Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

Capítulo 8
Tóxicos Metálicos
Autores:
Bioq. Fernando Rainoldi.
Docente de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP.
Dra. Leda Giannuzzi.
Profesora Adjunta de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP.
Bioq. Cristian Oliver.
Perito de la Sección de Toxicología del Laboratorio Químico Pericial de la Dirección General de
Policía Cinetífica de la Policía de la Provincia de Buenos Aires.
Docente de la Cátedra de Toxicología y Química Legal de la UNLP.

Introducción
Resulta bien conocido que los metales cumplen un doble papel en los seres vivos: son
varios de ellos nutrientes esenciales mientras que en función de su dosis pueden resultar
extremadamente tóxicos. La lista de los metales toxicológicamente importantes se va
ampliando al descubrirse nuevas funciones bioquímicas, dado que algunos de ellos son
considerados esenciales tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, cromo, molibdeno,
manganeso, hierro, cobalto, níquel, cobre, zinc, selenio y flúor. A esta lista podrían incorporarse
el estaño y el silicio.
Si bien se suele unir en un solo grupo a los así llamados ―metales tóxicos‖ esta
distinción no hace referencia a las propiedades metálicas – de hecho incluye metaloides como
el selenio y el arsénico – ni a la forma de metal elemental como la especie tóxica, ya que
usualmente las formas iónicas solubles son las más activas.
Los metales, especialmente los denominados metales pesados, constituyen una
importante fuente de riesgo para la salud y el medio ambiente tanto bajo la forma de
intoxicaciones agudas o crónicas. La actividad antropogénica es la principal fuente de riesgo,
pues actúa concentrando los metales y produciendo múltiples ocasiones de exposición en la
vida diaria a través de los alimentos, aire, agua e incluso en nuestros hogares. En este capítulo
veremos los distintos metales de mayor importancia en nuestro medio y los distintos métodos
de análisis.

8.1 Toxicocinética
A los efectos de realizar los monitoreos correspondientes y seleccionar las muestras,
resulta útil realizar una síntesis de las vías de entrada, depósito y eliminación de los metales.

8.1.1 Vías de absorción

Se conocen como vías de entrada posibles a la inhalatoria, dérmica, oral, mediada por
prótesis metálicas y la transferencia madre-hijo por la placenta o la leche materna. De estas,
especialmente en personal expuesto en industrias, la vía inhalatoria se considera una de la
más importantes y habituales, observándose en la mayoría de las legislaciones laborales una
especial preocupación por la protección de los empleados y la medición en el aire.
En los ambientes fabriles o talleres metalúrgicos la forma de exposición más habitual es
a través de material particulado, vapores o gases, siendo estos últimos generalmente
compuestos organometálicos (carbonilos de níquel, cobalto). Estas combinaciones son mucho
más tóxicas que las formas elementales. La vía dérmica, ya sea para la forma elemental o en
forma de polvos o gases, resulta otra ruta de exposición importante en ambientes industriales,
provocando dermatitis, alergias y distintos tipos de cáncer.
La toxicidad de un metal se halla estrechamente relacionada con la vía de entrada y su
especie química. Uno de los mejores ejemplos lo constituye el mercurio, el cual al ser ingerido
en su forma elemental resulta prácticamente atóxica, mientras que una sal de mercurio soluble

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o el metil mercurio son absorbidos casi en su totalidad. El mismo metal muestra las mismas
diferencia en la vía inhalatoria, donde tanto el metil mercurio como el vapor de mercurio
atómico se absorben un 80 %.

8.1.2 Biotransformación
La mayoría de los metales circula unidos a la fracción proteica del plasma, mediante la
unión a grupos funcionales como sulfihidrilos, amino, fosfato, imidazol e hidroxilo. La
distribución refleja la diferente capacidad para atravesar membranas y para permanecer unidos
a los diferentes componentes de los tejidos u órganos. Debido a que los organismos no pueden
destruir a los metales a diferencia de lo que ocurre con las moléculas orgánicas existe una
larga permanencia en el organismo. A pesar de esto se conocen mecanismos especializados
de quelación y oxidorreducción, que pueden modificar su excreción y toxicidad.

8.1.3 Eliminación
Debido a sus características químicas, la vía principale de eliminación es a través de
quelatos hidrosolubles por vía renal y gastrointestinal. La vía renal requiere previamente que
los metales circulen en forma soluble unidos a proteínas como la albúmina o las
metalotioneínas, siendo estas últimas las preferidas por su pequeño tamaño (5-6 kDa), lo que
permite atravesar libremente por los glomérulos y llegar de esta forma a la orina. Si bien son
rutas de poca importancia desde el punto de vista de la detoxificación, el sudor, el aliento y las
faneras constituyen rutas conocidas desde hace tiempo (ej. Talio en pelo y uñas).
Resulta importante hacer una breve referencia a un tema de por sí de inmensa
complejidad, el de las especies químicas. El contenido total de un elemento presente en una
muestra no es el factor principal para determinar su toxicidad sino la proporción de las distintas
especies químicas presentes una matriz determinada. Existen dos ejemplos clásicos que
ilustran este concepto: el As(III) resulta mucho más tóxicos que el As(V), pues sólo el arsénico
trivalente puede unirse a los tioles; el Cr (VI) resulta más tóxico que el Cr(III) pues es mas
soluble en agua que el trivalente, una vez en el interior de la célula pasa a varios estadios
intermedios de reducción – Cr(V), Cr (IV) – todos ellos capaces de unirse al ADN y provocar
mutagénesis.
En lo que respecta a los metales de transición, basta recordar la especiación química
del Fe en solución acuosa para tener una idea de las complejidades posibles. A la fecha, si
bien los modelos de predicción incorporan la especiación dentro de sus parámetros la medición
de esta resulta aún extremadamente compleja.

8.2 Tipos de muestras

A efectos de establecer una relación dosis-respuesta es necesario conocer tanto la
concentración del metal como el tiempo de exposición. La definición más precisa de dosis es la
cantidad de metal dentro de las células del órgano que manifiesta efectos tóxicos. Sin embargo
la cuantificación de metales dentro de los órganos no es posible en sujetos vivos. Se pueden
hacer estimaciones indirectas a partir de modelos metabólicos derivados de las autopsias.
La sangre, orina y pelos son los tejidos más accesibles para realizar las medidas. Los
resultados de dichas determinaciones reflejan exposición reciente, pasada ó de larga data,
dependiendo del tiempo de retención y del tejido en particular.
La muestra de sangre y orina refleja exposiciones recientes y se correlacionan muy bien
con los efectos agudos. Una excepción es el cadmio en orina: su presencia en alta
concentración en orina implica un daño renal relacionado con la acumulación del metal en el
riñón.
Las muestras pilosas pueden usarse en asociación a variaciones en la exposición a los
metales durante largo tiempo. Los análisis pueden realizarse sobre distintos segmentos del
cabello de modo tal que el contenido del metal del nuevo crecimiento puede compararse con
exposiciones pasadas. Se debe tener la precaución de lavar el pelo previamente al análisis
para remover el depósito de metal por la contaminación externa.
Otro tipo importante de muestras es el agua. Las aguas de bebidas libres de materia en
suspensión pueden ser analizadas directamente, mientras que las que presentan materia
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orgánica requieren un procedimiento para solubilizar el material suspendido. Los barros,

sedimentos y otros tipos de muestras sólidas pueden ser analizadas después de un tratamiento
adecuado.
También muchas veces se presentan muestras ambientales o alimentos en los que
resulta de interés conocer el contenido de metales. Desde el punto de vista cuantitativo, las
intoxicaciones por metales más frecuentes provienen de la ingestión de agua o alimentos
contaminados, ya sea su contenido o continente (latas con plomo).

