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Prefacio

El proposito de este libro es presentar una serie de temas relacionados con la


fisica y la fisicoquimica de sistemas biologicos; la designacion de un libro como de
Biojisicoquimica es tan licita como si 10 hubieramos llamado de Biofisica 0 Fisica
Biologica. La seleccion del contenido se realizo en base a los temas desarrollados en
los cursos de Biofisica y Biofisicoquimica de la la Facultad de Ciencias Exactas de la
Universidad Nacional de La Plata, de los cuales me he ocupado casi cuarenta arros.
Si bien la audiencia a la que esta destinado es primariamente alumnos de grado
que han recibido previamente buenos cursos de Fisica, Quimica, Fisicoquimica y
Biologia, al menos algunos temas pueden ser de interes para otros lectores.
El hilo conductor dellibro es el agua, tanto por la importancia que la misma tiene
para los seres vivos como por la necesidad de contar con conocimientos de cierta
profundidad sobre el particular para el desarrollo de otros temas elegidos, temas que
-como 10 es la interaccion hidrofobica- no son en general desarrollados con suficiente
detalle en los textos regulares, e incluso, en algunos textos especializados.
La seleccion, como siempre con cierta arbitrariedad que responde al gusto per-
sonal, no pretende ser completa -ni el libro un tratado-, sino cubrir un hueco en
la literatura de este nivel, ya que ellector interesado en todos los temas consider a-
dos deberia recorrer un gran numero de libros y trabajos originales diferentes para
poder extraer la informacion, a 10 que deberiamos sumar la dificultad de unificar el
significado de simbolos y, en muchos casos, de conceptos.
El estudio de un tema complejo, como 10 es el estudio de los sistemas biologicos,
demanda el conocimiento de diversas tecnicas cuyo aprendizaje previo, que en abs-
tracto seria la mejor opcion, puede llevarnos a perder el motivo de estudio. Es
por eso que he tratado de incorporar los elementos tecnicos a 10 largo del texto y
con la mayor simplificacion posible compatible con la rigurosidad. En ese intento
ciertamente hemos perdido detalles pero me parecio el unico camino para evitar
un libro de tamarro monumental y, en consecuencia, definitivamente inutil como
texto. Para algunos, ciertos detalles seran excesivos y para otros insuficientes, pi do
anticipadas disculpas.
La idea de la obra es aumentar la complejidad gradualmente partiendo con el es-
tudio del agua (Capitulo I) para luego incorporar solutos tanto polares (Capitulo II)
como no-polares (Capitulo III). Este ultimo capitulo hace uso de los conocimientos
de los dos primeros y se adentra en un tipo de interaccion que resulta fundamental
no solamente para los sistemas biologicos sino que tiene alta relevancia industrial.
En el Capitulo IV se consider a la hidratacion de macromoleculas tanto en solucion
como en est ado cristalino y se hace enfasis en la relacion entre la hidratacion y la
funcion de las macromoleculas biologicas. Se indican alIi algunas de las tecnicas que
trascienden el estudio de la hidratacion y, como los metodos de difraccion, hacen al
estudio de la relacion estructura-funcion molecular. Pasamos luego (Capitulo V) al
estudio de los flujos abandonando el enfoque molecular. Se exponen en ese capitulo
los concept os de la termodinamica de no-equilibrio en terminos simples pero de ade-
cuada rigurosidad y se desarrolla el tema de osmosis en equilibrio y fuera de el. El
transporte a traves de membranas celulares se present a en el Capitulo VI y las con-
secuencias de los diferentes procesos en la generacion de potenciales trans-membrana
en el Capitulo VII. El ultimo capitulo (Capitulo VIII) vuelve sobre algunos de los
concept os anteriores (potenciales, osmosis, etc.) poniendolos en el contexto celular.
Para no perder la liniea de la exposicion se han dejado algunos topicos para los
apendices.
El primero de ellos (A) present a un brevisimo resumen de concept os de Mecanica
Estadistica, los cuales se requieren para una comprension apropiada de ciertos temas.
El apendice siguiente (B) present a algunas tecnicas espectroscopicas; se pone prin-
cipal enfasis en la resonancia magnetica nuclear y su aplicacion a proteinas. Su
contenido es indispensable para comprender cabalmente el desarrollo del estuido de
hidratacion de proteinas.
Pese a que podria caber en el apendice anterior, la exposicion de la resonancia
magnetica pulsada se dejo para otro separado (Apendice C), ya que se entra en
ciertos detalles importantes pero no imprescindibles para seguir la linea conceptual.
Si bien no es necesaria su lectura para seguir los argument os del texto, puede ser de
utilidad para quienes quieran adentrarse en el estudio de la resonancia magnetica
multidimensional. Por ultimo, en el Apendice D se incluyen definiciones de unidades
y valores de algunas constantes fisicas.
La experiencia muestra que es realmente util contar con una recopilacion de est os
datos. Hemos incluido un indice alfabetico de temas. La tarea ciclopea necesaria
para preparar este tipo de indices hace que la primer a intencion sea no hacerlo; sin
embargo, la conviccion de su enorme utilidad -verificada en nuestra condicion de
lectores- nos ha hecho superar aquella primer a intencion.
La bibliografia en un texto cientifico puede tener dos propositos: llevar allector
a la fuente original y proveer lectura adicional sobre el tema. En cada capitulo se
da la lista de la literatura cit ada brindando al lector interesado la referencia de los
trabajos originales asi como un pequeno numero de textos (generalmente libros 0
trabajos de revision) para ampliar los diferentes aspectos.

II
Una obra, por modest a que sea, no es producto exclusivo de una persona. Es
imposible agradecer especificamente a todos los que colaboraron en la realizacion
del libro, pero al menos nombrare a quienes tuvieron un papel mas directo. Una
buena parte de las figuras fueron realizadas por el Lic. Juan F. Grigera, la Dra. Ines
G. Mogilner comenzo con parte de la revision en las etapas preliminares; la tarea
de correccion y critica del Dr. Santiago A. Grigera es de destacar por el cuidado
y detalle de las mismas que redundaron en una mejora notable del material final.
Gran parte del material, si bien no en la forma que se present a aqui, fue preparado
con otros propositos y con la participacion de los doctores Lesser Blum y Eugene H.
Stanley; su aporte a la discusion y propuestas sobre aspectos de agua y electrolitos
fue de importancia para el resultado final. Quiero agradecer especialmente su amplia
generosidad al permitir la libre disposicion del material para esta publicacion. Los
doctores Juan de Xammar Oro y Fernando Vericat, asi como otros colaboradores y
alumnos a traves de discusiones y comentarios a veces no conectados explicitamente
con el libro, contribuyeron a una mejor presentacion de algunos temas. Para la
preparacion formato final dellibro he utilizado el comando de estilo apropiado que
me fuera provisto por Dr Roberto Marceca. La actividad del equipo de produccion
de EUDEBA fue fundamentel para una adecuada presentacion de la obra.
Este libro fue realizado en mi condicion de Profesor de la Facultad de Ciencias
Exactas de la Universidad Nacional de La Plata y miembro de la Carrera del Inves-
tigador del Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas (CONICET),
gran parte durante el ejercicio del ano sabatico. Tanto a las personas como a las
instituciones quiero agradecer sinceramente el apoyo recibido sin el cual ciertamente
esta obra nunca se hubiera terminado, y tal vez ni siquiera iniciado.
Dejo para el final el agradecimiento a mi Senora. La redaccion de un libro en los
"rat os libres", como ocurre en nuestra vida cientifica, requiere un apoyo, aliento y
paciencia notables, que quiero destacar particularmente.

J. Raul Grigera
La Plata, octubre 2010

III
1

,
Indice general

Prefacio I

Indice de figuras 5

I. El agua 13
1.1. La molecula de agua ............................... 13
1.1.1 Composicion isotopica. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. 13
1.1.2 Estructura de la molecula de agua ................. 14
1.1.3 Propiedades electricas ................................. 15
1.1.4 Interacciones moleculares ........................ 16
1.2. El enlace de hidrogeno ............................... 21
1.3. Potencial de interaccion para agua ......................... 23
1.4. Hielo....................................................... 24
1.4.1 Estructura del hielo h ................................ 26
1.5. Defectos y propiedades electricas del h .................... 31
1.6. La fase liquida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
1.6.1 Algunas propiedades del agua liquida .................. 35
1.6.2 La estructura del agua liquida ......................... 38
1.6.3 Modelos para del agua liquida ......................... 44
1.6.4 Propiedades dinamicas del agua ....................... 45
1.7. El est ado vltreo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48
II. Soluciones 55
ILL Potencial quimico de soluciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 55
11.1.1 Actividad individual de iones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
11.2. Hidratacion inonica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 65
11.2.1 La esfera de hidratacion . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 66
11.2.2 Dinamica de hidratacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
11.2.3 Iones "promotores" y "destructores" de estructura . . . . 72
11.3. La serie liotropica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2

11.4. Sustancias hidrofilicas ....................................... 76


Il.4.1 Clatratos .............................................. 79
III. Interacci6n Hidrof6bica 83
IlLI. Termodinamica del efecto hidrofobico ....................... 83
III. I. 1 Experimentos de relajacion ............................. 85
IlL2. Dinamica, estructura y termodinamica ..................... 87
IlL2.1 Hidratacion hidrofobica ................................ 88
IlL2.2 Interaccion hidrofobica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 89
IlL2.3 Efectos de la temperatura .............................. 92
IlL2.4 Efectos de la presion .................................... 93
IlL2.5 Otros factores que modifican la interaccion hidrofobica .. 94
IlL3. Los moment os hidrofobicos y la amfifilicidad ............... 96
IlL3.1 Parametros de solvatacion atomica (PSA) ............... 96
IlL3.2 La energia de solvatacion y el plegamiento de proteinas. 98
IlL3.3 Momentos hidrofobicos ................................. 98
IlI.4. La medici on de la Iinteraccion hidrofobica ................. 102
IlI.4.1 Coeficientes de particion y su interpretacion en terminos
de hidratacion hidrofobica ............................ 102
IlL4.2 Balance hidrofilico-lipofilico (BHL) ................... 104
IlL5. Hidrofobicidad general y especifica ........................ 105
IlL6. El desarrollo futuro ....................................... 106
IV. Hidrataci6n de biomacromoIeculas 111
IV.1. Agua "ligada" ............................................ 112
IV.2. Hidratacion especifica y general ........................... 114
IV.3. Las tecnicas experiment ale sy su escala de tiempo ......... 115
IV.4. Estrategias para el estudio de la hidratacion ............... 116
IV.5. Hidratacion de proteinas en est ado solido ................. 117
IV.5.1 Sorci on ................................................ 118
IV.5.2 Sorci on de agua en proteinas y acidos nucleicos ....... 122
IV.5.3 Tecnicas de difraccion ................................ 126
IV.5.4 Resonancia magnetica nuclear ........................ 138
IV.6. La hidratacion: el est ado actual ........................... 145
V. Flujos 151
V.l. El concepto de flujo ........................................ 151
V.1.1 Flujos y fuerzas generalizadas ......................... 152
V.2. El est ado estacionario ..................................... 156
V.3. El fenomeno osmotico ...................................... 158
V.3.1 La presion osmotica de una solucion ................... 159
3

V.4. Osmosis a traves de membranas reales ..................... 162


V.4.1 Termoosmosis y la presion termoosmotica. . . . . . . . . . . . .. 166
V.5. AnaJisis compartamental. .................................. 171
V.5.1 Compartimientoe fisicos y quimicos .................... 173
V.5.2 Trazadores ............................................ 174
V.5.3 Modelos ............................................... 175
V. 5.4 El procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 177
VI. Transporte a traves de membranas celulares 183
VI.I. Transporte pasivo .......................................... 183
VI.2. Transporte activo ......................................... 187
VI.2.1 Termodinamica del transporte activo .................. 188
VI.2.2 El mecanismo del transporte activo ................... 190
VII. Potenciales de membrana 195
VII.I. El potencial de difusion .................................... 195
VILLI La ecuacion de Goldman .............................. 197
VII.I.2 La ecuacion de Hodking Katz ......................... 199
VII.2. Los potenciales de celulas exitables . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 199
VII.2.1 El potencial de reposo ................................. 199

VIII. EI agua en las celulas 205


VIlLI. El comportamiento osmotico de las celulas 205
VIII. I. 1 Osmosis en celulas animales ........................... 206
VIII. 2. El efecto Dnnan y el equilibrio osmotico ................... 207
VIII.2.1 El efecto osmotico en un sistema Donnan .............. 212
VIII.2.2 El efecto Donnan en las celulas ....................... 213
VIII. 3. El comportamiento osmotico: otra consideracion ........... 214

Apendices 217
A. Mecanica estadistica 219
A.I. El conjunto microcanonico 220
A.2. El conjunto canonico ...................................... 223
A.3. El conjunto macrocanonico ................................ 223
A.3.1 El factor de Boltzman ................................ 225
B. Espectrosocopia 227
B.I. Introduccion .............................................. 227
B.I.1 La radiacion electromagnetica ................... 227
4

