abiertas dos placas de agar
nutritivo, serán la referencia de trabajo en la campana de flujo laminar aséptico y las diluciones
realícelas con solución salina al 0.85% estéril.

c. Diseño de filtro de aire empacado

1. Prepare un tubo de aproximadamente 25 cm de largo por 3 cm de diámetro, el material puede ser vidrio o
tubo de acero inoxidable, empaque con algodón o fibra de vidrio y selle los extremos con un tubo de vidrio al
que se conectará la bomba de aire y la salida hacia un matráz Earlenmeyer de 500 mL contenidendo 100 mL
de caldo nutritivo esteril.

d. Esterilización de filtro de aire

1.- Cubra con papel aluminio su filtro de aire y esterilice a 115°C por 15 minutos.
2.- Deje enfriar
3. Tome 1 mL de muestra del caldo nutritivo estéril y siembre 250 µL en una placa de agar.
4. Prenda la bomba de aire y en campana de flujo laminar conecte la tubería de ingreso al filtro de aire y
burbujee en el caldo nutritivo durante 3 minutos.
5. Cubra su matráz con caldo nutritivo e incube a 250 rpm y 35 °C por 24 horas.
6.- Tome una muestra de 1 mL en un tubo eppendorf estéril y siembre por duplicado en placas de agar 250 µL
en dilución 100 y 10-2
7.- Incube las placas por 24 horas a 35°C observe y registre sus resultados.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

1. Realice las tablas necesarias para cada prueba, registrando fecha, hora, temperatura de incubación, µl
sembrados, dilución, lectura, resultados en UFC/mL.
2. Calcule la muerte térmica de los microorganismos en medio de cultivo preparado.
3. Determine esterilidad o contaminación en filtro de aire.

4
LABORATORIO DE BIORREACTORES ELABORÓ: SALGADO ROMÁN J.M., RODRÍGUEZ SIERRA J. C.
ACTUALIZÓ: JIMÉNEZ CASTILLO R I., MARÍA LOURDES MEJÍA FARFÁN.

OBSERVACIONES

REFERENCIAS.
1. Aiba, S. y Humprey A.E. Biochemical Engineering. Academic Press. EUA. 1973, 434 págs.
2. Atkinson, B. Reactores Bioquímicos. Reverté. Barcelona. 1986, 296 págs.
3. Atkinson, B. y Mavituha, F. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook. M. Stockton Press.
Nueva York, EUA. 1991, 1271 págs.
4. Demain, A. L. Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. ASM Press. EUA. 1999, 830 págs.
5. Doran, P. M. Bioprocess Engineering Principles. Academic Press. EUA. 1995, 439 págs.
6. Stanbury, P.F. et. al. Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann. EUA. 1999, 376
págs.
7. Vogel, H.C. y Todaro, C. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook: Principles, Process Design,
and Equipment. Noyes Publications. 1996, 799 págs.