8.3 Tratamiento de las muestras

Previo a la cuantificación de metales presentes en medios biológicos, es necesario
efectuar un tratamiento de la muestra, dependiendo el mismo de varios factores:
1- Material biológico (orina, suero, sangre, vísceras)
2- Metal en cuestión (volatilidad y formas no disociables del metal en el organismo)
3- Procedimiento utilizado para la determinación final (colorimétrico, absorción atómica,
activación neutrónica).
Los metales pesados se encuentran frecuentemente en el material a analizar formando
complejos con moléculas orgánicas y deben ser liberados de los mismos para poder
determinarlos. Entre los métodos más utilizados para el tratamiento previo de las muestras,
pueden mencionarse:
a) Destrucción oxidativa por vía húmeda de la materia orgánica (DMO) empleando ácido
nítrico, nítrico-agua oxigenada, nítrico-sulfúrico, nítrico-sulfúrico-perclórico, o bien
permanganato de potasio-clorhídrico.
b) Destrucción de materia orgánica por vía seca.
c) Formación de quelatos y extracción con solventes.
d) Precipitación de las proteínas y determinación de los metales en el sobrenadante.
e) Técnicas de volatilización (arsénico como AsH3, antimonio como SbH3 y mercurio como
vapor del elemento).
A veces pueden efectuarse combinaciones entre los distintos métodos, de manera de
obtener una muestra apropiada para las posteriores determinaciones.
El método de destrucción de materia orgánica (DMO) sulfo-nitro-perclórico (SNP),
puede ser aplicado para la determinación de arsénico, talio, plomo y otros metales de interés
toxicológico en medios biológicos. Para la determinación de mercurio se efectuará en un
dispositivo especial que incluye un refrigerante a reflujo con dedo frío para evitar pérdidas del
elemento por volatilización del mismo. Existen también otros métodos denominados secos
dado que realizan la Destrucción de Materia Orgánica (DMO) por calcinación.
A continuación se detalla el fundamento del método de DMO por Vía Húmeda Sulfo-
Nitro -Perclórica

8.3.1 Destrucción de materia Orgánica (DMO) por vía húmeda sulfo-

nitro-perclórica
Se basa en la acción de una mezcla fuertemente oxidante sobre la muestra en cuestión
a fin de romper la unión entre los metales y la materia orgánica llevándolos a su máximo estado
de oxidación.

El HNO3 es un agente oxidante (punto de ebullición: 56ºC).

2HNO3 H2O + NO + 3 O*__ en frío.

2HNO3 H2O + 2 NO2 +1O* en caliente.

Luego O* + H (de la materia orgánica) H2O

El H2SO4 permite trabajar a mayor temperatura (270 ºC) siendo además un indicador
de la destrucción de la materia orgánica: cuando ácido nítrico se consume comienza a actuar el
ácido sulfúrico que ataca la materia orgánica dando carbono de color negro. En ese momento
es necesario detener el calentamiento porque falta medio oxidante, entonces se agregará ácido
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nítrico y se continúa el calentamiento. (El C es reductor y podrá reducir el As a AsH3

perdiéndose por volatilización). Además el H2SO4 rompe cadenas de glúcidos, proteínas y
grasas, dando moléculas más pequeñas que serán fácilmente atacadas por el ácido nítrico.
El ácido sulfúrico es también un deshidratante fuerte. Es indicador de que la materia
orgánica ha sido totalmente destruida, cuando no aparece color negro y se observan humos
blancos de SO3 .
El HClO4 posee un poder oxidante muy fuerte. Explota en presencia de materia
orgánica, por eso nunca se lo usa sólo sino como mezcla ácido nítrico-ácido perclórico.
Además de ser oxidante produce el clivaje de cadenas.

4 HClO4 2H2O + 2Cl2 + 7 O2 (4 HClO4 :14 O*)

4 HClO4 4 ClO2 + 3O2 +2H2O

4ClO2 + C (de la materia orgánica) 4 CO2 + Cl2

La principal desventaja de la mezcla SNP es que resulta peligrosa debido a que los
ácidos oxidantes empleados generan vapores tóxicos e irritantes así como pueden producir
explosiones. Entre las ventajas se menciona la rapidez y utilidad si se manipula con cuidado,
permitiendo trabajar en presencia de materia grasa en la muestra permite romper cadenas
carbonadas mientras que la calcinación por vía seca no resulta suficiente.

8.3.2 Muestras biológicas

Se describe a continuación la metodología empleada para el caso de sangre, orina o
vísceras. Para sangre, se emplean 5 a 10 ml de sangre entera; para orina se usan 50 ml y
para vísceras se emplean 25 g vísceras desmenuzadas
Reactivos
Acido nítrico (p.a.)
Acido sulfúrico concentrado exento de Arsénico, Talio y Plomo.
Mezcla en la proporción 1: 2 de ácido perclórico y nítrico
Oxalato de amonio, solución saturada a temperatura ambiente.
Equipos
Balón de Kjeldahl de 100ml.
Procedimiento
Todo el procedimiento debe realizarse bajo campana de extracción de gases. Si se
trata de vísceras se coloca 25 g de vísceras desmenuzadas en un balón Kjeldahl de 250 ml de
vidrio Pyrex tratando de no tocar las paredes. Se agregan 30 ml de ácido nítrico concentrado y
se calienta sobre tela metálica hasta disgregar todo el material. Se continúa calentando
directamente sobre llama pequeña hasta disolver el material. Se retira y se deja enfriar.
Si se trata de orina, se miden 50 ml de orina y se calienta sobre tela metálica en un
vaso de precipitados hasta reducir a un quinto del original. Se pasa el líquido remanente a un
balón Kjeldhal de 100 ml y se incorpora 10 ml de ácido nítrico concentrado.
De allí en adelante se procede de la misma manera en ambos casos. Se agrega al
contenido del Kjeldhal 4-5 ml de ácido sulfúrico concentrado. Se calienta el contenido hasta
llegar a carbonizar la materia orgánica. En ese momento debe suspenderse el calentamiento
dado que se genera ambiente reductor y se perderán metales como el arsénico o el antimonio
por volatilización. Se deja enfriar y se agrega lentamente por el cuello del balón 4 ml de ácido
nítrico y se vuelve a calentar. El agregado de ácido nítrico se repite cuando se observe
oscurecimiento del material. Se continúa calentando y si se produce carbonización se agrega 4
ml la mezcla nitrico-perclórico. Se calienta nuevamente y si se observa nuevamente
oscurecimiento se agrega 4 ml de la mezcla nítrico-perclórico.
Se continúa calentando hasta la aparición humos densos y pesados de trióxido de
azufre. Llegado este punto, se retira el balón del fuego quedando un líquido incoloro o con un
ligero precipitado blanco o amarillento de sulfato de calcio o de hierro respectivamente.

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Dejar enfriar y luego agregar 3 a 4 ml de oxalato de amonio y se vuelve a calentar para

eliminar los restos de sustancias oxidantes hasta nuevamente humos blancos de trióxido de
azufre. Se deja enfriar y se agrega 1 o 2 ml de agua destilada y se calienta para desprender
vapores de agua. Se repite el agregado de agua y se calienta hasta humos blancos de trióxido
de azufre. Se continúa calentando hasta obtener un líquido residual de 2ml, se deja enfriar y se
trata el líquido y el residuo sólido si lo hubiera con agua destilada transvasándolo a un matraz
de 25 ml. En estos 25 ml de investigará los metales como Talio, Arsénico, Plomo y otros
metales de interés toxicológico.