B.l.2 Absorcion y emision ................................... 228


B.2. Espectroscopia vibraciona1 ................................ 231
B.2.1 Espectroscopia infrarroja ............................. 231
B.2.2 Dispersion Raman .................................... 232
B.3. Resonancia magnetica nuclear ............................. 235
B.4. Conceptos basicos de resonancia magnetica nuclear. . . . . . .. 235
B.4.1 Nive1es de energia nucleares ........................... 235
B.4.2 Presesion nuclear ...................................... 240
B.4.3 Corrimiento quimico ................................... 244
B.4.4 Tiempos de rea1ajacion en liquidos ..................... 244
B.4.5 Efecto nuclear Overhauser ............................. 245
B.4.6 La reso1ucion de estructuras por nmr .................. 246
C. Resonancia magetica nuclear pulsada 257
C.l. Las ecuaciones de Bloch ................................... 257
C.2. Sistema de referencia rotante .............................. 259
C.3. Respuesta a pu1sos de radiofrecuencia ...................... 262
C.3.1 La magnetizacion en e1 sistema de referencia rotante ... 262
C.3.2 Re1ajacion en e1 sistema de referencia rotante .......... 263
C.4. Decaimiento libre de 1a magnetizacion ..................... 264
C. 5. Medicion de Tl ........................................... 266
C.6. Medicion de T2 mediante espin eco ......................... 267

D. Unidades y constantes fisicas 269


D .1. Sistema Intermaciona1 de unidades 269

Indice alfabetico 273


,
Ind ice de figu ras

1.1. Diagrama de una molecula de agua. 15


1.2. Modos norm ales de vibracion de H 2 0 y D 2 0. Los enlaces se represent an
como line as de punt os y las fiechas indican la direccion de desplazamiento
de cada micleo. Se indica la frecuencia correspondiente a cada modo. 16
1.3. Densidad electronic a de una molecula de agua calculada mediante mecanica
cwintica. Se muestra solamente la mitad del espacio. La parte central -
cortada- corresponde a la densidad electronic a alrededor del atomo de
oxigeno, en tanto que los otros dos picos pequenos estan localizados sobre
los protones. Notese que una considerable densidad electronic a se encuen-
tra a 10 largo de las uniones O-H.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
1.4. Representacion de un potencial intermolecular para una interaccion de
simetria esferca. 18
1.5. Algunos modelos de agua (ST2 Ref. [5]; MCY Ref. [4]; SPC Ref. [7]; SPCjE
Ref. [8]). La carga q se expresa en terminos de la carga del electron e. 25
1.6. Coordinacion de la molecula de agua en el hielo. Las esferas pequenas
represent an los atomos de hidrogeno. 26
1.7. Diagrama de fases del hielo. 27
1.8. Red de hielo Ih. . . . . . . 28
1.9. Es posible tener una red de hielo orden ada respecto a los atomos de oxigeno
y varias desordenadas respecto a los prot ones manteniendo la integridad
de las moleculas de agua y solamente un proton a 10 largo de la linea
0-0. a) esquema de la red ordenada. b) una de las numerosas posibles
estructuras desordenadas.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
LID. Defectos de orientacion en hielo rh . Enlace doblemente ocupado (D); enlace
vacio (L); defecto (X), una variante del D. . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.11. Par ionico; a)Red ideal; b) Par ionico producido por el corrimiento del
proton; c) Separacion del par ionico por corrimiento del proton. . . . . . 32
1.12. Parte real de la permitividad dielectric a (E') en funcion de la frecuencia
del hielo Ih. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
1.13. Relajacion dielecrica; a)Decaimiento de la polarizacion en funcion del tiem-
po; b) Espectro dielectrico en funcion de la frecuencia. ......... 35

5
6

1.14. Densidad del agua en funci6n de la temperatura para diferentes composi-


36
ciones isot6picas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.15. Dependencia de la compresibilidad isotermica del agua con la temperatura. 37
1.16. Dependencia de la temperatura de la cap acid ad calorific a isopiestica, en-
tropia, entalpia, y energia libre del agua a 1 atm (101325 Pa). . . . . . . 37
1.17. Entalpia de vaporizaci6n de las secuencias isoelectr6nicas de hidruros . . 38
1.18. Funci6n de distribuci6n radial. (a) Red regular bidimensional. (b) Gnifico
del numero de atomos a una distancia r del de referencia. (c) La funci6n
de distribuci6n radial obtenida normalizando el grafico (b). . . . . . . . 39
1.19 . Un "liquido bidimensional" y su funci6n de distribuci6n radial g( r). N 6tese
que no posee la regularidad del s61ido de la Fig.LI9. . . . . . . . . . . . 40
1.20. Esquema de la funci6n de distribuci6n radial para agua y arg6n liquido.
Las distancias se expresan en unidades del diametro molecular de cada
especie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
1.21. Distribuci6n de los primeros y segundos vecinos en (a) un liquido simple
(ej. arg6n liquido) y (b) agua. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
1.22. Funciones de distribuci6n radial para el agua (datos de ref. [17]): a) go-o(r),
b)gO-H(r), c) gH-H(r), (d) go-o(r) experimental a diferentes temper at-
uras (redibujado de ref. [18]) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
1.23. Espectro dielectrico del agua liquid a a 10 °C (EO = 82,0; Eoo = 4,5; T =
9,26 X 1O- 12 s y a = 0,02). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
1.24. Coeficiente de viscosidad del agua bajo presi6n a diferentes temperaturas. 47
1.25. Diferentes caminos de solidificaci6n para un liquido formador de vidrio en
terminos del volumen V. Las line as quebradas indican el efecto de dis-
minuir la velocidad de enfriamiento. Para una velocidad extremadamente
reducida la linea tomaria el valor del cristal para T=T 00' • • • • • • 49
1.26. Representaci6n de Arrhenius de la viscosidad de diversos materiales. Se
indica la temperatura de transici6n vitrea (T g) de cada uno de ellos. 50

ILL Fuerza electromotriz generada en una pila con un electro do selectivo en


funci6n de la actividad i6nica. La linea llena corresponde al valor con
E j = 0 y las line as de punt os al result ado con E j ± 5mV. Se han seiialado
dos valores de E y su correspondiene error (~) debido a los errores en el
potencial de juntura. El error aumenta abruptamente con E. . . . . . .. 59
11.2. Representaci6n esquematica de un electrolito. N6tese que cada ion esta
rode ado por un grupo de iones de carga opuesta. . . . . . . . . . . . . . 60
11.3. Dos representaciones de la distribuci6n de contra-iones en una soluci6n
electrolitica: (a) un ion central y su nube de contra-iones y (b) un conden-
sador esferico equivalente. 60
7

11.4. Dependencia de la actividad enzimatica de la ATPasa gastric a estimulada


por potasio con la concentraci6n de K+ a [Mg++] constante (resultados de
referencia [5] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
II.5. Tres casos de interacci6n ion-ion: (a) Las esferas de hidrataci6n no inter-
actuan, (b) La proximidad de los iones hacen que parte de las esferas de
hidrataci6n se superpongan permaneciendo los iones separados por algunas
moleculas de agua y (c) Los iones se encuentran en contacto. 67
11.6. Entropia unit aria de iones en funci6n del coeficiente B. Se observa un
comportamiento lineal para diferentes familias de iones. . . . . . . . . . 71
II. 7. Distribuci6n de agua alrededor de Li +, K+, Cl- y 1- de acuerdo con sim-
ulaciones de dinamica molecular [de K. Heinzinger, in Water: Biomolecule
Interactions, edit ado por M. U. Palma and M. B. Palma-Vittorelli, Soc.
Italiana di Fisica, Bologna, (1993)].. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
II.8. Hidrataci6n del eritrol de acuerdo a simulaci6n computacional. La prox-
imidad de las line as es proporcional a la ocupaci6n del agua en la regi6n.
(de J. R. Grigera, T. S. Grigera, E. 1. Howard & A. D. Podjarny, Int. J.
of Quantum Chem., Quantum Biol. Symp. 21: 109-116, 1994). . . 78
11.9. Estructura de clatratos, (a) Tipo I y (b) Tipo II (redibujado de D. W.
Davidson, in Water: A Comprehensive Treatise, Vol. 2, edit ado por F.
Franks, Plenum Press, New York, 1973). . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
11.10. a) Caja (octaedro truncado ideal) encontrada en HPF 6 . 6H 2 0, y (b)
Forma distorsionada de (CH3)4NOH . 5H 2 0 (redibujado de Davidson, op.
cit.). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

IILI. Corrimiento relativo del tiempo de relajaci6n dielectrico del agua por mol
de soluto en soluciones de alcoholes y acidos carboxilicos en funci6n de la
entropia de solubilidad R ~Ssol (de ref. [3]). TO es el tiempo de relajaci6n
de agua pura c la concentraci6n molar del soluto. 86
IIL2. Tiempo de correlaci6n rotacional del agua en acetona en funci6n de la
concentraci6n de acetona. Las line as llenas corresponden a 25°C y las line as
quebradas a 5°C. Las line as negras muestra la relajaci6n del 17 0 de la
acetona y las line as grises se refieren a los tiempos de correlaci6n rotacional
del prot6n (HI). Se observa que el cambio en los tiempos de correlaci6n de
la acetona casi no sufre variaciones para las diferentes concentraciones en
tanto que la acetona afecta considerablemente los tiempos de correlaci6n
del agua. Se observa que los tiempos de correlaci6n del agua son mayores
que los de la acetona a pesar del menor tamano de la molecula. . . . . . 87
IIL3. Distribuci6n de enlaces de hidr6geno por molecula para agua pura, agua
en presencia de una pared hidrofilica y agua frente a una pared hidrof6bi-
ca obtenidos mediante simulaci6n por dinamica molecular (de ref. [4]). El
modelo de agua es SPC IE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 89
8

IlI.4. Esquema que muestra la base para calcular la energia libre de transferencia
de un soluto desde el agua al interior de una proteina. a) un atomo aislado;
b) una molecula mas compleja. Se observa que para el ultimo caso el area
expuesta total no es igual a la sum a de las areas individuales debido al
apantallamiento de ciertas regiones por los atomos vecinos. 97
IlL5. El momento hidrof6bico de la arginina puede representarse como se mues-
tra en la figura. La fiecha apunta desde a la regi6n mas hidrofilica a la mas
hidrof6bica de la molecula. . . . . . . ................ 100

IV.1. Algunas definiciones de "agua ligada": (a) Agua en la proximidad de la


macromolecula que no disuelve un co-soluto. (b) Agua que produce un
ensanchamiento de la linea de rmn. Esto se produce por la interacci6n
agua-soluto que produce una disminuci6n de sus movimientos. (c) Ex-
perimento hidrodinamico, el agua que acompana la macromolecula seria
agua 'ligada'. (d) La interacci6n agua-soluto desplaza la linea de relajaci6n
dielectric a hacia las bajas frecuencias. 113
IV.2. Las moleculas de agua que poseen enlaces de hidr6geno con sitios bien
definidos de la macromolecula participan de la hidrataci6n especijica, en
tanto que las que no tiene sitios definidos de uni6n participan de la denom-
inada hidrataci6n general. El agua de hidrataci6n especifica se encuentra
generalmente en el interior de la protein a (A), en hendiduras (B) 0, en
ocasiones, en la superficie (C). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 115
IV.3. Escala de tiempos de algunos procesos. Sobre la linea se muestran algunos
procesos en tanto que debajo de dicha linea se sen ala el rango de tiempo
que opera cada uno de los diferentes tipos de experimentos nombrados.
Tengase en cuenta que la esc ala de tiempo es logaritmica. La idea general
de la figura esta tomada de Eisenberg y Kauzmann, The Structure and
Properties of Water, Clarendon Press, Oxford, 1969. 116
IV.4. Esquema de los diferentes enfoques utilizados para el estudio del agua
en las macromoleculas. Todos ellos deberian converger a la soluci6n del
problema, el cual no es posible resolver con una unica tecnica. . . . . . . 118
IV.5. Los cinco tipos de isotermas de acuerdo a la clasificaci6n de Bruanuer
mostrando el cubrimiento en funci6n de la presi6n de vapor relativa. El
Tipo I es la isoterma clasica de Langmuir de "mono cap a" . La del tipo II,
con una fuerte sorci6n a bajas presiones de vapor seguida de una sorci6n
debil, es la tipica isoterma de porci6n de agua en protein as y se la design a
frecuentemente como de "multicapa". Las isotermas de tipo I I I indican
una debil interacci6n entre el sorbato y la superficie. Las del tipo IV y
V corresponden a las de los tipos II y III respectivamente cuando se
produce condensaci6n capilar, 10 que inhibe la sorci6n a altas presiones de
vapor.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
9