8.3.3 Muestras de aguas

Para el caso de muestras de agua, antes de la recolección de la muestra debe tomarse
la decisión de que tipo de dato se desea obtener como ser: metales disueltos, suspendidos,
totales o recuperables totales.
Los llamados metales disueltos que son aquellos constituyentes metálicos que
atraviesan una membrana filtrante de 0,45 m. Los metales suspendidos que son los que
quedan retenidos por la membrana de 0,45 m, los metales totales corresponden a la
concentración determinada sobre una muestra sin filtrar seguida por una vigorosa digestión y
los metales recuperables totales corresponden a la concentración de metales en una muestra
sin filtrar seguida de un tratamiento con ácido mineral diluido caliente.
Para la recolección de las muestras de agua el recipiente debe ser de vidrio al
borosilicato, polietileno lineal, polipropileno o teflón que deben ser muy bien lavados con
detergente y agua corriente, enjuagado con ácido nítrico 1:1, agua corriente, ácido clorhídrico
1:1 y finalmente con agua destilada desionzada.

Procedimiento
Para la determinación de metales disueltos las muestras de agua deben estar libres de
turbiedad o filtradas a través de membrana filtrante de 0.45 m (previamente lavada con ácido
nítrico diluido). La muestra debe ser filtrada en el momento de la recolección y luego se
acidifica con 2 ml de nítrico concentrado por litro de muestra.
Para la determinación de metales suspendidos la muestra se filtra a través de una
membrana filtrante de 0.45 m (previamente lavada con ácido nítrico diluido) y el análisis se
realiza sobre la porción de muestra retenida en la membrana. Se transfiere la membrana a un
vaso de precipitado de 250 ml y se agregan 3ml de nítrico concentrado.
Cubrir el vaso con un vidrio reloj y calentar. Cuando se ha disuelto la membrana
incrementar el calentamiento y evaporar a sequedad. Enfriar y agregar 3 ml de ácido nítrico
continuar calentando hasta que se complete la digestión dado por un residuo de color claro.
Agregar residuo seco 2 ml de ácido clorhídrico (1+1) y calentar muy bien hasta disolver el
material. Lavar las paredes de vaso de precipitados con agua desionizada y filtrar si es
necesario para eliminar los silicatos u otros materiales insolubles que pueden obturar el
atomizador. Llevar al volumen original de la muestra con agua desionizada.
La concentración de metales totales resulta ser la suma de las concentraciones de las
fracciones disueltas y suspendidas.
La determinación de metales extraíbles se realiza después del agregado de ácido
mineral (2 ml/L) y del agitado vigoroso permitiendo que repose durante una noche. En muchos
casos esto representa el contenido metálico total si han sido disueltos todos los sedimentos.
La muestra está lista para el análisis cuantitativo mediante Espectroscopia de Absorción
Atómica.

8.3.4 Destrucción de Materia Orgánica (DMO) por vía seca

Este tipo de destrucción de materia orgánica resulta de elección en el caso de muestras
de alimentos que presenten una proporción de hidratos de carbono elevada. Esta técnica no es
adecuada en el caso de matrices que presenten elevado contenido de proteínas o lípidos. Se
realiza la DMO por calcinación de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y óxido de
magnesio que transforma el a los metales cuantitativamente en compuestos derivados de

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magnesio. En estas condiciones los metales no son volátiles. En el item denominado

determinación de arsénico se describe el procedimiento y el fundamento de las reacciones.
Luego, la muestra está lista para el análisis cuantitativo mediante Espectroscopia de
Absorción Atómica

8.4 Determinación de metales de interés toxicológico por absorción

atómica
Los metales en solución pueden ser muy bien determinados por espectroscopía de
absorción atómica. El método es simple, rápido y aplicable a un gran número de metales en
agua de bebida, desechos domiciliarios, barros, fluidos biológicos como las muestras de
sangre, orina o vísceras luego de una adecuada DMO.
Algunos metales como el antimonio, arsénico, oro, iridio, mercurio, osmio, paladio,
platino, rhodio, ruthemio, selenio, plata, talio, estaño y titanio requieren modificaciones en el
proceso de digestión.
Equipos
Espectrofotómetro de absorción atómica: debe poseer uno o dos canales haz de luz
simple o doble monocromador a red de difracción, detector fotomultiplicador, ranuras
ajustables, rango variable de 190 a 800 nm e interconección a un registrador.
Lámparas de cátodo hueco pueden utilizarse las del elemento simple o las multicátodo.
Reactivos.
Agua destilada desionizada
Acido nítrico concentrado grado espectroscópico.
Acido nítrico (1:1)
Acido clorhídrico (1:1)
Combustible y oxidante se usa generalmente acetileno comercial y aire proveniente de un
cilindro con aire comprimido.
Soluciones stock standard del metal
Preparación del estándar y la calibración.
Se preparan a partir de metales de alta pureza, sales de calidad analítica no higroscópicas
usando agua desionizada y ácido nítrico. Las soluciones stock se preparan en concentraciones de
1000 mg de metal por litro. Los standards de calibración se preparan por dilución de la solución
stock del metal en el momento del análisis y se descartan luego del uso. Se deberá preparar un
blanco y como mínimo cuatro estándares de calibración en intervalos de acuerdo al rango total
esperado. Se preparan empleando el mismo tipo y concentración de ácido usado en la
preparación de las muestras (ácido nítrico 1:1). Aspirar el blanco y las soluciones registrando las
lecturas. La curva de calibración debe cubrir un rango apropiado de concentración que produce
una absorción de 0 a 80 %.
Debido a que las concentraciones detectadas por este equipamiento son muy bajas
(ppm o ppb), debe evitarse interferencias de todo tipo. Una de ellas puede provenir del material
de vidrio utilizado. Por ello, debe mantenerse todo el material de vidrio en ácido nítrico 1:1
durante 24 hs, para luego realizar los lavados y enjuagues del material con agua bidestilada.

8.5 Métodos de Análisis para la determinación de metales

8.5.1 Investigación y determinación de Arsénico.

Generalidades de la intoxicación
Ell Arsénico se halla presente en las aguas subterráneas utilizadas como agua de
consumo. Por eso se lo halla también en los vegetales que lo absorben en la raíz o son
regados con dichas aguas. Los mariscos filtran grandes cantidades de agua y concentran el
As. El As forma parte también de algunos medicamentos orgánicos e inorgánicos usados
antiguamente. El arseniato de sodio se usó como colorante y el arseniato de cobre en vidrio,
papel y pinturas. En pirotecnia se usan compuestos de As para las llamas verdes. En algunos
casos el As se usó desde el punto de vista criminal.

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La sintomatología observada en casos de intoxicación pude distinguirse según sea

de tipo aguda o crónica.
Aguda:
- Vaso dilatación de los capilares sanguíneos con alteración de la permeabilidad de
los mismos.
- Vómitos, diarrea (pérdida de agua y sales), irritación de garganta, dolores faringes.
- Edemas subcutáneos. Hipertensión.
- Colapso, shock, coma. Muerte.
Crónica:
El As se une a albúmina, se absorbe fácilmente a las mucosas y se deposita en
hígado, riñón, huesos, pelos y uñas. Se elimina por orina y heces, pero se reabsorbe en el
tabulo contorneado proximal. Por lo tanto, debido a que la absorción es mayor que la
eliminación, se acumula. Los síntomas más característicos son:
- caída del cabello.
- mano en forma de garra y pie colgante
- en piel:
- erupciones
- * hiperqueratosis (engrosamiento de la piel de la palma de las manos y pies)
* hiperpigmentación (manchas oscuras)
-degeneración grasa del hígado que puede dar cirrosis.
-temblores por alteración del SNC con desequilibrio de Na y K
-fase final: cáncer de piel
Investigación toxicológica de arsénico
Para la determinación de arsénico en materiales biológicos, alimentos, etc, es
necesario destruir previamente la materia orgánica. El método empleado depende del
material biológico de que se trate.
Pelos y uñas
Se utiliza una mezcla de ácidos oxigenados concentrados que deshidratan, oxidan y
saponifican la materia orgánica.
Procedimiento:
En una cápsula de porcelana colocar 1 a 2 g de material. Si se trata de pelos es
conveniente humedecerlos con unas gotas de agua destilada. Agregar 1 ml de ácido sulfúrico
concentrado y 5 ml de ácido nítrico concentrado. Si es posible dejar en contacto varias horas.
Calentar progresivamente sobre tela metálica y luego en baño de arena. Cuando
aparecen humos blancos, retirar del baño de arena y agregar 2 ml de la mezcla constituida por
dos partes de ácido nítrico concentrado y una parte de ácido perclórico concentrado (70%).
Desde este punto en adelante, cuando se produzca oscurecimiento del líquido por
carbonización debe suspenderse el calentamiento del mismo pues en dicho medio reductor se
perderá As por volatilización.
Calentar hasta humos blancos y repetir este tratamiento hasta que el residuo sea
incoloro o blanquecino. Retirar del baño y agregar 10 ml de agua destilada. Calentar
nuevamente hasta residuo siruposo. Enfriar y tomar con 10 ml de agua destilada. El material
está listo para la determinación cualitativa y luego cuantitativa empleando Absorción Atómica.
Alimentos
Nos referiremos en particular al caso de alimentos en base a hidratos de carbono. Se
realiza la DMO por calcinación de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y óxido de
magnesio que transforma el As cuantitativamente en piroarseniato de magnesio. En estas
condiciones el As no es volátil. En este caso es adecuada una DMO por vía seca porque la
proporción de hidratos de carbono es elevada, ya que con la presencia de proteínas o lípidos,
se dificulta la ruptura de las grandes moléculas.
Procedimiento:
Colocar 10 g de muestra en cápsula de porcelana y agregar 3.5 ml de solución de
nitrato de magnesio al 20% y 0.1 g. de óxido de magnesio. Mezclar bien formando una papilla
y calentar primero a baño maría hasta sequedad, luego en baño de arena y por último en
triángulo de pipas hasta cenizas blancas. Enfriar y tomar el residuo con 10 ml de ácido sulfúrico
al 10%. Filtrar si es necesario a fin de obtener una muestra de aspecto límpido.
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MgO + 2 Mg(NO3 )2 +As2O3 Mg3(AsO4)2 + 4 NO2

Mg3(AsO4 )2 CALOR As2O7Mg2 (piroarseniato) + MgO

As2O7Mg2 +H2SO4 AsO4H3 + MgSO4

(ác. arsénico)
Determinación cualitativa.

Reacciones de identificación
Se realizan luego de la destrucción de la materia orgánica (DMO). Las mismas se
basan en las propiedades reductoras de la AsH3 o de ciertos reactivos.

Reaccción de Bougault:
En un tubo de ensayo colocar un volumen de líquido a ensayar con un volumen de
reactivo (ácido fosfórico) a baño maría durante 10 minutos. En presencia de compuestos
arsenicales aparece un color pardo oscuro a marrón cuya intensidad varía con la
concentración.

2 AsO3-3 + 3 H3PO2 3 H3PO4 + 2 As 0 (marrón)

La reacción tiene una sensibilidad de 100 ppm aumentada a 10 ppm si se agrega I 2.

El selenito actúa como interferencia pues da la misma reacción. Se requiere ausencia
absoluta de materia orgánica.

Reacción de Bettendorf:
En un tubo de ensayo poner un volumen de líquido más un volumen de reactivo . Calentar a
ebullición y dejar reposar. Si hay As aparece coloración parda oscura o marrón.

AsO3 -3 + 3 HCl Cl3As

2 Cl3As + 3 SnCl2 (2%) 2 As0 (marrón) + 3 SnCl4

Reacción de Gutzeit:
En un tubo de hemólisis colocar 1 ml de ác. sulfúrico al 25% Agregar 1 ml del líquido
problema y una granalla de Zn activado.
En la parte media del tubo colocar un trozo de algodón embebido en solución de
acetato de plomo al 1% y en la boca del tubo un papel de filtro sobre al que se coloca una
pequeña gota de una solución de nitrato de plata cuya concentración no sea menor del 50%
Colocar el tubo en baño de agua fría.
En presencia de As se obtiene una coloración amarilla característica. El papel colocado
en la boca del tubo puede pasar a color negro correspondiente a Agº debido a la humedad del
ambiente.

AsO4-3 + Zn + 11 H+ AsH3 + Zn+2 + 4 H2O

AsH3 + 6 NO3Ag As.Ag3.3 NO3Ag (amarillo) + 3 HNO3

As.Ag3.3 NO3Ag + 3 H2O AsO3-3 + 6 Ag0 ¯(negro) + 3 NO3- + 6 H+

La reacción tiene una sensibilidad de 10 ppm.

Determinación cuantitativa de arsénico
a) Método de Gutzeit:
Se basa en la formación de arsina por acción del hidrógeno naciente sobre compuestos
arsenicales. La arsina reacciona con un papel embebido en Cl2Hg formando complejos

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coloreados. La longitud e intensidad de la mancha es proporcional a la concentración de As la

cual se compara con manchas estándar.
El aparato consiste en un frasco cuyo volumen varía según la cantidad de As a
determinar (Fig. 1). Para cantidades de As entre 50 y 300 ppm se utiliza un frasco cuyo
volumen de 250 ml. Para cantidades de As entre 0,1 y 20 ppm el volumen del frasco es de 60
ml.

Lleva un tapón de goma con un orificio al que se ajusta un tubo de vidrio con un
estrechamiento; a éste se adosa otro tubo similar pero de menor diámetro en cuya parte
superior se coloca una banda de papel embebida con una solución de Cl2Hg y luego secado.
Reactivos.
Solución de acetato de plomo al 1%
Papel embebido en solución acuosa de cloruro de mercurio al 5%
Mezcla ácida
Alumbre férrico
Cloruro estannoso al 40% P/Ven ácido clorhídrico 60% V/V
Granallas de Zinc
Procedimiento
Colocar en la parte inferior del tubo de desprendimiento un papel de filtro plegado y
embebido en solución de acetato de plomo seco. Por el estrechamiento de este tubo introducir
lana de vidrio embebida en acetato de plomo. Finalmente, en la parte superior del tubo colocar
una tira embebida en Cl2Hg seco. El Ac2Pb retiene el SH2 (como SPb) que interfiere con el
color.
En el frasco colocar 20 ml de mezcla ácida, 2 ml de solución de alumbre férrico, 0,5 ml
de Cl2Sn. Agregar la capacidad de un crisol de 30 ml de granallas de Zn activado y llevar a
volumen de 200 ml con agua destilada y colocar por último una cantidad exactamente medida
de solución a ensayar.
El agregado de ClNa y H2O a la mezcla ácida produce un desprendimiento regular de
Arsina (AsH3). El alumbre férrico compleja el Sb que pudiera estar presente. El Cl2Sn disminuye
el sobrepotencial del Hidrógeno permitiendo la reducción.
Tapar perfectamente y colocar en baño de agua fría durante 45 minutos. Sacar la
banda de papel reactivo y sumergirla en una solución de KI al 10% que permite estabilizar el
color. Secar entre papel de filtro y comparar con bandas standard obtenidas operando de la
misma manera. En el caso de utilizar el frasco de 60 ml, las cantidades de reactivos varían.

AsO4-3 + 4 Zn0 + H+ <==========> AsH3 (arsina) + 4 Zn+2 + 4 H2O

2 AsH3 + 3 Cl2Hg <=========> As2Hg3 (amarillo pardo) + HCl

As2Hg3 + I-1 <===========> (I4Hg)3As3

La sensibilidad del método es de 50 ppm a 300 ppm

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Fig. 1: Equipo para determinación de arsénico por el método de Gutzeit cuali y cuantitativo.