IV.6. Isoterma de sorci6n de la hemoglobin a, basada en los datos de referencia


[13]. La fiechas seiialan la direcci6n en que se realiz6 el procedimiento de
sec ado y humectaci6n en cada etapa. El proceso se inici6 desde el est ado
nativo (curva superior). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
IV. 7. Etapas en la determinaci6n de la estructura de una protein a mediante
rayos X ejemplificada con la mioglobina. (a) imagen de difracci6n. (b)
mapa de densidad electr6nica. (c) Estructura de alta resoluci6n. . . . . . 127
IV.8. Mecanismo de catalisis de la anhidrasa carb6nica de acuerdo con Khalifah
J. Bio. Chem. 246, 2561, 1971. El agua en la vecindad inmediata del ion
Zn++ participa tanto como dador como aceptor de protones. Un alto grado
de orden se requiere en el agua para permitir la cinetica suficientemente
nipida. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
IV.9. La estructura del sitio activo de la anhidrasa carb6nica donde se muestran
nueve moleculas de agua con estructura similar a la de hielo h (basada en
el trabajo de Liljas y col. Nature New Biology, 235, 131, 1972. ..... 130
IV.10. Representaci6n esquematica de los puentes de agua en la mioglobina. Las
moleculas de agua conectan residuos tanto a traves de una unica 0 varias
moleculas de agua formando cadenas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
IV.1I. Gulliver apresado por los liliputienses. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
IV.12. Permitividad dielectric a de albumin a serica bovina en plovo en funci6n del
contenido de agua a diferentes frecuencias. (a) 0,1 MHz; (b) 1 MHz; (c) 10
MHz. (Datos de: Rosen, Trans. Faraday Soc., 59, 2178, 1963. . . . . . . 134
IV.13. Esquema del espectro dielectrico de colageno hidratado. (basado en los
datos de Grigera, Vericat, Hallenga & Berendsen; Biopolymers, 18, 35,
1979). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
IV.14. Visualizaci6n de la respuesta de cadenas later ales a un campo electrico
variable a diferente temperatura. La temperatura del caso a) es menor que
en b). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
IV.15. Esquema del espectro de rmn de una protein a s61ida hidratada. El detalle
muestra el aspecto de la linea correspondiente al agua. . . . . . . . . . . 138
IV.16. Espectro de rmnde fibras orientadas de colageno. Se represanta la derivada
de las lineas, tal como se producian en los aparatos de banda ancha. . . . 139
IV.17. Modelo de hidrataci6n del colageno. Dos moleculas de agua cada tres
aminoacidos ocupan sitios haciendo puente entre diferentes cadenas de
la triple helice. La figura de la derecha muestra el modelo construido en
base a los datos experiment ales y la de la izquierda es un detalle de un
result ado de simulaci6n por dinamica molecular de un polipeptido tipo
colageno. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
IV.18. Estructura de un polipeptido tipo colageno obtenida mediante simulaci6n
por dinamica molecular. a) en presencia de agua. a) Deshidratado (de
referencia [14]) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
10

V.l. Esquema de un sistema formado por una caja cerrada dividida por una
membrana ideal. El sistema contiene solamente una sustancia pero la tem-
peratura y potencial quimico de la misma en cada parte de la caja es
diferente. Se consider a que las propiedades de la sustancia cambian abrup-
tamente cuando la misma pasa de una regi6n a otra, de tal manera que
cada parte del sistema es homogeneo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
V.2. Dos compartimientos separados por una membrana idealmente semi- per-
meable. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 159
V.3. Dos recipientes conteniendo agua pura a diferente temperatura Tl > T 2 .
Una caja cubre ambos recipientes para evitar la perdida de agua del sistema. 169
V.4. Esquema de un sistema con un compartimiento inserto en un reservorio.
La sustancia a estudiar se encuentra a tiempo t = 0 en el interior del
compartimiento. 172
V.5. Representaci6n gnifica de la ecuaci6n V. 96 para diferentes valores de 1'. 173
V.6. Dos modelos te6ricos diferentes correspondientes a diferentes sistemas reales.175
V. 7. Representaci6n gnifica de la ecuaci6n V.106 para diferentes valores de 1'. 177
V.8. Curvas de captaci6n: a) para un sistema en un reservorio; b) para un
sistema en un recipiente de tamano finito. . . . . . . . . . . . . . . . . 179
V.9. Curvas de lavado: a) para un sistema en un reservorio; b) para un sistema
en un recipiente de tamano finito. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 179

VI.l. Difusi6n simple y difusi6n facilitada a traves de una membrana que separa
dos compartimientos 1 y 2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184
VI.2. Esquema del mecanismo cinetico de la difusion facilitada. 185

VIlLI. Esquema de un sistema Donnan; se indica la concentraci6n de cargas. 208


VIII. 2. Coeficiente de acumulaci6n en funci6n de la fuerza Donnan relativa para
un sistema Donnan con una fase libre formada por una soluci6n de NaCl. 211
VIII. 3. El mismo sistema Donnan de la figura VIlLI. En este caso se indica el
numero de particulas (en lugar del numero de cargas). 212

B.l. Esquema del espectro electromagnetico. 226


B.2. Esquema del proceso absorci6n-emisi6n . 227
B.3. Esquema del proceso absorci6n-emisi6n en una molecula diat6mica. 228
B.4. Bandas de absorci6n en la regi6n del infrarrojo de algunos grupos de im-
portancia bio16gica. . . . . 230
B.5. Esquema de los niveles de energia para un sistema con absorci6n en el
infrarrojo y dispersi6n Rayleigh-Gans. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
11

B.6. Diagrama energetico de una molecula mostrando el origen de la dispersi6n


Raman (efecto Raman no resonante). N 6tense los diferentes mecanismos de
los efectos Stokes y anti-Stokes. La molecula alcanza, momentaneamente,
un nivel de energia mas alto (estado virtual), pero nunca llega a un est ado
electr6nico excitado. 232
B.7. Esquema de la relacion entre el momenta mecanico y el momenta
magnetico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 234
B.S. Un conjunto de espines orentadoa la azar con lamisma energia. 234
B.9. Diagrama del efecto de precesi6n nuclear y la representaci6n con vectores
aline ados paralela y anti-paralelamente al campo externo. . . . . . . . . 235
B.lO. Desdoblamiento de los niveles de energia para un micleo de espin ~ en un
campo H .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236
B.ll. Representaci6n de la distribuci6n de la poblaci6n de espines entre dos
niveles de energia. La orientaci6n de los espines sigue la distribuci6n de
Boltzmann. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 237
B.12. Precesi6n de un momento magnetico alrededor de un campo magnetico
estatico Ho. El campo de radiofrecuencia Hi rota en el plano xy. a) Un
momento aislado. b) Un sistema de moment os identicos. Ho es el campo
externo y M es el momento magnetico neto producido por la alineaci6n
de los espines nucleares. Por razones de simplicidad se ha eliminado la
precesi6n producida por el campo Hi; el detalle se muestra en el Apendice
C (§C.2, fig.C.l). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
B.13. Esquema de las ideas basicas de un equipo de rmn. . . . . . . . .. 241
B.14. Para un par de prot ones 1 y 2, el momento magnetico dipolar brinda una
contribuci6n extra al campo de los micleos vecinos. Puesto que el prot6n
tiene dos est ados ("arriba" 0 "abajo") este campo puede sumarse 0 restarse
al externo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
B.15. Desdoblamiento de linea por interacci6n dipolar. . . . . . . . . . . . . . 242
B.16. Linea producida por un polvo cristalino. . . . . . . . . . . . . . . . . . 242
B.17. Esquema del efecto del campo externo sobre el movimiento de los elec-
trones. N6tese que la direcci6n convencional de la corriente electric a tiene
direcci6n opuesta a la direcci6n de movimiento de los electrones. . . . . . 243
B.lS. Efecto del campo externo en las corrientes producidas en orbit ales 7r. 244
B.19. Senal de FIg en Na2P03F bajo irradiaci6n de la resonancia del Na2P03F,
la linea central no aparece sin doble irradiaci6n . . . . . . . . . . . . . 244
B.20. A) Esquema de un experimento COSY homonuclear con dos pulsos de 90°
no selectivos. tl es el tiempo de evoluci6n y t2 el tiempo de obervaci6n. Se
realiza la observaci6n para diversos tiempos de evoluci6n B) representaci6n
bidimensional esquematica (frecuencias WI y W2) de los resultados para un
sistema de espin AX. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
12

B.2l. Diagrama esquematico de la posicion bidimensional de los picos de los


prot ones para alanina y glicina en un experimento COSY homonuclear. . 247
B.22. Espectro de rmn del inhibidor K; representacion mono dimensional (de la
referencia [1]). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248
B.23. Espectro de rmn del inhibidor K; COSY en su representacion tridimen-
sional (de la referencia [1]). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
B.24. Espectro de rmn del inhibidor K; COSY en su representacion bidimension-
al. Las line as de punta sen alan prot ones correlacionados (de la referencia
[1]). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
B.25. Representacion bidimensional de un spectro NOESY correspondiente a
BPTI (de la referncia [1]). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
B.26. Esquema de una protein a hipotetica a) Estructura primaria; se han senal-
ado ciertos residuos que se encuentran proximos en el est ado plegado. b)
Estructura tridimensional. . . . . . . . . . . . . . . 251
B.27. Estructura de BPTI obtenida mediante rmn (de la ref. [2]). . . . . . . . 251

C.l. Representacion del movimiento de la magnetizacion M con la aplicacion


de un campo estatico Ho y un campo oscilatorio HI. . . . . . . . . . . 258
C.2. Precesion de M alrededor de HI en el sistema rot ante durante tiempos
tp = e/bHI ), correspondientes a pulsos de: a) 7r/2 (90 0 ) y b) 7r (180 0 ). • 261
C.3. (a) Un pulso de 90 0 aline a M con el eje y'. (b) M decrece perdiendo
coherencia. (c) Pulso incidente. (d) Senal detectada. . . . . . . . . . . . 263
C.4. Decaimiento libre (a). Para un pulso de radiofrecuencia igual a la frecuen-
cia de Larmor. (b) Para un pulso de frecuencia ligeramente diferente de
la resonancia; en este caso la envolvente de la curva oscilatoria es igual
al decaimiento que se obtiene cuando la frecuenca es exactamente la de
resonanacia. 264
C.5. Esquema de un experimento de espin-eco. (a) Se aplica un pulso de 90 0

a tiempo O. (b) La magnetizacion macroscopic a pierde coherencia. c) Se


aplica un pulso de 180 0 , observese el sentido de rotacion. d) Transcurrido
un tiempo 27 se recupera la coherencia. f) la coherencia se pierde nuevamente. 266
Capitulo I

EI agua

Laudato si, mi Signore, per sor'aqua, la quale e multo utile et humile


et pretiosa et casta. 1
FRANCESCO D' ASSISI

Para mantener su condicion de seres vivos los diversos organismos biologicos


requieren intercambio de materia y energia con el medio circundante. En su interior
las substancias deb en trasportarse a los lugares especificos, ya sea en organismos
unicelulares 0 en estructuras mas complejas, inclusive en el hombre. El vehiculo
universal de la materia en biologia es el agua.
El primer paso en nuestro esquema de ascendente complejidad sera examinar
algunas propiedades del agua que, a su turno, seran necesarias para entender diversos
aspectos de la maquinaria biologica.

1.1. La molecula de agua

1.1.1. Com posicion isotopica

La formula quimica del agua es H 2 0, pero, puesto que existen diferentes isotopos
tanto del oxigeno como del hidrogeno, el agua natural es en realidad una mezcla
de formas isotopicas. Particularmente el hidrogeno tiene dos isotopos estables, 1 H
(usualmente indicado como H) y 2H (deuterio, indicado regularmente como D), y un
isotopo radioactivo 3H (tritio, indicado como T), que tiene una vida media de 12,6
arros. El oxigeno tiene tres isotopos naturales, 160 (el isotopo mas abundante), 170
y 180. Se conocen tambien tres isotopos radioactivos artificiales 140, 150 Y 190.
Pese a que la combinacion de los isotopos naturales de oxigeno e hidrogeno darian
18 especies isotopicas diferentes (=3x3x2) de agua, este numero teorico se reduce

lLoado seas, mi Senor, por la hermana agua, la cual es muy util y humilde y preciosa y casta.

13
14 Temas de Biofisicoqufmica

en la pnictica ya que la abundancia natural de cada isotopo es bien diferente, dando


como consecuencia que el agua natural tiene una composicion muy uniforme. En
general el agua natural tiene el 99,73 % H§60, 0,2 % H§80, 0,04 % HFo, y 0,03 %
HDO, con trazas de los otros isotopos en diferentes combinaciones.
La presencia de T en el agua natural no tiene pnicticamente efecto en las propiedades
fisicas, sin embargo resulta de mucho interes y utilidad como trazador para el estudio
de reservorios naturales de agua.
La Hamada "agua pesada" (D 2 0) no se encuentra en la naturaleza pero puede
ser producida artificialmente. Si bien las diferencias quimicas entre D 2 0 y H 2 0 son
infimas, fisicamente hay diferencias que resultan relevantes, constituyendo un veneno
para los sistemas biologicos. Solamente algunas algas y bacterias pueden sobrevivir
al agua pesada, no sin antes mutar considerablemente.
El equilibrio de D 2 0 y H 2 0 se expresa como

Dado que el equilibrio esta fuertemente desplazado para la derecha en una mezcla
de agua y agua pes ada la especie que encontraremos predominantemente sera HDO.
De la misma manera una preparacion de agua marcada con tritio tendra como especie
marcada moleculas de HTO.

1.1.2. Estructura de la molecula de agua

La estructura de las moleculas de agua en su fase gaseosa ha sido estudiada abun-


dantemente mediante espectroscopia rotacional y vibracional (mencionaremos estas
tecnicas en el Apendice B). Se ha podido determinar con precision las dimensiones
de la molecula de agua. Su modelo consiste en un triangulo isosceles donde el vertice
opuesto a la base esta ocupado por el nucleo del oxigeno y los otros dos por los
nucleos de los atomos de hidrogeno (protones). La figura 1.1 muestra un esquema y
los parametros correspondientes se describen en la tabla 1.l.
Los nucleos no est an fijos sino que vi bran alrededor de su posicion de equilibrio.
Esas vibraciones pueden describirse como una combinacion de los Hamados modos
normales de vibraci6n. La figura 1.2 muestra los modos norm ales de vibracion para el
H 2 0 y HDO junto a las frecuencias de vibracion. La naturaleza de estas frecuencias
se vera tambien en el Apendice B.
LCual es la forma de la molecula de agua? Sabemos que la forma de las cosas
depende del metoda que utilicemos para "mirarla". Dado que muchas de las formas
de observacion son sensibles a la distribucion electronica, podriamos decir que la
forma de una molecula de agua esta determinada por la distribucion electronica total.
Esta distribucion no es facil obtenerla experimentalmente pero calculos realizados a
traves de la mecanica cuantica nos permiten formarnos una idea de esa distribucion.
La misma se muestra en la figura 1.3.
1. Agua 15

H
Figura I.1: Diagrama de una molecula de agua.

Cuadra I.1: Parametras de las moleculas de H 2 0 D 2 0, y HDO (los simbolos se refieren a la figura
1.1)

HDO
LONGITUD DE ENLACE: rb/nm
Molecula libre 0,09575 0,095718 0,09571
Molecula con enlace de hidrogeno 0,097-0,101

.ANGULO: HOH(j3)
Molecula libre 104,474° 104,523° 104,529°
Molecula con enlace de hidrogeno 105°-109°

1.1.3. Propiedades electricas

Las moleculas de agua no tienen, desde el punta de vista de las interacciones, un


comportamiento simetrico. Su asimetria se manifiesta a traves de sus propiedades
electricas. A pesar de que la totalidad de la molecula es neutra, las cargas no est an
uniformemente distribuidas. Si se localiza el centro de las cargas negativas y posi-
tivas, vemos que se encuentran separadas generando un momenta dipolar, pero dos
puntos no pueden representar la distribucion de cargas. Una descripcion mas deta-
llada nos indica que existen moment os de orden superior (cuadrupolos, octupolos,
etc.) que resultan importantes para el comportamiento de las interacciones. Estas
propiedades electricas son susceptibles de ser determinadas experimentalmente.
Asimismo, las cargas no est an rigidamente unidas, de tal forma que su distribucion
puede ser alterada por la presencia de un campo. La aplicacion de un campo electrico,
por ejemplo, produce un cambio en el momenta dipolar. La magnitud de ese cambio
16 Temas de Biofisicoqufmica

o t o
.:~t#.~ ~~ ...,.....~
H ••••••• ••••••• H

/v,=3656,65 e m ' ?"<,=2824 em-'

v,=1440 em-'

o
;v...
H/' ····.. H
iJiI ~
v,=3755,79 em-' "'"

Figura I.2: Modos norm ales de vibraci6n de H 2 0 y D 2 0. Los enlaces se represent an como
line as de punt os y las fiechas indican la direcci6n de desplazamiento de cada micleo. Se
indica la frecuencia correspondiente a cada modo.

depende de la polarizabilidad. Tambien existe la polarizabilidad cuadrupolar, pero


su efecto solo se observa en situaciones excepcionales.

1.1.4. Interacciones molecu lares

En principio es posible obtener las propiedades macroscoplcas a partir de las


propiedades a nivel molecular. Este proceso no siempre puede llevarse acabadamente
a feliz termino, pero, aun en la situacion actual del conocimiento, los resultados son
de utilidad. Es evidente que para lograr exito, aun parcial, es necesario manejar las
tecnicas apropiadas y el conocimiento de las fuerzas intermoleculares.
Repasaremos algunos concept os de fuerzas intermoleculares en forma general con
mencion particular de las del agua. La utilidad de este repaso no se limit a al agua sino
que refrescamos el conocimiento para posteriores aplicaciones tales como soluciones
ionicas, proteinas y otras sustancias de interes biologico.
Las propiedades macroscopicas de la materia dependen de las interacciones colec-
tivas de todas las moleculas, 10 que significa que debemos considerar un gran numero
de ellas. Para poder llevar adelante esta tarea debemos aceptar que las fuerzas son
aditivas de a pares, es decir que podemos tomar la interaccion total como la suma
de las interacciones de pares presentes. Esta es una aproximacion totalmente vaJi-
da para el dJculo de ciertas propiedades que efectivamente dependen solamente de
1. Agua 17

Figura I.3: Densidad electronic a de una molecula de agua calculada mediante mecamca
cwintica. Se muestra solamente la mitad del espacio. La parte central -cortada- corre-
sponde a la densidad electronic a alrededor del atomo de oxigeno, en tanto que los otros dos
picos pequenos estan localizados sobre los protones. Notese que una considerable densidad
electronic a se encuentra a 10 largo de las uniones O-H.

interacciones binarias. Sin embargo existen contribuciones llamadas no-aditivas, ya


que no se pueden obtener a partir de esta aproximacion. Este inconveniente se puede
salvar ya sea con la incorporacion ad hoc de una correccion (como, por ejemplo para
la polarizabilidad), ya sea como diseiiando potenciales eJectivos de los cuales la suma
de pares conlleva a incorporar efectos de varios cuerpos.
Veamos primeramente las diferentes interacciones de pares de moleculas. La figura
1.4 muestra la forma general de un potencial de interaccion para moleculas esfericas. 2
Analizaremos a continuacion diferentes componentes de la interaccion.
La curva represent ada en la figura 1.4 corresponde, como mencionamos, al poten-
cial. La Juerza correspondiente se obtiene como el gradiente del potencial con signo
negativo, es decir que

F(r)
au
=-- (1.1 )
or
Haremos el anaJisis de los componentes de la interaccion observando los pot en-
ciales correspondientes.

2La "forma" de la molecula proviene de la interacci6n con nuestro elemento de detecci6n, en este
caso otra molecula del mismo tipo.
18 Temas de Biofisicoqufmica

V(r)

Figura I.4: Representaci6n de un potencial intermolecular para una interacci6n de simetria


esferca.

Repulsion

Las fuerzas de repulsion son fuerzas de corto alcance que forman parte de las lla-
madas fuerzas de superposicion, debidas a superposicion de los orbit ales moleculares.
Estas fuerzas (de superposicion) pueden dar lugar a una fuerte repulsion 0 a una
fuerte atraccion. La atraccion se produce cuando existe intercambio cwintico dando
lugar a los enlaces quimicos. Cuando las moleculas tienen todos sus posibles enlaces
form ados , las fuerzas de atraccion est an excluidas y, consecuentemente, debido al
principio de exclusion de Pauli 3 se produce la repulsion.
El potencial de repulsion se represent a apropiadamente mediante una expresion
exponencial,

Urep = R( r) exp ( -r / p) , (1.2)


donde R(r) es un polinomio, puna constante y r la distancia intermolecular.
Una simplificacion consiste en reemplazar el polinomio por un coeficiente unico
P, dando

Urep = P exp ( -r / p) [Potential de Buckingham1, (1.3)

Una simplificacion aun mas drastica es

(1.4)

3En terminos simples el principio de exclusi6n nos dice que dos particulas no pueden tener todos
sus numeros cuanticos iguales.
1. Agua 19

Cuadra I.2: Coeficiente C 6 para las fuerzas de dispersi6n en agua.

METODa DE CALCULO C 6 1O- 49 jJm6


Kirkood-Muller 84.9
Slater-Kirkood 63.0
London 47.0

donde n es una constante positiva, generalmente 9 0 12, Cn = a es un panimetro


que depende de cada atomo en particular.

Fuerzas de dispersion

Las fuerzas de dispersion se producen como consecuencia de las fluctuaciones en


el movimiento electronico. Estas fluctuaciones producen moment os dipolares instan-
taneos que, para atomos 0 moleculas con simetria esferica, poseen promedio cero. Sin
embargo, si bien el promedio puede ser nulo, el valor medio cuadratico no es nulo,
generando estas fuerzas tambien llamadas Juerzas de London. Estas fuerzas est an
presentes independientemente de que haya 0 no momenta dipolar. El potencial corre-
spondiente ha sido analizado teoricamente y se expresa como una serie de potencias
de la inversa de la distancia. El termino mas importante es el correspondiente a la
potencia sexta,

(1.5)
Para el agua se han informado diferentes valores de la constante C 6 segun la
metodologia utilizada para el calculo, algunos de esos valores se muestran en la
tabla 1.2.
La composicion de las componentes de repulsion y dispersion producen un poten-
cial de simetria esferica del tipo mostrado en la figura 1.4. Estos potenciales describen
muy bien, con los parametros apropiados, la interaccion de atomos y moleculas esferi-
cas no-polares. Sus primer as aplicaciones se hicieron para gases nobles. La expresion
mas utilizada es la del potencial de Lennard-Jones

(1.6)

que se suele expresar en la forma

(j12 (j6)
ULJ(r) = 4E ( r12 - r6 ' (1. 7)
20 Temas de Biofisicoqufmica

donde (J es el diametro de colision, que es igual a la separacion de las particulas a


U(r = (J) = 0, Y E es el valor de la profundidad del potencial (U(rm) = -E, con
rm = 2(1/6)(J).

Interaccion electrostchica

La interaccion electrostatica se produce por la existencia de cargas. No es nece-


sario que la molecula posea carga neta sino tan solo que existan moment os electricos.
En terminos generales la distribucion de cargas se puede desarrollar en momentos
multipolares. El momenta de orden cero, monopolo, es la carga neta, el momenta
de orden dos es el dipolo, cuadrupolo, octupolo, etc. (siempre de orden par). Los
moment os de orden superior (mayores que cero) responden a distribuciones asimetri-
cas de las cargas. En el caso particular del agua, al ser neutra, el primer momenta
no nulo es el dipolar y posee gran importancia para la interaccion. El momenta
cuadrupolar no es despreciable.
Cuando existen cargas netas (monopolos) -no es el caso del agua- el potencial
sigue la ley de Coulomb y se expresa como

(1.8)

donde EO es la permitividad del vacio y c la permitividad (constante dielectrica) del


medio.
Las interacciones dipolo-dipolo, dipolo-cuadrupolo y cuadrupolo-cuadrupolo se
pueden obtener de la ley de Coulomb y considerando la simetria correspondiente.
Puesto que dicha interaccion no resulta de simetria esferica, la fuerza no depen-
dera solamente de la distancia intermolecular sino tambien de la orientacion relativa
de las moleculas. Se pueden escribir:

(1.9)

(1.10)

(1.11 )
donde <I> mnt: ( 'Ij!, (), ¢) son funciones que dependen solamente de las coordenadas po-
lares ('Ij!, (), ¢) que describen la orientacion de las moleculas, J-l es el momenta dipolar
y Q el momenta cuadrupolar.
A altas temperaturas (kT » J-l2/ r 3) , las moleculas rotan rapidamente y la inte-
raccion se promedia en los angulos y depende solamente de la distancia. Un ejemplo
es el vapor de agua. La interaccion dipolar, que expresamos en terminos de las
orientaciones moleculares en la ecuacion 1.9, despues del promedio resulta:
1. Agua 21

(1.12)
donde vemos que no solamente hemos perdido la dependencia angular sino que
decrece con la inversa de la sexta potencia, en tanto que sin el promedio esta de-
pendencia es de la inversa del cuba de la distancia. Esto nos indica que para altas
temperaturas la influencia del momenta dipolar es de corta distancia.

1.2. EI enlace de hidr6geno


Se debe poner especial atencion en el enlace 0 puente de hidrogeno, ya que se
trata de una interaccion sumamente importante no solamente para el agua; tambien
participa en un multitud de estructuras de interes biologico.
Se puede definir el enlace de hidrogeno como aquel que ocurre entre dos centros
electronegativos, A yB que comparten un proton,

A-H···B

El criterio operacional para establecer la existencia de un enlace de hidrogeno


incluye:

• Un enlace de hidrogeno se forma entre un grupo donor de proton y un grupo


aceptor. El grupo donor 10 constituye el par A-H, donde A es un atomo elec-
tronegativo (0, N, S, F, Br, I, Cl 0 C). El grupo aceptor B es un sitio de alta
densidad electronica que puede corresponder a electrones no apareados de un
atomo electronegativo 0 a electrones de orbit ales 7r.

• En la mayoria de los casos un enlace de hidrogeno es lineal y altamente loca-


lizado.
(a menos que est en involucrados electrones de un orbital 7r). Hay casos en los
cuales el angulo A - H - - - B varia considerablemente y el enlace se debilita.

• Para un dado compuesto el radio de van der Waals obtenido por la distancia
de equilibrio en un cristal da una idea de la "distancia minima" de aproxi-
macion entre atomos. Para un enlace de hidrogeno la distancia A - H - - - B es
generalmente menor que la suma de los radios de van der Waals. Este hecho
es importante en el analisis de estructuras biologicas.

• Se pueden producir enlaces de hidrogeno entre atomos de la misma molecula


(enlaces intra- moleculares) 0 entre moleculas (inter- moleculares).

• En un enlace de hidrogeno, un enlace covalente A - H interactua con un sitio


aceptor B. El enlace A - H se debilita pero no se rompe y las propiedades
22 Temas de Biofisicoqufmica

del grupo aceptor B se modifican. Para casos de ruptura del enlace A - H


desaparece el enlace de hidrogeno y est amos en presencia de un fenomeno de
transferencia de protones.