Expresión de resultados: se indicará la cantidad de As sobre la masa de muestra pesada. Lo

habitual es expresar el resultado en mg/Kg de muestra.
b) Método de Vasac y Sedivec:
El método es similar al anterior con el fundamento de reducir cuantitavamente el
arsénico en la muestra con granallas de zinc y luego la arsina reacciona con una solución de
dietilditiocarbamato de plata en piridina formando un complejo color rojo que es medido
espectrofométricamente.
Reactivos:
Solución Estándar de Arsénico: disolver 0.1734 g de arsenito de sodio en 1000 ml de agua
bidestilada (solución A). Tomar 10 ml de esta solución (A) y llevar a 100 ml con agua
bidestilada (solución B). Tomar 10 ml de la solución B y llevar a 100 ml con agua bidestilada
(solución C)= 1 /ml.
Se preparan Estándar de 0, 1, 2, 5 10 y 20 g de As tomando 0,1, 2,5, 10 y 20 ml de la
solución patrón C.
loduro de potasio 15%
Acetato de plomo 10% P/V.
Acido clorhídrico concentrado
Solución piridinica de dietilditiocarbamato de plata (DDCAg) 0.5%
Granallas de zinc
Ioduro de potasio 15% P/V.
Cloruro estannoso al 40% P/Ven ácido clorhídrico 60% V/V
Procedimiento:
Una vez finalizada la mineralización se trasvasa cuantitativamente el contenido del
balón al erlenmeyer A del dispositivo de Vasac y Sedivec lavando el balón con cantidad
suficiente de agua destilada hasta un volumen de 25 ml. Paralelamente procesar un blanco
de reactivos sin mineralización previa. Agregar a continuación en 1 ml de ioduro de potasio
15% más 10 ml de ácido clorhídrico concentrado. Dejar reposar 2 minutos y agregar 0,5 ml
de solución de cloruro estanoso y dejar 15 minutos en reposo. La solución debe permanecer
incolora o ligeramente turbia. Si en la etapa final de la mineralización no se eliminó todo el
oxidante, el cloruro se convierte en Cl2 y aparece color amarillo en la solución).

Adaptar inmediatamente el tubo B que contiene algodón impregnado en acetato de

plomo y el tubo acodado C que contiene la solución piridinica de dietilditiocarbamato de
plata (DDCAg).
Finalmente se agregan tres granallas de zinc y rápidamente se cierra el equipo
asegurando que no existan pérdidas en las juntas. Trabajar en campana de extracción de
gases. Se deja burbujear (desprender hidrógeno) durante 30 a 45 minutos.
10
 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

En presencia de arsenamina el reactivo argéntico adquiere color rojo. Se realiza una

curva de calibración con 5 patrones. Realizar la curva de calibración representando
Absorbancia vs. g de As.
Leer la absorbancia del complejo formado a 540 nm y se calcula la concentración de
As en la muestra interpolando el valor de la absorbancia obtenida en una curva de
calibración.
Interpretación química de la reacción:
En el mineralizado el As se encuentra como AsO4H2. El agregado de ioduro de
potasio tiene por objeto transformar el AsO4H2- en AsO3H2- de acuerdo a la siguiente
reacción:

AsO4H2- + 2 H+ + 3I-  AsO3H2- + H20 + I3-

EI C12Sn además de actuar como despolarizante reduce el I3- formado:

I3- + 6Cl- + Sn2+  3I- + (Cl6Sn)2-

El Znº libera H naciente el cual reduce el AsO4H2- a arsenamina (AsH3)

La AsH3, al incidir sobre la solución piridínica de dietilditiocarbamato de plata que es de
color amarillo, forma con éste un complejo de color rojo. La reacción química es la siguiente:

N(Et)2 N(Et)2 N(Et)2

C S C S As/3 +
+ + C S
AH3 SH H2O + Agº
SAg S
color rojo

El acetato de plomo se utiliza para eliminar la interferencia del SH2 que en este caso
estaría presente por las condiciones reductoras de estos ensayos lo que favorecería la
transformación del SO42- en SH2 .

Límite de cuantificación:
En las condiciones de trabajo precedentes el límite de cuantificación es de 0,5 µg%.
Esta técnica permite determinar As total y es útil para la investigación en intoxicaciones agudas
y crónicas, pero no sirve para el seguimiento biológico de trabajadores expuestos al As
inorgánico.

8.5.2 Intoxicación por Plomo

Generalidades de la intoxicación
El origen de la intoxicación con Plomo puede ser:
Profesional: En la industria se usan compuestos organometálicos de Plomo como
antidetonantes. Revestimiento de cables, anticorrosivos, en pinturas y esmaltes (óxidos de
Plomo), imprentas de tipografía. En fundiciones e industrias de recuperación del metal.

Ambiental: El agua potable puede contaminarse a partir del polvo atmosférico. Las
tuberías de Plomo vuelcan el metal soluble al agua en condiciones ácidas.
En una intoxicación con Plomo, generalmente crónica, se verán afectadas
fundamentalmente dos enzimas de la vía de síntesis del Hem:
(a) Delta-ALA dehidratasa, que cataliza la conversión de ácido delta-amino
levulínico (delta-ALA) a porfobilinógeno en el inicio de la vía
11
 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

(b) ferroquelatasa que cataliza la introducción del Fe+3 en el anillo de la

protoporfirina IX para dar lugar a la formación del Hemo.
Esto va a derivar en una porfiria secundaria o adquirida, que, en forma crónica, se
manifiesta en el conjunto de síntomas característicos que constituyen el saturnismo.
En laboratorio se determina el Perfil Plúmbico, que consiste en la cuantificación de
delta-ALA (aumentada) y coproporfirinas (aumentadas) en orina y delta-ALA dehidratasa
(disminuída) y Plomo en sangre (aumentado).
Por otro lado se buscará también el punteado basófilo característico.

Investigación de intoxicación plúmbica

Determinación de Plomo en sangre (Plumbemia)
El método clásico para la determinación de Plomo en sangre es el método de Jacobs
modificado, que se basa en la formación del ditizonato de Plomo, una vez eliminados por
complejación y extracción los metales interferentes, y su lectura espectrofotométrica a 510 nm.
Las técnicas de absorción atómica son más rápidas y precisas. Tienen además muy alta
especificidad de manera que las interferencias son pocas. Por esto los pretratamientos utilizados
en las técnicas colorimétricas se simplifican enormemente. Raramente se usan para el análisis
cualitativo.
Los límites de detección para las técnicas de atomización en llama se encuentran en el
orden de los g/ml y los volúmenes de muestra requeridos son de alrededor de 2 ml. Los
coeficientes de variación son de 2 a 0,1%.
En técnicas en donde se realiza una atomización en horno de grafito se requieren
volúmenes de muestra de alrededor de 50 L, con límites de detección 10 a 100 veces
menores que en la atomización en llama. Los coeficientes de variación son de 10 a 1%.
Se describe a continuación la determinación de plomo mediante espectrofotometría de
absorción atómica en sangre por dos métodos:
1. Método del sobreagregado
2. Curva de calibración
En el método del sobreagregado, cantidades conocidas del analito es sobreagregado a
la muestra de sangre realizándose luego la hemólisis de la muestra. Se forma luego un
complejo metálico para realizar entonces una extracción en fase orgánica del mismo y la
posterior medida mediante atomización en llama.
La muestra de sangre se toma por punción venosa una vez desinfectada la zona con
alcohol, mediante jeringa descartable de plástico, previamente heparinizada. Se necesita del
paciente un ayuno de por lo menos 10 horas.
Todo el material a usar debe ser tratado previamente con ácido nítrico 1:1 durante 24
horas. Se enjuaga luego tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres
veces con agua bidestilada.
Reactivos:
Pirrolidín ditio carbamato de amonio (APDC) 4%: Se pesan 4 gr de APDC y se llevan a 100 ml
con agua bidestilada caliente. Luego se filtra en papel Whatman No4.
Tritón X-100 10%: Tomar 10 ml de Tritón X-100 y llevar a 100 ml con agua bidestilada tibia.
APDC 2%-Tritón 5%: Se mezclan volúmenes iguales de las soluciones anteriores que deben
ser preparadas en el momento de usar.
Metil isobutil cetona (MIBK): Por lo menos 24 horas antes, saturar en agua destilada MIBK,
dejando en contacto permanente ambos líquidos.
Solución madre de Plomo: Se pesan 1.5985 gr de (NO3 )2Plomo p.a. llevando a un litro con
ácido nítrico 1/1000. Se tendrá una solución de 1 mg/ml.
Solución testigo: 12,5 ml de la solución madre se llevan a 100 ml con ácido nítrico 1/1000. Se
tendrá una solución de 125 g/ml.(125 ppm).
Equipos.
Espectrofotometro de absorción Atómica.
Procedimiento:
1. Colocar 2,5 ml de sangre entera de la misma muestra en cada uno de dos tubos,
provistos de tapa y cierre esmerilado.

12
 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

2. A uno de los tubos agregar una cantidad conocida, por ejemplo 0,1 ml, de la solución
testigo de Plomo.
3. Paralelamente se preparan un blanco con 2,5 ml de agua bidestilada y un tubo testigo
con 2,5 ml de agua bidestilada y 0,1 ml de la solución testigo.
4. A cada uno de los tubos que contienen sangre se les adicionan 1 ml de la solución
APDC-Tritón. Se agitan los tubos en Vórtex, hasta hemólisis completa, durante
aproximadamente 15 segundos.
5. A los tubos blanco y testigo se les agregará 1 ml de la solución APDC 4%, pues la
solución APDC-Tritón con el agua forma emulsiones muy difíciles de separar.
6. Se agrega luego a cada uno de los tubos 2,5 ml de MIBK, agitando en Vórtex durante
aproximadamente 30 segundos. Se debe verificar que la mezcla sea adecuada. Se
centrifugarán luego durante 10 minutos a 3000 rpm.
7. Finalmente se separarán las fases superiores de MIBK. La fase orgánica debe tomar un
leve color amarillo y de no ser así se debe sospechar una agitación insuficiente y se
recomienda repetir la operación.
8. Los extractos de MIBK se nebulizan en el atomizador de llama y se leen contra MIBK,
controlando el cero del aparato después de cada medida.
Expresión de los resultados, para los siguientes valores:
Abs muestra = M
Abs muestra más testigo = M T
Cantidad de Plomo en muestra = P
Cantidad de Plomo sobreagregada = Pa
Absortividad = a
Longitud de la ranura del quemador = b
Volumen de la muestra = Vm
Volumen agregado de la solución testigo = Vt
Concentración del testigo en g / ml = Ct
.
Se tienen las relaciones M= a b . Pa
Vm
. .
M T=a b (Pa P)
Vm Vt

Despejando el valor de se llega a una relación, independiente de los valores de a y b, del

siguiente tipo
M Pa
P= M T .
Vm Vt - M____
Vm M T
Multiplicando este valor por el factor Ct xVt/Vm se obtendrá la concentración de Plomo en
g / ml.

b) Método empleando curva de calibración:

Este método es similar al anterior con las siguientes modificaciones: se construye una
curva de calibración con sobreagregado de plomo concentración conocida a 5 tubos de
muestra entera de sangre. La curva se construye de la siguiente manera:

De la solución madre de Plomo (1000ppm), tomar 12.5 ml y llevar a 100 ml con ácido
nítrico 1/1000.De esta manera se obtiene una solución de Plomo de 125ppm.
Realizar una curva de calibración con sangre de la siguiente manera
En 5 tubos se colocan 2.5ml de sangre en cada uno y agregar 0, 5, 10, 15, 20 microlitros de la
solución de Plomo de 125 ppm.

Tubo Microlitros de plomo de Concentración de plomo

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 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

solución 125 ppm

1 0 X
2 5 X+25 µg/ 100 ml Plomo
3 10 X+50 µg/ 100 ml Plomo
4 15 X+75 µg/ 100 ml Plomo
5 20 X+100 µg/ 100 ml Plomo

1. Agregar 2 ml de APDC y tritón y luego agitar en vórtex durante 60 segundos. Luego

agregar 2 ml de MIBK durante 30 segundos.
2. Todos los demás pasos se conservan tal cual, incluido el tratamiento de la muestra
problema (cantidades, concentraciones, etc.)
3. La sangre empleada para realizar la curva debe ser de banco asegurando que no
contiene plomo mas allá de los valores normales. Es conveniente siempre contar con un
vial con sangre y cantidad conocida de plomo sobreagregada (standard interno) a modo
de verificar los resultados obtenidos.
4. Debe recordarse que el material de vidrio debe estar escrupulosamente manteniéndolo
en ácido nítrico 1:1 durante 24 hs para luego lavarlo con agua bidestilada.

Valores de referencia para la población de Capital Federal y alrededores

Niños no expuestos: 17 ± 8 g %
Adultos no expuestos: 19 ± 7 g %
Adultos expuestos: 57 ± 21 g %

Valor límite para el sujeto expuesto: 70 g % (según Working Conference, Amsterdam

1968).

Determinación de Porfobirinogeno (PBG) orina. Ensayo rápido

1. Se utiliza como muestra la orina recolectada en las condiciones correspondientes a la
determinación de coproporfirinas totales (pH = 7.8) ver item 5.3.2.4. ya que el plomo se
polimeriza en medio ácido dando uroporfirina.
2. En un tubo pequeño a 2 ml del reactivo de Erlich (2 g de p-dimetil aminobenzaldehído
en 50 ml de HCl y 50 ml de agua destilada) se agregan 1 - 2 gotas de orina. Al cabo de
2 segundos un desarrollo de color rosado a rojo al tope de la solución indica un test
positivo para PBG.
3. El color amarillo que se observa a veces, se debe a compuestos tales como urea y
urobilinógeno que no desarrollan color en esas condiciones hasta una concentración de
200 mg/g.
4. En una intoxicación con Plomo se encontrarán valores de PBG en orina normales o
disminuidos. Si se hallaran valores aumentados, sería indicio que la porfiria manifestada
es de otra naturaleza, por ejemplo de tipo congénito.

Determinación de Acido Delta Aminolevulínico (delta ALA) en orina. Método de Berkó-

Durkó modificado, Clinical Chem. Lab., 1973.
La reacción se fundamenta en la reacción del delta ALA con acetilacetona dando un
compuesto pirrolico (2 metil, 3 acetil 4 – (3 propion) pirrol) que condensa luego con el reactivo
de Erhlich originado un compuesto rojo que se determina por espectrofotometría a 553 nm.
Muestra:

Orina correspondiente a 24 horas recolectada en frasco oscuro conteniendo solución

saturada de ácido tartárico aprox. 1 ml/ 100 ml de orina.
Reactivos.
1. Reactivo de Erlich modificado = 1 gr de p-dimetilaminobenzaldehído se disuelve en 35
ml de ácido acético glacial, se agregan 8 ml de ácido perclórico 70% y se lleva a 50 ml
con ácido acético glacial.
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 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