La entalpia del enlace de hidrogeno se encuentra en el rango de 1 a 10 kcaljmol


(4 a 41 kJjmol). Puesto que la mayoria de las interacciones caen en ese rango, la
energia no es una caracteristica distintiva del enlace. Sin embargo, para la mayoria
de los enlaces de hidrogeno de interes biologico se puede considerar una entalpia de
alrededor de 5 kcaljmol (20,5 kJjmol).
Cuando el proton se reemplaza por deuterio el "enlace de deuterio" es mas fuerte
que el de hidrogeno (del orden del 10%). Esto se debe a que la mas a del deuterio
es el doble de la del proton de manera que se produce un cambio en la energ{a de
punta cero.4 Las consecuencias biologic as son importantisimas ya que, como men-
cionaremos repetidamente, las estructuras biologic as dependen de un gran numero
de interacciones debiles, siendo el enlace de hidrogeno una de las de mayor imp or-
tancia.

La naturaleza el enlace de hidr6geno

La naturaleza del enlace de hidrogeno fue descripta por Pauling en su clasico


libro The Nature of the Chemical Bond[l]. En el mismo prop one que el enlace es
principalmente de caracter ionico con respecto al grupo aceptor pero tambien posee
una cierta propiedad covalente. Eso se puede representar en terminos de la resonancia
entre tres est ados con diferente probabilidad
61 % Covalente-Ionico: A - H ... B
34 % Ionico-Ionico: A .. H ... B
5% Ionico-Covalente: A .. H - B
donde A represent a el grupo donor y B el grupo aceptor.
Si bien esta propuesta fue efectuada hace mucho tiempo, trabajos posteriores han
confirm ado los elementos esenciales[2].

Cooperatividad

Frecuentemente los enlaces de hidrogeno poseen cooperatividad. En este fenomeno


la formaci on de un enlace de hidrogeno facilita la formaci on de otros. En el caso del
agua, cuando se forma un enlace se produce un aumento de la orientacion de los
electrones no apareados y una diferencia en la densidad de carga que favorece la
formaci on de un enlace subsiguiente.

4Para un oscilador, la energia no es un continuo sino que esta discretizada. El valor minimo
corresponde al nivel n=O, de alli su designaci6n como energia de punta cera.
1. Agua 23

Este hecho se puede observar analizando los modos norm ales de vibracion. De
alli se puede ver que la estabilidad del enlace se incrementa con la presencia de otro
enlace de hidrogeno.
Desde el punta de vista de la estructura y dinamica del agua, la cooperatividad
juega un papel importante, como veremos mas adelante. Asimismo el proceso de for-
macion y desarmado de estructuras biologic as basadas en la existencia de numerosos
puentes de hidrogeno toma una dinamica particular.

1.3. Potenciales de interacci6n para agua

Los elementos que vimos de interaccion inter-molecular nos permitiran entender


como es posible proponer potenciales de interaccion para las moleculas de agua.
Como todo modelo, los modelos de agua son validos dentro de ciertos rangos con
las restricciones necesarias para lograr una simplicidad apropiada.
Para que un potencial de agua sea razonable debe al menos describir las carac-
teristicas mas salientes de la molecula aislada. Sin embargo, puesto que se pretende
que el potencial sea util para modelar los est ados liquido y solido, debemos incor-
porar otras caracteristicas.
En princi pio podemos clasificar los potenciales de interaccion agua-agua segun el
tipo de potencial y la geometria, como:

(a) De acuerdo con el potencial:

I) Potenciales de pares puros. Potenciales basados en interacciones verdaderas


de dos moleculas de agua. Puesto que no es posible medir directamente estas
interacciones, se de ben inferir de calculos moleculares (mecanico-cuanticos).

II) Potenciales puros extendidos. Potenciales basados en interacciones verdaderas


entre dos moleculas con la adicion de interacciones de tres cuerpos y, si es
posible, terminos de interaccion mas altos.

III) Potenciales de pares efectivos. Estos potenciales no represent an la interaccion


verdadera entre dos moleculas reales de agua sino que incluyen un promedio
de la interaccion molecular considerando los terminos de tres y mas cuerpos
que aparecen en est ado liquido y solido. De esta manera, utilizando potenciales
de pares se toman en cuenta los efectos de muchos cuerpos como contribucion
promedio.

IV) Modelos polarizables. En este caso los terminos no-aditivos se toman a traves
de la introduccion explicit a de la polarizabilidad.
24 Temas de Biofisicoqufmica

v) Modelos analiticos. Estos modelos present an las interacciones mediante expre-


siones analiticas de diferente complejidad.

(b) Segun la geometr(a:

r) rigidos;
II) flexibles.

El diseiio de un potencial de interaccion no es simple. Se debe guardar un delicado


balance entre la capacidad de describir apropiadamente los resultados experiment ales
y la simplicidad que permit a su aplicacion pnictica acorde con los recursos de dJculo
disponibles.
En la figura 1.5 se muestra el esquema con las propiedades geometricas y electricas
de algunos modelos de agua actualmente en uso y en la tabla 1.3 los resultados
obtenidos con esos modelos en el dJculo de ciertas propiedades.
Estos modelos corresponden a modelos rigidos de potenciales efectivos. En todos
los casos el momenta dipolar resultante es mayor que el de la molecula de agua
aislada. El incremento del momenta dipolar se introduce para utilizar los modelos
en agua liquida. La polarizabilidad hace que cuando introducimos una molecula de
agua en su medio liquido el campo creado por el resto de las moleculas polariza
la molecula introducida de tal manera que el valor medio del momenta dipolar es
mayor que en el est ado gaseoso. Los modelos intentan compensar con el incremento
del momenta dipolar la falta de polarizabilidad de los mismos. Pese a la simplicidad
de est os modelos, la capacidad para reproducir los resultados experiment ales den-
tro de ciertas condiciones es bueno; particularmente el SPC IE [8] (el mas utilizado
actualmente) reproduce muy bien la densidad, el coeficiente de difusion, la permi-
tividad y razonablemente (como casi todos los ilustrados en la figura) las funciones
de distribucion radial del agua. 5

1.4. Hielo
Llamamos hielo a la fase solida del agua. En realidad no hay un unico hielo,
ya que el agua cristaliza de diferente forma de acuerdo a las condiciones en las
que se produce el cambio de fase. El estudio del hielo y sus diferentes formas no
solamente es importante desde el punta de vista de sus propiedades relacionadas con
la glaciologia, sino, ademas, constituye un camino para entender el comportamiento
del agua liquida. Se supone que algunas de las caracteristicas de ciertas fases del
hielo se encuentran presentes en el agua liquida.

5El significado de la funci6n de distribuci6n radial se trata en la secci6n I.6.2.


1. Agua 25

ST2 MCY TIP4P SPC SPC/E

~q ~q ~"(5 '"~'
q
-W+ -2q
m
C- +q
-q +q +q +q +q

q/e 0.2357 0.7175 0.52 0.41 0.4238


C/nm 0.1 0.09572 0.09572 0.1 0.1
C-/nm 0.08
m/nm 0.02677 0.0015
/0 109.28 104.52 104.52 109.28 109.28

Figura I.5: Algunos modelos de agua (ST2 Ref. [5]; MCY Ref. [4]; SPC Ref. [7]; SPCjE Ref. [8]).
La earga q se expresa en terminos de la earga del electron e.

Cuadra I.3: Resultado del ealeulo de propiedades del agua para diferentes modelos (refereneias
en la figura 1. 5) a 298 K y densidad = 0.997 g em -3.

Modelo U/(kJ moll) P /(kbar D/(10 9m '2s 1) c


SPC -41,0 0,3 3,85 ± 0,5 65 ±7
SPC/E -41,5 0,0 2,2 ± 0,4 71 ±O
TIP4P -41,8 0,3 3,29 ±0,5 83±7
Experimental -41,5 0,0 2,3 78,4

La figura 1. 7 muestra el diagrama de fases del agua y alli podemos ver en que condi-
ciones existen las diferentes fases del hielo. Lo determinante de cada fase es la presion
y la temperatura. La fase que podiamos llamar hielo "comun" es el hielo h que se
forma a presion atmosferica. Tambien existen formas vitreas cuyo interes es cre-
ciente tanto debido al interes basico como aplicado. En la seccion 1. 7 present amos
brevemente el tema.
El diagrama de fases del agua es complejo y aun no totalmente determinado.
Vemos cuatro formas de hielo (II, IV, VII y IX) que no se forman del agua liquida
sino como transformaciones de otras fases de hielo.
En todas las formas cristalinas de hielo encontramos que cada oxigeno esta conec-
tado mediante puentes de hidrogeno con cuatro vecinos. Cada oxigeno posee dos
puentes como dador y dos como aceptor de prot ones (ver figura 1.6). Estos puentes
no pueden romperse simplemente con la presion. Cuando la presion es extrema se
produce distorsion, como por ejemplo en el caso de las formas VII y VIII, el numero
de primeros vecinos aumenta a ocho, cuatro ligados mediante puentes de hidrogeno
y cuatro que no 10 est an. Obviamente se ha producido una gran distorsion de la
estructura tetraedrica original.
26 Temas de Biofisicoqufmica

Figura I.6: Coordinaci6n de la molecula de agua en el hielo. Las esferas pequenas represent an
los atomos de hidr6geno.

1.4.1. Estructu ra del hielo h


El hielo mas comun es el hielo h, Ham ado frecuentemente hielo hexagonal de-
bido precisamente a que posee estructura hexagonal. La estructura tetraedrica de
los atomos de oxigeno tiene una ligera distorsi6n 6 de manera que se produce una
red abierta, la que se muestra en la figura 1.8. Podemos ver que la red esta formada
por hexagonos cuyos vertices est an ocupados por atomos de oxigeno. Los hexagonos
paralelos al eje c tienen forma de bote en tanto que los que est an dispuestos perpen-
dicularmente a dicho eje tienen forma de silla.
Las dimensiones de la red varian con la temperatura siendo la distancia entre los
atomos de oxigeno entre O.294nm (2.94A) a O°C y O.275nm (2.75A) a -196°C [11].
De acuerdo a La Placa y Post [12] el valor de la distancia 0-0 paralela al eje c
seria mas corta que la distancia O ... 0 en otras direcciones.

Disposicion de los protones

Los estudios de rayos X hicieron posible la descripci6n cristalina que hemos men-
cionado; sin embargo, las posiciones de los prot ones no se pueden determinar con

0
6El lingulo tetraedrico ideal es de 109,41 en tanto que para el agua ese lingulo se modifica ya
,

que el lingulo HOH difiere de ese valor (Tabla I.1).


1. Agua 27

Temperatura °C
30

320
40
280

240
-40
.' VI 200
(.
-80 II
,, '.
, VIII
160
-120 \

.,:' \
\
, 120
-160 :, '
\

.,:'" IX
\

-200 ~__~~__~-L~~__~~~80
5 10 20
Pres i6n/ki lobars

Figura I. 7: Diagrama de fases del hielo.

dicho metodo, 10 que es posible mediante difraccion de neutrones. Ese tipo de estu-
dios arroja interesantes resultados.
Las posiciones de los prot ones a 10 largo de la linea 0-0 indica que, por una
parte, el enlace 0 - H es aproximadamente O.003nm (o.03A) mas largo que en la fase
vapor (ver tabla 1.1) pero -10 que es mas notable- no es posible asignar un unico
proton a largo del enlace O ... 0. Considerando unicamente la posicion de los atomos
de oxigeno, tal como ocurre con los datos provenientes de difraccion de rayos X, se
obtiene una red ordenada, como la que se muestra en la figura 1.8. Los resultados
experiment ales de difraccion de neutrones son compatibles con esa estructura orde-
nada de la red de atomos de oxigeno en tanto que aparecen dos "medios" prot ones a
10 largo del enlace 0-0. 7 Para la interpretacion de este resultado debemos tener en
cuenta que los prot ones no pueden estar divididos y que la imagen que obtenemos es
el promedio de toda la red. Por 10 tanto podemos imaginar que la orientacion de las
moleculas de agua puede ser diferente de una region a la otra. Esos "medios" pro-
tones a 10 largo de cada enlace nos indican que el proton puede estar en cualquiera
de los extremos del mismo. La estructura resulta desordenada cuando pretendemos
tomar la totalidad de la molecula de agua. La figura 1.9 muestra esquematicamente
como es posible tener una red ordenada considerando oxigeno e hidrogeno(Fig. L9a).
La figura L9b muestra una de las tantas posibilidades de estructuras desordenadas
respecto de los protones.

7Esto significa que la densidad obtenida en cada punta corresponde a la mitad de la densidad
de un prot6n.
28 Temas de Biofisicoqufmica

Figura I.8: Red de hielo Ih.

Un cristal de hielo sin defect os cumple con las llamadas reglas de Bernal que se
pueden expresar como:

r) Cada sitio de la red esta ocupado por una molecula de agua unida a sus cuatro
primeros vecinos con estructura tetraedrica.

II) Cada molecula de agua permanece intacta (un atomo de oxigeno y dos pro-
tones).

III) Hay siempre unicamente un proton a 10 largo de cada enlace 0-0.