2. Solución acetato de sodio 0.5 M: 41 gr de AcNa se disuelven en 1 litro de agua

destilada.
3. Solución AcH 0.5 M: 28.7 ml AcH glacial se llevan a 1000 ml con agua destilada.
4. Buffer acetato: 93.2 ml AcH 0.5 M más 6.8 ml AcNa 0.5 M (pH=3.5).
5. Solución diluyente: 0.25 gr de carbón medicinal se agregan a 100 ml de solución buffer
acetato 0.5 M.
6. Estándar de delta-ALA 400 g/ml: se disolverán 4 mg de delta-ALA p.a. en buffer
acetato, llevando a 10 ml totales.
Equipos.
Espectrofotómetro UV-visible
Baño termostático
Centrífuga hasta 500 rpm
Procedimiento:
1. Transferir 1 ml de orina (pH 6 – 6.5) a un tubo de centrífuga y agregar 9 ml de
solución diluyente. Mezclar durante unos minutos y centrifugar.
2. Filtrar por papel de filtro y transferir 2 alícuotas de 2 ml c/u del filtrado a sendos
tubos de ensayo B y D (Blanco y Desconocido, respectivamente). Al tubo D se
le agrega 0.1 ml de acetilacetona y ambos tubos se llevan a baño María (BM)
hirviente durante 20 minutos.
3. Se enfrían entonces los tubos en baño de agua y se le agrega 2 ml de Reactivo
de Erlich a cada una. Luego de 15 minutos se lee la absorbancia del tubo D a
553 nm contra el tubo blanco.
4. La cantidad de delta ALA se obtiene a partir de una curva de calibración
expresada en g/ml. Se tomarán soluciones de 50, 30, 10, 5 y 1 g/ml, diluyendo
la solución standard original de 400 g/ml. sobre ellas se realiza la reacción de
Erlich en forma análoga a la realizada sobre las muestras.
Observación: La reacción del delta ALA con el reactivo de Erlich es muy sensible aunque no
específica pues también la dan las aminocetonas y las glucosaminas. Desde el punto de vista de
la determinación del perfil plúmbico, estas interferencias no tienen relevancia en los rangos de
concentración de -ALA halladas en el saturnismo.

Valores normales 0.1 a 0.5 mg% para menores de 15 años

0.1 a 0.6 mg% para adultos
excreción urinaria 1.3 a 7 mg/24 hs.

Ensayo para porfirinas en orina

Se trata de un test rápido cuyo resultado es positivo desde valores de concentración de 70
g% (1 mol/L).
Reactivos
Acido acético
Alcohol amílico
Eter etílico
Procedimiento
En un tubo de ensayo se colocan 2 ml de una mezcla de igual volumen (1:1:1) de ácido
acético, alcohol amílico y éter dejando caer sobre ella 15 ml de orina. Luego de 2 minutos el
reactivo habrá extraído la mayor parte de las porfirinas presentes por lo que se separara una
capa superior en el tubo. Si esta capa superior muestra fluorescencia roja, el test es positivo.
El ensayo se puede hacer más sensible transfiriendo la fase orgánica superior con una
pipeta Pasteur a otro tubo conteniendo 1 - 2 gotas de HCl. Se agita fuertemente (10 - 20 seg)
y se observa la capa clorhídrica inferior a la luz UV.
También puede hacerse una prueba mediante 10 ml de orina, 0.5 ml de AcH glacial y talco,
agitando vigorosamente, para observar la fluorescencia en el tubo.
Determinación de coproporfirinas totales en orina. A.A.Fernández; R.J. Henry,
H.Goldenberg Clin. Chem. 12, 463 - 474, (1966).

15
 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

El método se fundamenta en la extracción de coproporfirinas a pH adecuado con acetato de

etilo para la posterior oxidación del coproporfirinógeno remanente a coproporfinas que luego se
extraen con ácido clorhídrico y posterior lectura en espectrofotómetro a tres longitudes de onda
a efectos de corregir las interferencias
Muestra:
Orina correspondiente a 24 horas recolectada en un frasco oscuro conteniendo CO3Na2
como conservador en cantidad suficiente para una concentración final de 0.1 - 0.5%. El CO3Na2
tiene como finalidad de evitar las pérdidas de coproporfirinas fundamentalmente, conservando
a pH 5 - 9.5. En estas condiciones, la mayor parte de los coproporfirinógenos pasarán a
coproporfirinas.
Reactivos
1. Acetato de sodio 1%: 10 g de sal anhidra o 16,6 g de acetato de sodio trihidratado se
disuelven en agua y se llevan a 1000 ml. La solución es estable varias semanas a temperatura
ambiente.
2. Buffer acetato de sodio (pH = 4,8): se mezclan 1 vol. de acético glacial con 4 vol. de
solución saturada de acetato de sodio y 3 vol. de agua.
3. Solución saturada de acetato de sodio: la saturación se facilita mucho disolviendo el
acetato de sodio a 70 - 80o C. Si el acetato de sodio no cristaliza al enfriarse el agua, se
calienta de nuevo la solución y se añade más sal. Se puede usar sal anhidra o trihidratada.
4. Solución alcohólica de iodo al 1% (de reserva): Se disuelve 1 g de iodo en alcohol y se
diluye hasta 100 ml. Conservar en heladera en frasco oscuro con tapón de vidrio.
5. Solución de iodo al 0,005%: se diluyen 0,1 ml de la solución de reserva en agua
destilada hasta 20 ml. Se debe preparar en el momento de usar.
6. Acido clorhídrico 1,5N se añaden 12,5 ml de HCl a 50 ml de agua destilada
aproximadamente y se diluye hasta 100 ml.
Equipos:
Espectrofotómetro UV visible.
Procedimiento:
1. Se debe controlar el pH de la orina con papel indicador de manera que se
encuentre en el rango de 5 a 9.5; no se debe trabajar con muestras cuyo pH sea
inferior a 5.
2. Posteriormente, se debe examinar la muestra de orina a la luz UV y si tuviera
fluorescencia roja se debe diluir la misma con agua en una relación 1:10.
3. A 20 ml de orina se le agregan 10 ml de buffer acetato (pH = 4.8) y se transfiere
a una ampolla de decantación. Se le agregan 30 ml de acetato de etilo y se agita
suavemente durante 3 a 5 minutos. Se deja reposar y se descarta la fase
acuosa.
4. La fase orgánica se lava 3 veces con 5 ml de acetato de sodio 1% cada vez. Se
colectan los extractos orgánicos, descartándose la fase acuosa y se agregan 2
ml de solución de iodo al 0.005% preparada en el momento, no dejando más de
5 minutos en contacto ya que el tiempo es crítico. Se desecha la solución de
iodo y finalmente se efectúan tres extracciones o hasta que la capa orgánica no
presente fluorescencia, con 2.5 ml de HCl 1.5 N cada vez. Se recoge el extracto
clorhídrico en un tubo graduado midiendo este volumen.
5. En forma alternativa puede realizarse una separación mediante el sembrado de
1 ml de orina en una columna de intercambio aniónico Dowex 1X8, dejando eluir
con 3 ml de agua destilada. Se eluyen luego las porfirinas con HCl 3 N hasta
fluorescencia negativa.
6. A continuación, se lee la absorbancia del extracto clorhídrico a tres diferentes:
380, máximo entre 400 y 410 (generalmente 402) y 430 nm.

Expresión de resultados:

A corregida = 2 A max - (A 380 + A 430 )

1.835

16
 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

Coproporfirinas ( g/24 hs) = A corregida . V c .V t . D

. V alícuota orina
donde:

A 380 y A 430 : indican absorbancia a 380 y 420 nm, respectivamente

A max : indica la absorbancia máxima en el rango 400 - 410 nm
Vc : volumen total de los extractos clorhídricos
Vt : volumen total de orina recolectada en 24 hs.
D: factor de dilución, si se diluyó la orina
: coeficiente de extinción (ml/ g) de coproporfirinas en HCl 1.5 N = 0.673

Valores normales = 0 - 160 g / 24 hs.

Determinación de la actividad de la enzima Delta- aminolevulinico dehidratasa. Berlin, A;
Schaller, H.M.. Klim. Chim. Klim. Biochem., 12, 389-390 (1974).
Muestra:
Se utiliza sangre entera que debe ser recogida con jeringa descartable de plástico
usando heparina como anticoagulante, en un volumen mínimo de 1 ml. No deben emplearse
NaF ni EDTA debido a que inhiben la actividad enzimática. La misma muestra puede usarse
para la determinación del hematocrito y Plomo.
La muestra se mantendrá en heladera a 4oC hasta su procesamiento. Se recomienda
efectuar la determinación en el día de recolección, pues la actividad enzimática desciende en
un 12% a 15% luego de 24 horas.
El material de vidrio deberá ser preferentemente de borosilicato. Para ser utilizado es
necesario tratarlo previamente con HNO3 1:1 durante 24 horas. Posteriormente enjuagarlo tres
veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces con agua bidestilada,
para evitar cualquier contaminación. El material de plástico será preferentemente de
polipropileno.
Reactivos:
1. Buffer fosfato: 29 ml de fosfato disódico 0.1 M con 71 ml de fosfato monosódico 0.1 M.
Ajustar el pH a 6.4 con la solución correspondiente. Mantener en heladera a 4oC.
2. Buffer sustrato: disolver 0.01676 gr de -ALA p.a. en 5 ml de fosfato monosódico 0.1 M,
llevar a pH 6.4 con fosfato disódico 0.1 M. Completar a 10 ml con buffer fosfato de pH
6.4. Se conservará en freezer a -18oC.
3. Reactivo de Erlich: Disolver 0.24 gr de p-DMAB en 7.2 ml de ácido acético glacial,
posteriormente agregar 1.92 ml de ácido perclórico, completando a un volumen de 12
ml con ácido acético glacial. Se prepara en el momento de usar o se mantiene en
heladera a 4oC.
4. Ácido tricloro acético (TCA) 10%: Pesar 10 gr de TCA y disolver en 100 ml de agua
destilada.
Equipos.
Espectrofotómetro UV-visible
Baño termostatito
Centrífuga
Procedimiento:
1. A un volumen de 0,2 ml de sangre agregar 1,3 ml de agua bidestilada y 1,0 ml
de buffer sustrato. Se produce la hemólisis total de la muestra de sangre.
2. Paralelamente se procesa un blanco con 0.2 ml de sangre a la que se le agrega
1,3 ml de agua bidestilada, 1 ml de TCA 10% y 1 ml de buffer sustrato. Incubar
los tubos de blanco y muestra durante 60 minutos a 38oC; el tiempo de
incubación se empieza a contar desde el agregado de buffer sustrato a las
muestras.
3. Cumplido el tiempo de incubación, se le agrega al tubo de muestra 1 ml TCA
10%. Se centrifugan luego todos los tubos durante 10 minutos a 2000 RPM.
17
 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

4. Reacción de color: A un volumen de 1.5 ml del centrifugado agregar 1.5 ml de

reactivo de Erhlich. Mezclar en Vórtex y leer luego de 10 minutos las
absorbancias respectivas contra reactivo de Erhlich a 555 nm.
Expresión de resultados:

Act delta ALA DEHIDRATASA = Abs x 100 x f x D

Hto x t x m
donde:
Abs. Es la absorbancia de la muestra menos la Absorbancia del blanco
m: coeficiente de extinción molar en l / mol. cm = 0.062
Act ALA DEHIDRATASA: en U/ L de hematíes
f: factor de conversión de deltaALA a Plomo = 2
D: factor de dilución = 35
t: tiempo de incubación.

Valor de referencia para la actividad enzimática en sujetos sanos no expuestos al plomo:

mayor a 20 U / L hematíes
Determinación de Plomo en una muestra de alimentos de origen vegetal por el
método de absorción atómica
La determinación de la concentración de Plomo se puede realizar sobre cualquier tipo
de una muestra de alimentos, en este caso se presenta el protocolo ya puesto a punto para el
caso de muestras de producto vegetales y en particular tomate enlatado.
El primer paso del análisis, consiste en una digestión de la materia orgánica (DMO) para
volver más sencilla la matriz que contiene el analito, así como obtener una solución límpida y
más fluida que la muestra original, hecho que facilita el proceso de inyección de la muestra.
Reactivos.
Ácido nítrico concentrado libre de plomo.
Equipos.
En este caso se describe el procedimiento para un equipo Shimadzu AA-6701F provisto
de un quemador con cámara de premezclado y horno de grafito.
Digestor de microondas ―CEM modelo MDS 2100‖.
Procedimiento.
La DMO se realiza en un digestor de microondas especialmente diseñado. Se pesan 0,5
gr. de la muestra a digerir, y se colocan dentro de un vaso especial, junto con 5 ml de ácido
nítrico concentrado de calidad pro-análisis, mas 1 ml de agua desionizada.
Los tubos de digestión y la tapa de ellos son de teflón. En la tapa se distingue una
válvula de seguridad, a la cual debe acoplarse un tubo que conecta el vaso con un recipiente
situado en el centro del aparato, este recipiente sirve como trampa para los vapores nitrosos
que salen del vaso, y/o para recibir cualquier sustancia que salga del vaso. La válvula de
seguridad debe revisarse en cada utilización del aparato, esta consiste en una membrana,
semipermeable, que permite la salida del vapor contenido en el vaso si la presión desarrollada
dentro de este resulta excesiva. La tapa se ajusta al vaso, por medio de un cierre a rosca
hecho de keblar. Una vez cerrado el vaso, se encamisa con un tuvo hecho del mismo material
que el cierre.
Luego de armar los vasos con las muestras a digerir, se disponen en un carrusel
situado dentro del horno, y se conecta el tubo de seguridad que corresponde a cada uno. Uno
de los vasos que se utiliza tiene una tapa diferente a las otras. Esta estará provista de tres
salidas, una se usa para introducir una fibra óptica que hace las veces de sensor de
temperatura, a otra de las salidas se conecta el sensor de presión, y la última se utiliza para
acoplar el tubo de seguridad.
Una vez que se introdujeron todos los vasos a utilizar, se procede a la programación del
esquema de calentamiento. Se elige es la presión y temperatura usada durante ese proceso.
Antes de comenzar la digestión, limpiar escrupulosamente los vasos, las tapas, los cierres, y
las camisas de los vasos, con un paño limpio y seco.

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 Manual de Técnicas Analíticas en el Laboratorio de Toxicología

Al terminar el proceso, se debe esperar a que se enfríen los vasos para que disminuya
la presión en ellos, luego, se retiran los vasos, se trasvasa su contenido a un matraz de 10 ml y
se lleva a volumen con ácido nítrico 15%.
La digestión debe ser evaluada por el operador, considerándose terminado el proceso,
cuando el producto sea una solución límpida, sin residuos sólidos. Si esto no sucede, se debe
someter la muestra a un nuevo ciclo de digestión.
Curva de calibración:
La determinación de la cantidad de Plomo en la muestra se realizara en base a una
curva de calibración que se confecciona con una serie de soluciones estándar. Estas
soluciones son preparadas a su vez, a partir de una solución madre comercial pro-analisis cuya
concentración es 1000 mg/L, o 1000 ppm. El metal se encuentra por lo general en forma de
nitratos o sulfatos solubles, esta solución esta casi libre de la presencia de otros metales. Las
soluciones que se recomiendan en general son: 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 30 ppm, 50 ppm.
Estas soluciones se prepara tomando 50 ml de la solución madre, que se llevan a 500
ml con agua destilada desionizada. Con eso se tiene una solución de concentración igual a
100 ppm de plomo. De esta se preparan las soluciones estándar, tomando 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml,
3 ml, 5 ml, para luego llevar a un volumen final de 100ml con ácido nítrico 15%. Además se
usara una sexta solución patrón para definir el 0 de concentración, este no es mas que una
solución de ácido nítrico 15%.
Cálculos:
La concentración en la muestra se determina mediante la siguiente expresión:

ppm ppb.leida * 0.02

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