La entrop(a residual del hielo

De acuerdo a la tercera ley de la Termodinamica, la entropia de un cristal sin


defect os debe ser nula a T = OK. Hemos mencionado que el hielo no es un cristal
perfecto ya que, independientemente de la posible existencia de otros defect os , la
estructura de los prot ones no es ordenada. Uno podria esperar que al descender la
temperatura dicha estructura busque su minimo de energia, el cual corresponde a la
red ordenada. Sin embargo el hielo h posee un valor de la entropia en el cero absoluto
diferente de cero. La entropia que permanece a cero Kelvin se denomina entropia
residual 8(0) y se la puede determinar experimentalmente midiendo la capacidad
1. Agua 29

a) ~ ~ ~ ~ b) ~ ~ ~
---9- H - - - 9 - H - - - 9- H - - - 9- H ---O-H---O--- H-O-H ---O-H
I
, I I I

, : ~ : :
H , H H
1 H
I
H
I
H
I
---O-H---O-H---O-H
I I I
H
I
---O-H
,I
I
I
I
,
I
I
I

I
~
I
H-O --- H-O-H ---0 --- H-O---
I
I

~ t;i ~ 8 ~ ~ : ~
---9- H - - - 9 - H - - - 9- H - - - 9- H ---O-H---O--- H-O---
I T I
H-O---
I

: H H :

Figura I.9: Es posible tener una red de hielo orden ada respecto a los atomos de oxigeno y
varias desordenadas respecto a los prot ones manteniendo la integridad de las moleculas de
agua y solamente un proton a 10 largo de la linea 0-0. a) esquema de la red ordenada. b)
una de las numerosas posibles estructuras desordenadas.

calorific a molar en funcion de la temperatura, ya que la dependencia de la entropia


con la temperatura puede describirse como:

8(T) = 8(0) + J(Cp(T)jT) dT. (1.13)

La capacidad calorific a a presion constante puede determinarse experimental-


mente hast a temperaturas muy cercanas al cero absoluto. El punta de referencia
necesario se obtiene a traves del dJculo (teorico) de la entropia del vapor. Esto
permite calcular la entropia residual [10]

8(0) = 0,82 ± 0, 05 cal mol-1K- 1 = 3,431 ± 0,21 J mol-1K- 1. (1.14)

Nos podemos preguntar cuaJ es la razon por la cual el hielo no es capaz de encon-
trar su minimo energetico al descender la temperatura, 10 que significaria llegar a la
estructura ordenada que es la de menor energia de red. Las diferencias energeticas
entre numerosas configuraciones en el hielo Ih es muy pequeiia. Cuando la tempe-
ratura cae por debajo de un cierto valor, los movimientos de orientacion molecular
se ven restringidos mucho antes de lograr alcanzar el minimo de energia.
Pauling propuso una teoria aproximada para estimar la entropia residual del hielo.
Considera que el numero de configuraciones 0, ligados a la orientacion molecular
que define las posiciones de los prot ones , esta ligado a la entropia a traves de la
expresion

8 = kInO (1.15)
Un cristal de hielo con N moleculas contiene 2N O-H-O enlaces (despreciando
los efectos de superficie). Los prot ones de cada enlace pueden tener dos posiciones,
de 10 que resultan 22N configuraciones de protones. Pese a que hay cuatro enlaces por
30 Temas de Biofisicoqufmica

molecula, 10 que daria 16 posibles configuraciones por cada una de ellas, solamente
seis satisfacen las reglas de Bernal, 10 que reduce el numero en (6 x 4/16)N. Tenemos
entonces 2(24/16)N = 2(3/2)N, de tal forma que es n = (3/2)N obteniendo finalmente

8(0) = Nkln(3/2) = 0,806 cal mol-1K- 1 = 3,372 J mol-1K-1, (1.16)

valor que es cercano al valor experimental (1.14). Debemos notar que la aproximacion
hecha por Pauling desprecia correlaciones. Posteriores caJculos mas rigurosos dan
valores de la entropia residual de 0.8145 cal mol-1K- 1 = 3.408 J mol-1K- 1 [9], muy
cercanos a los obtenidos por dicho autor.

~v.-~'
Xi

't;'~'~f
Figura 1.10: Defectos de orientaci6n en hielo rho Enlace doblemente ocupado (D); enlace vacio
(L); defecto (X), una variante del Do

Otras variantes estructurales de hielo, como los hielos II, VIII y IX, tienen es-
tructuras de proton ordenadas.
1. Agua 31

1.5. Defectos y propiedades electricas del hielo Ih


Las propiedades electricas del hielo difieren considerablemente de las de la fase
liquida del agua. Tanto sus propiedades dielectricas como conductoras dependen
fuertemente de las particularidades estructurales. La permitividad dielectrica estatica
(la "constante dielectrica") es ~ 100, 10 que es llamativo. Regularmente el valor de
la permitividad estatica de los solidos es menor que la delliquido correspondiente, 10
que se explica facilmente ya que dicho valor depende de la facilidad de reorientacion
molecular (ver recuadro), la que esta restringida en el est ado solido en comparacion
con elliquido. En el caso del agua observamos un valor de alrededor de 80 en elliqui-
do y del orden de 100 en el solido. La posibilidad de orientacion de las moleculas de
agua en el cristal de hielo se ve favorecida por la existencia de defect os cristalinos, los
que adem as promueven la conductividad electrica. Los defect os de red constituyen
violaciones a las reglas de Bernal.

Defectos de orienta cion


La violacion de la tercera regIa de Bernal en el hielo produce tanto un enlace
doblemente ocupado (dejecta D) como un enlace vacio (dejecta L).8 Se puede pro-
ducir tambien elllamado defecto X, el que no es mas que una variante del D en donde
el proton se encuentra en una posicion intermedia. Estos defect os se esquematizan
en la figura LID.
Cuando se produce un defecto se forma en realidad un par D-L. Ese par puede
recombinarse, aniquilando el defecto, 0 migrar, logrando la propagacion del defecto.
Debe tenerse en cuenta que la propagacion, que puede dispararse 0 estimularse
mediante la aplicacion de un campo electrico, produce variaciones en la estructura
protonica que resultan indistinguibles de reorientaciones moleculares.

Defectos ionicos
Si un proton se mueve a 10 largo del enlace, se produce la violacion de la segunda
ley de Bernal; es decir, se pierde la integridad de dos moleculas de agua, con la
consecuente formaci on de un par ionico (H30+ y HO-). La figura 1.11 muestra el
proceso esquematicamente.
Tambien aqui el par puede aniquilarse 0 migrar. La migracion, estimulada por
un campo electrico, es la contribucion mas importante a la conductividad electrica,
ya que la conductividad debida al movimiento electronico es despreciable.
Tal como se observa en la figura 1.11 a 10 largo del enlace 0-0 se forman dos
minimos relativos de energia para el proton, con una barrera de 14 kcaljmol entre

8Mantenemos la nomenclatura usual, basada en palabras en aleman D (de doppelt = doble) y L


(de leer = vacio).
32 Temas de Biofisicoqufmica

enos. El proton debe superar esta barrera de energia y se ha postulado que tambien
podria pasar mediante efecto tunel cwintico. Esta alternativa, si bien atractiva, no
ha sido confirmada.

Figura I.11: Par ionico; a)Red ideal; b) Par ionico producido por el corrimiento del proton;
c) Separacion del par ionico por corrimiento del proton.

Cuando se forma el par hidronio-hidroxilo (H30+ ; HO-), debido al perfil de


energia entre el hidroxilo y alguna de las otras moleculas de agua vecinas que puede
ceder un proton, es facil que se produzca la transferencia comenzando la migracion.
Es interesante observar que entre una molecula de agua y un ion hidronio el proton
no tiene un punta de preferencia energetica para su localizacion. La movilidad de
prot ones en hielo es al menos el doble que la transferencia de prot ones en agua
liquida. Este fenomeno tiene suma importancia en estructuras biologic as en las cuales
la transferencia de prot ones son la base de la reactividad. Estructuras de hidratacion
tipo hielo son frecuentes en relacion con est os procesos.
1. Agua 33

1>,=3.2

",,_ _1>=1.0
1L-__~____-L____~__~_____
1 16 16 16' 16'
Frecuencia / Hz

Figura I.12: Parte real de la permitividad dielectric a (E') en funci6n de la frecuencia del hielo
Ih.

Propiedades dielectricas del hielo

La aplicacion de un campo electrico actua sobre los moment os dipolares pro-


duciendo la polarizacion de la muestra. Este proceso, debido a que la orientacion
de las moleculas requiere un tiempo finito, no se produce instantaneamente. A los
tiempos caracteristicos de cada proceso de polarizacion se los denomina tiempo de
relajaci6n. Es posible expresar el proceso en funcion de la frecuencia. La figura
1.12 muestra el espectro dielectrico del hielo y en la tabla 1.4 se resumen algunas
propiedades de los defect os de red del hielo asi como algunos datos de permitividad
y conductividad electrica.

Cuadra I.4: Prapiedades de los defect os i6nicos y de orientaci6n del hielo Ih a-10° C

PROPIEDADES DE DEFECTOS ORIENTACIONALES IONICOS


Energia de formaci on de pares
I (kJ/mol-pares) 72 ± 4 92± 12
Concentracion
I(mol defectos/mol hielo) 2 x 10- 7 rv 3 X 10-
12

Energia de activacion de difusion


(kJ Imol) a 22,6 ± 0,8
Movilidad
l(cm3 V- 1 s- 1 ) J-ll = 2 X 10- 4 J-l+ = 8 X 104
Movilidad relativa J-lL I J-lD > 1 J-l+ I J-l- rv 10 a 100
a Es de notar que corresponde al mismo valor que el agua liquida.

Conductividad de corriente continua (CC) de hielo 1h a 10°C = 1,0 X 1O- 7 /0- 1 m- 1


34 Temas de Biofisicoqufmica

Relajaci6n dieh§ctrica
Consideremos un material cuyas moleculas poseen un momento dipolar, como en el caso
del agua. La aplicaci6n de un campo elect rico a la muestra producini un ordenamiento
de los dipolos en la direcci6n del campo, este proceso se denomina polarizacion. Cuando
cesa la aplicaci6n del campo elect rico esta polarizaci6n decae. La figura I.13a muestra
el proceso de decaimiento de la polarizaci6n en funci6n del tiempo. El tiempo carac-
teristico de este decaimiento se denomina tiempo de relajacion (T). El decaimiento de la
polarizaci6n responde a las caracteristicas del sistema; el tiempo de respuesta depende de
la facilidad en la que los dipolos responden a la aplicaci6n y corte del campo electrico. A
mayor viscosidad, por ejemplo, la respuesta sera mas lent a y en consecuencia el tiempo
de relajaci6n sera mayor. La expresi6n mas simple del decaimiento de la polarizaci6n es
una funci6n exponencial.

P(t) = P(O)e(-tjr).

Ademas del tiempo de relajaci6n es import ante la amplitud de la polarizaci6n. Si en


lugar de analizar la respuesta del sistema en el tiempo estudiamos la respuesta frente a
un campo oscilante tendremos el espectro dielectrico, es decir la permitividad c en funci6n
de la frecuencia. La permitividad dielectric a es una variable compleja donde la parte real
se refiere a la dispersion y la parte imaginaria a la absorcion de energia. Las respuestas
en tiempo y en frecuencia estan relacionadas por la transform ada de Fourier. Cuando la
frecuencia se expresa en radianes por segundo (w) el tiempo de relajaci6n es T = l/w;
si damos la frecuencia f en ciclos por segundo, es decir en Hz, result a T = 1/(27rJ). La
figura I.13b muestra un esquema del espectro dielectrico.
La expresi6n en frecuencia correspondiente a la funci6n de relajaci6n que acabamos de
mostrar es:

* EO -
E (w) = EO + .Eoo ,
1 + zw T

cuyas partes real e imaginaria son:

, EO - Eoo
E (w) = Eoo + 1+ (w T
)2'

E" (w) = (EO - Eoo) ~T)2 ,


1+ w T

donde E*(W) = E'(W) + iE"(W), con (w) la frecuencia; EO y Eoo son la permitividad a fre-
cuencia nula (la 'constante dielectrica''') y la permitividad a frecuencias extremadamente
altas respectivamente, y T el tiempo de relajaci6n, que es el mismo que corresponde a la
expresi6n en dominio de tiempo.
Cuando existe mas de un proceso de polarizaci6n se deb en sumar las contribuciones de
cada uno de ellos. No todos los procesos pueden representarse con un decaimiento simple.
1. Agua 35

Parte real (dispersi6n)

a) b)

o.oo+--------.:==~--­
o tierrpo Frecuencia (escala logaritmica)

Figura 1.13: Relajaci6n dielecrica; a)Decaimiento de la polarizaci6n en funci6n del tiempo; b)


Espectro dielectrico en funci6n de la frecuencia.

1.6. La fase Ifquida


Nuestro interes sobre el agua esta dado fundamentalmente por el agua liquida. El
camino seguido, gas y solido, adem as del interes que tiene para la interpretacion de
la hidratacion, es importante para comprender mejor el est ado liquido, sin duda el
menos conocido de los tres. Las dificultades para interpretar los resultados en liquidos
esta presente tambien en el agua, con el agravante de que se trata de un liquido
complejo. Trataremos de dar algunos principios basicos necesarios para entender
ciertas propiedades del agua de importancia para la vida.

1.6.1. Algunas propiedades del agua Ifquida

El agua posee algunas caracteristicas que la distinguen de otros liquidos, fre-


cuentemente llamados "normales", tal es as! que muchas veces se hace referencia a
las "anomalias" del agua. N ada de eso, las propiedades del agua son norm ales -para
el agua-. Esas propiedades que la apart an de la mayoria de los otros liquidos son
las que hacen que el agua sea una sustancia {mica y que se haya tornado en esencial
para la existencia de vida, al menos en la forma en que la conocemos en el planeta
Tierra.
Trataremos de poner atencion en las propiedades particulares del agua que resul-
tan relevantes para 10 que trataremos mas adelante, con enfasis en aquellas en que
est an menos difundidas.
Una de las caracteristicas que la apart an del comportamiento de la mayoria de los
liquidos es el aumento de la densidad al pasar del est ado solido alliquido. Al fundirse
el hielo, la densidad crece y continua creciendo con la temperatura hast a llegar a los
4°C, temperatura a la cual se produce el maximo. Aumentando la temperatura la
36 Temas de Biofisicoqufmica

1B.O"~
Volumen! cm'mol .,
19.5
'. f(()~O .
BcD
lii.Oil':
-.. (J .{ r;

J9.0

_________ L ________ L ________ L ________ L ________ L ________ L ________1.____ _


-40 -20 0 20 40 60 80 tOO

Temperatura/oC

Figura I.14: Densidad del agua en funcion de la temperatura para diferentes composiciones
isotopicas.

densidad disminuye. En la figura 1.14 podemos observar la densidad y el volumen


especifico del agua (vesp = 1/<5) para diferentes composiciones isotopicas entre 40 y
100°C. El maximo de la densidad a 4 °C ocurre para la composicion isotopica mas
abundante.
Este comportamiento ocurre solamente a presiones moderadas. Aumentando la
presion no solamente podemos producir otros tipos de hielo sino que esta "anorma-
lidad" desaparece.
Otro aspecto distintivo del agua es la respuesta a la presion, que observamos a
traves del coeficiente de compresibilidad isotermica ,. En la mayoria de los liquidos
este coeficiente crece montonicamente con la temperatura, en el caso del agua (a
presion de 1.013 x 10 5 Pa = 1 atm) este coeficiente disminuye entre 0 y 46°C y
aumenta a partir de esa temperatura. El comportamiento se muestra en la figura
1.15.
La figura 1.16 muestra la capacidad calorific a isobarica (Cp ), la entalpia (H) y
la entropia (8) del agua entre 0 y 600 K. Es interesante observar que la capacidad
calorific a aumenta casi al doble de su valor en el punta de fusion y permanece casi
constante hast a que pas a a la fase de vapor. 9 Este alto valor de Cp es de suma
importancia para la regulacion de la temperatura corporal.
El aumento que se observa en el valor de la entalpia en el punta de fusion y de

gEl grafico no muestra la pequena variaci6n de C p en el estado liquido, que tiene un pequeno
pica a 35°C (311 K).
1. Agua 37

40~____~____~~__~~__~~___

Figura 1.15: Dependencia de la compresibilidad isotermica del agua con la temperatura.

24

20 Punta de fusi6n
--r
16 ~

!
12

4 Punta de ebullici6n

-4
C __ _ calmol
p

-8
H-rt., _"""",,'kcalmol-'

-12 G-I-\, _ _ kcalmol-'

o 100 200 300 400 500 600


TrK

Figura 1.16: Dependencia de la temperatura de la cap acid ad calorific a isopiestica, entropia,


entalpia, y energia libre del agua a 1 atm (101325 Pa).
38 Temas de Biofisicoqufmica

100 ~
Puntos de fusi6n

o
E
.,"
E
Co
~ -100 H
I-
J\sH 5
PH 5 SnH 4

CH SiH - ~ CH
~eH4
4 4
-200

Figura I.17: Entalpia de vaporizacion de las secuencias isoelectronicas de hidruros

ebullicion indica los cambios notables del calor latente de fusion y vaporizacion.
Es interesante observar los valores de las entalpias de fusion y de vaporizacion
en compuestos isoelectronicos de hidruros. La figura 1.17 muestra las entalpias de
vaporizacion. lO Es de notar que el metano (CH 4 ) no posee capacidad de formaci on
de puentes de hidrogeno, en tanto que el amoniaco (NH 3 ), el acido fluorhidrico
(HF) y el agua (H 2 0) si 10 hacen. La cohesion de los liquidos que forman puentes
de hidrogeno, que frecuentemente denominamos estructurados, eleva el punta de
ebullicion y produce un alto calor latente.

1.6.2. La estructura del agua Ifquida

EI concepto de estructura

El concepto de estructura suele tomarse como uno de los llamados concept os


primitivos, que no necesitan definicion. Sin embargo, la definicion correct a de es-
tructura nos lleva naturalmente a observar que es posible encontrar estructura en el
est ado liquido.
Consideramos que existe estructura cuando:

1. Es posible definir ciertas unidades "estructurales" Sk que puedan describirse


mediante distancias y angulos de enlace.

2. Existe un numero finito de estas estructuras.

lODejamos la comparaci6n de las entalpias de fusi6n para ellector.


1. Agua 39

a) b) c)
ns g(r) s
6 6

4 4

2 2

3 3
rl rl

Figura 1.18: Funci6n de distribuci6n radial. (a) Red regular bidimensional. (b) Gnifico del
mimero de ,itomos a una distancia r del de referencia. (c) La funci6n de distribuci6n radial
obtenida normalizando el gnifico (b).

3. El tiempo de vida de las Sk es al menos de un orden de magnitud (10 veces)


mayor que el periodo de vibracion de las particulas en su posicion de equilibrio.

Es facil ver que un cristal satisface estas condiciones. Resulta posible definir
unidades estructurales (la celda unidad); existe un numero finito de estas y, final-
mente, el tiempo de vida de las estructuras excede largamente el periodo de vi-
bracion molecular. Esto no ocurre en el est ado amorfo, 0 en un vidrio, donde existen
unidades estructurales de largo tiempo de vida pero su numero no es finito. Es in-
correcto asi hablar de "estructura de un vidrio". En un liquido sabemos que existen
estructuras de corto alcance (en el parrafo siguiente discutiremos el caso) , pero no
todos cumplen con la condicion 3. Solamente los liquidos estructurados pueden tener
estructuras del tiempo de vida apropiado y, como veremos, el agua como tal satisface
claramente esa condicion, 10 que puede demostrarse experimentalmente.

Funciones de distribucion molecular

El est ado dinamico de la estructura hace necesaria la introduccion de metodos


estadisticos que nos permit an estudiar valores promedio de organizacion. Las lla-
madas funciones de distribuci6n nos permiten efectuar dicho analisis apropiada-
mente. l.Como construimos esas funciones de distribucion?
Comenzaremos analizando un solido cristalino. En dichas sustancias el orde-
namiento atomico es regular y relativamente estable, por 10 tanto la distancia en-
tre los atomos vecinos permanece aproximadamente constante, como se muestra
esquematicamente en la figura L18a. Consideremos ahora un atomo como centro
arbitrario y midamos la distancia entre este y los primeros, segundos, ... nesimo ve-
cinos y grafiquemos el numero de los que caen en un intervalo de distancias. Luego
cambiemos el atomo de referencia y repitamos el proceso para todos los atomos. Las
40 Temas de Biofisicoqufmica

a) b) c)
ns g(r) s
6 6

4 4

2 2

3 3
rl rl

Figura I.19: Un "liquido bidimensional" y su funcion de distribucion radial g(r). Notese que
no posee la regularidad del solido de la Fig.LI9.

distancias de los primeros vecinos senin en todos los casos muy similares y aumen-
tara la dispersion de las medidas a medida que tomemos vecinos mas lejanos, tanto
mas cuanto mas desordenado sea el cristal.
La figura L18b muestra el resultado de nuestro grafico que, debido al gran orde-
namiento de nuestro esquema, posee picos muy definidos. A medida que nos alejamos
del centro, el numero de vecinos en general crece, ya que el tamaiio del anillo alrede-
dor de la referencia aumenta. l l Es interesante normalizar el grafico con el valor
medio del numero de atomos que se encontrarian en el anillo; es decir, el producto
de la densidad por el area (para el caso tridimensional seria el producto de la dens i-
dad por el volumen del casquete esferico). En nuestro ejemplo obtenemos el grafico
que se muestra en la figura L18c.
La curva de la figura L18c es la Juncian de distribucian radial 9 (r) y es la densidad
de probabilidad de encontrar n particulas en un intervalo dado.
Con el mismo concepto podemos generalizar a funciones de distribucion angulares
alrededor de un punta dado g(()) e incluso considerar mas variables g(r, ()) 0 g(r, (), ¢).
En la funcion de distribucion radial de los solidos, como la del ejemplo, los picos
est an espaciados a intervalos regulares y est an muy bien definidos practicamente
para cualquier distancia. En el caso de los liquidos esta regularidad no se encuentra
y a grandes distancias los picos desaparecen.
La figura 1.19 muestra el caso para un "liquido bidimensional".
Para un liquido real (tridimensional) el promedio del numero de particulas en
una esfera de radio R, excluyendo la particula central, se puede escribir como:

NCN = P foR g(r)47fT 2dr, (1.17)

donde p es la densidad numerica (el numero de particulas por unidad de volumen).

11 El area del anillo circular de ancho t:,. r a una distancia r del centro es a = 'if [2r t:,. r + (t:,. r ) 2].
1. Agua 41

g(r)
_Ill Argon
3
Agua

o 2 3
ria
Figura I.20: Esquema de la funcion de distribucion radial para agua y argon liquido. Las
distancias se expresan en unidades del diametro molecular de cada especie

La cantidad NCN es el numero de coordinaci6n para una esfera de R. Para (J <


R < 2(J obtenemos el numero de coordinacion de acuerdo a la definicion corriente.

La funcion de distribucion radial del agua

La funcion de distribucion radial es un medio importante para describir ciertas


propiedades de los liquidos, el agua liquida no es una excepcion. Dado que el agua
es un liquido molecular, podemos generar funciones de distribucion para cada uno
de los atomos que componen la molecula. Comenzaremos por la funcion de distribu-
cion radial oxigeno-oxigeno. Esta funcion de distribucion represent a apropiadamente
la distribucion molecular ya que el centro de mas a de la molecula de agua se en-
cuentra muy cercano al centro de mas a del oxigeno. Por otra parte, esta funcion de
distribucion se puede obtener experimentalmente mediante difraccion de rayos X.
En la figura 1.20 podemos ver la funcion de distribucion radial del agua y del
argon liquidos. A efectos de una mejor comparacion las unidades de distancia se
expresan en diametros moleculares (0,28nm para el agua y 0,34nm para el argon).
Podemos observar propiedades distintivas de ambos fluidos. El pi co inicial corres-
ponde a los primeros vecinos y esta localizado a un diametro molecular en ambos
casos, 10 que es de esperar. La integracion del primer pico, debidamente normali-
zado por la densidad numerica, nos permite observar que para argon el numero de
primeros vecinos (el numero de coordinacion) es NCN ~ 10 en tanto que para el agua
resulta NCN ~ 4,4. La estructura cambia con la temperatura y eso se refleja en la
funcion de distribucion radial. Resulta interesante observar que con el aumento de
42 Temas de Biofisicoqufmica

a)

Figura I.21: Distribucion de los primeros y segundos vecinos en (a) un liquido simple (ej.
argon liquido) y (b) agua.

la temperatura el numero de primeros vecinos disminuye para el argon y aumenta


para el agua.
El segundo pi co es tambien informativo. Vemos que la posicion del segundo pi co
(los segundos vecinos) corresponde a aproximadamente dos diametros moleculares
para el argon (20") pero para el agua corresponde a algo mas de un diametro y medio
(1,60"). Para el argon la posicion del segundo pi co corresponde a un empaquetamiento
compacta (figura 1.21a), en tanto que para el agua la estructura es mas abierta. En
la figura 1.21b vemos un esquema de una posible disposicion de las moleculas de
agua que explicaria el resultado experimental.
Esta estructura abierta es posible debido a las exigencias orientacionales de los
enlaces de hidrogeno. Por otra parte vemos tambien que los picos en agua son mas
agudos que para argon, 10 que denota una mayor definicion en la interaccion mole-
cular. La existencia de puentes de hidrogeno de longitud definida contribuye que la
distribucion se mas uniforme.
En un liquido monoatomico, como el argon, cada molecula es capaz de gener-
ar una unica funcion de distribucion radial. Para el caso de moleculas poli-atomi-
cas, cada par de atomos diferente puede generar una funcion. Tal es el caso del
agua donde encontramos las funciones de distribucion oxigeno-oxigeno [go-o(r)],
que analizamos en los parrafos anteriores, oxigeno-hidrogeno [gO-H(r)] e hidrogeno-
hidrogeno [gH - H (r )]. La funcion de distri bucion oxigeno-oxigeno se 0 btiene experi-
mentalmente mediante rayos X, en tanto que a las otras dos no es posible obtenerlas
mediante esa tecnica ya que los prot ones no son detectados. Es necesario apelar a
la difraccion de neutrones.
En la figura 1.22 se muestra un esquema de las tres funciones de distribucion de
agua asi como la dependencia de la temperatura de go-o(r). Podemos ver que al
aumentar la temperatura los picos en la funcion de distribucion radial de oxigeno
se ensanchan y se tornan mas difusos, 10 que muestra la perdida gradual de la
estructura.
1. Agua 43

~l A g(;or a)
d)

0~15t
100C

:~02
g(r)04 OBb ) ::l 75C

50C

1 10 l
o 10 l
~I"' "' "'.J '" 4C

~
0.2 0.4 O.B
0.0 L::....=:::':::::::::L::::::;:::::::;:::::::;:::::::;:=-l
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
r I nm r/nm

Figura I.22: Funciones de distribuci6n radial para el agua (datos de ref. [17]): a) go-o(r),
b)gO-H(r), c) gH-H(r), (d) go-o(r) experimental a diferentes temperaturas (redibujado de
ref. [18])

Las tres funciones de distribucion del agua nos permiten sugerir un modelo de
agua liquida que refleje los resultados experiment ales disponibles. Sin embargo, la
complejidad del agua no permite obtener facilmente un modelo totalmente realista.
Si analizamos la estructura, tal como la hemos definido, vemos que las funciones
de distribucion, que reflejan el promedio en tiempo y espacio de la distribucion
molecular, nos informan la existencia de ciertas 'entidades estructurales' tanto en
el caso del agua como en el del argon. Estas entidades est an definidas en el corto
alcance, 10 que se deduce de las curvas ya que, a medida que nos apart amos de la
molecula de referencia los picos, representativos del orden, se esfuman. Si alguno de
los dos liquidos posee estructura dependera del tiempo de vida de esas entidades
(como definimos en 1.6.2). Ese tiempo de vida no 10 podemos conocer a traves de
las funciones de distribucion sino que debemos apelar a metodos que nos informen
sobre la dinamica molecular.
Para el estudio de la dinamica del agua se utilizan tecnicas espectroscopicas
entre las que encontramos espectroscopias infrarroja y Raman (Apendice B), re-
lajacion dielectrica, resonancia magnetica nuclear (Apendice B §B.3) y dispersion
de neutrones. 12 De est os experiment os se encuentra que para el agua el periodo de
vibracion inter-molecular es de aproximadamente 2 x 10- 13 segundos, en tanto que
el tiempo de vida de las estructuras es del orden de 10- 11 segundos, por 10 que es
posible definir la estructura.

12La dispersi6n de neutrones lent os por el agua liquida es de dos tipos: cuasi-elastica -con muy
poco intercambio de energia entre los neutrones y elliquido, e inelastica -con el intercambio de una
energia definida. La dispersi6n cuasi-elastica permite obtener informaci6n dinamica.
44 Temas de Biofisicoqufmica

1.6.3. Modelos para agua Ifquida

Pese al gran esfuerzo que se ha realizado y se sigue realizando en busca de


un modelo del agua liquida, no existe aun uno que represente adecuadamente las
propiedades del agua. Bernal y Fowler [13] fueron los que propusieron el primer
modelo "moderno" para agua considerando la aparicion sucesiva de diferentes es-
tructuras de acuerdo a la temperatura. La estructura predominante a bajas temper-
aturas seria una estructura abierta tipo tridimita (como continuacion del hielo), al
aumentar la temperatura apareceria una estructura tipo cuarzo y a temperaturas
altas una estructura de empaquetamiento compacto. El modelo estaba inspirado en
la informacion de rayos X y esta de acuerdo con algunos experiment os de espectros-
copia Raman pero resulto de poca utilidad para la prediccion de propiedades, no
obstante fijo las bases para un estudio racional del problema.
Otro modelo propuesto fue elllamado modelo intersticial [15] en el cual se parte de
una estructura tipo hielo con moleculas intersticiales. Al fundirse el hielo, moleculas
de la red pasan a los intersticios y las vacantes formadas migran hacia la superficie
aumentando la densidad. Este proceso aumentaria hast a los 4 °C cuando se alcanza
el maximo en la densidad del agua. Posteriormente la formaci on de vacantes au-
mentaria de tal manera que la migracion no es 10 suficientemente rapida hacia la
superficie como para compensar la aparicion de vacantes 10 que, sumado a la ex-
pansion de la red, hace que la densidad comience a disminuir. Variaciones de este
modelo resultaron utiles para describir el calor de vaporizacion.
A 10 largo del tiempo han aparecido diversas variantes del llamado modelo de
"dos est ados" , donde dos estructuras, una de alta y otra de baja densidad, coexisten
en proporciones tales que reproducen las propiedades del agua en su totalidad. Este
tipo de modelo ha reaparecido con mas fuerza ala luz de ciertos experiment os que
muestran que, al menos a bajas temperaturas, se pueden encontrar una estructura
de baja y otra de alta densidad. En este modelo -ahora aceptado universalmente-
es basicament el de de Bernal y Fowler.
Un modelo muy interesante, que mas que ala estructura se refiere a la dinamica,
es el de Frank y Wen [14] quienes 10 denominaron de "cumulos relampagueantes"
(flickering clusters). La idea del modelo es que las moleculas de agua est an conec-
tadas por puentes de hidrogeno de corta vida media de manera que se forman cumu-
los de distinto tamaiio que se desarman y rearm an rapidamente (de alli el grafico
nombre de "relampagueantes"). Nemethy y Sheraga [16] desarrollaron el modelo
cuidadosamente considerando cumulos con moleculas con cero, uno, dos, tres y cua-
tro puentes de hidrogeno. El tratamiento mecanico estadistico les permitio obtener
muchos datos termodinamicos con muy buen acuerdo. El modelo no describe las
caracteristicas estructurales de los cumulos sino la distribucion de tamaiio de los
mismos.
1. Agua 45

Finalmente mencionaremos los modelos continuos donde todas las moleculas de


agua est an interconectadas. Estos modelos no resultaron de mayor utilidad. La apari-
cion de la simulacion computacional arrojo alguna luz al problema mostrando cierta
continuidad, pero, a su vez, la presencia de distribucion de cumulos, aunque sin una
coincidencia total con las predicciones anteriores. El tema esta lejos de haber sido
resuelto pero es de esperar un avance relativamente rapido en el futuro cercano.

1.6.4. Propiedades dinamicas del agua

Datos experimentales

Uno de los metodos, que ya hemos mencionado, para el estudio de las propiedades
dinamicas del agua es la relajacion dielectrica. El espectro dielectrico del agua se
muestra en la figura 1.23, donde, como es habitual, se grafica la permitividad en
funcion del logaritmo de la frecuencia (en este caso en Hertz (ciclosjsegundo). El
comportamiento de la permitividad del agua con la frecuencia no es exactamente
del tipo de Debye sino que existe una pequeiia distorsion que se puede expresar
con un exponente en el termino WT, escribiendolo como (WT)l-a. Dado que el valor
experimental de 0: resulta igual a 0,02 (1-0: = 0,98) es posible considerar un proceso
tipo Debye para la mayoria de los usos.
El tiempo de relajaciondel agua es igual a 9.26xl0- 12 S (a 20°C) y, de acuerdo
a la teoria de relajacion de Debye, se 10 puede relacionar con la viscosidad mediante
la formula

(1.18)

donde a es el radio molecular y 17 el coeficiente de viscosidad.


Utilizando el tiempo de relajacion obtenido mediante las propiedades dielectricas
se obtiene para el radio molecular un valor de a = 0,14nm, que es aproximada-
mente la mitad de la distancia oxigeno-oxigeno que se encuentra con experiment os
de difraccion de rayos X (d:=:::; 0,29nm). Este acuerdo nos indica la consistencia de los
datos y teoria. Mediante la utilizacion de resonancia magnetica nuclear (Apendice
B §B.3) se puede calcular el tiempo de correlacion rotacional (relacionado con el
tiempo de relajacion dielectrico) encontrandose un acuerdo excelente.
El coeficiente de difusion del agua en agua (coeficiente de autodifusion) D se
puede medir en forma independiente y esta tambien relacionado con el tiempo de
relajacion. Si designamos el desplazamiento medio cuadratico promedio por (r2)
est os parametros se relacionan por

(1.19)
46 Temas de Biofisicoqufmica

80J----~

:§ 60
·5

~ 40

20

o
1 2
10 10
Frecuencia / GHz

Figura I.23: Espectro dielectrico del agua liquid a a 10 °C (EO = 82,0; E(X) = 4,5; T = 9,26 X
1O- 12 s y a = 0,02).

El coeficiente de auto-difusion se puede medir mediante marc adores radiactivos


(tritio) y para el agua a 25°C tiene un valor de 2.57 x10- 9 m 2 /s. La tabla 1.5
muestra los valores para diferentes temperaturas.
Es interesante notar que el coeficiente de difusion de la molecula del agua tiene el
mismo valor que el coeficiente de difusion de los prot ones en agua liquida, en tanto
que en hielo los prot ones se mueven mucho mas rapidamente.
En estructuras "tipo hielo" del agua se puede producir el fenomeno de transferen-
cia de protones, 10 que resulta de mucha importancia para las reacciones bioquimicas.
Dado que este tipo de estructuras pueden presentarse en la hidratacion de enzimas,

Cuadra I.5: Coeficientes de auto difusi6n D de agua a diferentes temperaturas. [J. H. Wang, 1.
Phys. Chern. 69: 4412 (1965)].

Temperatura ;aC D /1O-9 m 2s -1 a Temperatura ;aC D /1O-9 m 2s -1 a

5.00 1,426 ± 0,018 35.00 3,49 ± 0,15


10.00 1,675 ± 0,025 45.00 4,38 ± 0,11
15.00 1,97 ± 0,020 55.00 5,45 ± 0,3
25.00 2,57 ± 0,022
1. Agua 47

la actividad enzimatica puede verse afectada.


El agua pes ada posee un coeficiente de difusion diferente del del agua. Este resul-
tado es de esperar debido a la mayor mas a del deuterio com parada con la del proton,
sin embargo la auto-difusion del agua pes ada no responde solamente al cambio de
mas a sino a la mayor interaccion de los enlaces de deuterio frente a los de hidrogeno.
La viscosidad es otra propiedad dinamica que ha sido estudiada exhaustivamente,
en la figura 1.24 se muestra un grafico de la viscosidad del agua en funcion de la
presion a diferentes temperaturas. Podemos ver que hast a los 33.5 °C la viscosidad
del agua decrece con la presion y luego aumenta. Para la mayoria de los liquidos la
viscosidad aumenta con la presion, resultado esperado debido a que el numero de
huecos disponibles para el movimiento de las moleculas se reduce. En el caso del
agua la ruptura del reticulado de los puentes de hidrogeno modifica la situacion. A
muy alta presion, el agua se comport a como un liquido "normal".

0,,2

1,6
0..
-2
-g 1,2
"0
·iii
o
()

~ 0,8

0,4

o 2 4 6 28 10
Presion/1000 kg em

Figura I.24: Coeficiente de viscosidad del agua bajo presion a diferentes temperaturas.

Energia de activacion

Un proceso activado se puede escribir como:

P = Po exp -Ea/ RT, (1.20)


donde P represent a el fenomeno estudiado, Po es el valor de P para l/T ---t O/K, Ea
la energia aparente de activacion, R la constante de los gases y T la temperatura
absoluta.
48 Temas de Biofisicoqufmica

Para el agua, la dependencia con la temperatura tanto del coeficiente de viscosi-


dad como del coeficiente de difusion pueden describirse con la expresion 1.20. Ambos
coeficientes poseen el mismo valor de energia aparente de activacion, que resulta ser
del orden de 19.25 kJ/mol (=4.6 Kcal/mol). Este valor es del mismo orden que la
energia de un enlace de hidrogeno, 10 que sugiere que ambos fenomenos tienen el
mismo mecanismo y, ademas, que el movimiento del agua se mueve rompiendo un
enlace a la vez.

1.7. EI estado vftreo

Hemos mencionado a la fase liquida como uno de los est ados mas complejos y
sobre el cual tenemos un conocimiento inferior al de los solidos cristalinos. Los es-
tados desordenados est an aun menos estudiados. Existen diferencias, que podrian
catalogarse de sutiles, entre los est ados desordenados (vitreos y amorfos) que men-
cionaremos en el desarrollo del tema. Pondremos enfasis en el est ado vitreo.
Existen materiales que al enfriarse por debajo del punta de fusion (T f) no crista-
lizan sino que conservan el des orden propio de los liquidos y adquieren la rigidez de
los solidos. Sus propiedades resultan por demas interesantes en tanto que sus dife-
rencias con los solidos cristalinos repercuten en su comportamiento y, para nuestro
interes actual, en el comportamiento de los sistemas biologicos.
Si se realiza un enfriamiento muy rapido de un liquido, el reordenamiento mole-
cular no puede alcanzar un est ado de energia 10 suficientemente bajo y no logra la
cristalizacion. Existen, por otra parte, sustancias en las que a cualquier velocidad,
por baja que sea en la escala de laboratorio, no se logra la cristalizacion, son las
llamadas sustancias "formadoras de vidrios" (glass forming). Un caso interesante es
el dioxido de silicio (Si0 2 ) el cualluego de fundirse por mas lenta que sea su velocidad
de enfriamiento (dentro de los procesos realizables) no cristalizara produciendo un
"vidrio" del tipo que utilizamos en nuestras ventanas.
La figura 1.25 muestra el proceso de solidificacion desde el liquido al cristal y,
alternativamente, a diferentes est ados vitreos pasando por liquidos sobreenfriados.
Vemos en la figura que, bajo circunstancias que podriamos llamar "regulares"
(10 que significa un enfriamiento a una velocidad tal que el sistema pueda buscar
sus minimos energeticos apropiadamente), se produce la cristalizacion. La curva de
volumen especifico muestra que cuando desciende la temperatura se produce una
caida abrupta a una temperatura que denominamos temperatura de fusion (T f).
Ese cambio brusco marca una transicion de primer orden. Si se trata de un liquido
formador de vidrio, 0 la velocidad de enfriamiento no es 10 suficientemente baja, la
curva de volumen especifico continua su descenso lineal por debajo de T f durante
un cierto intervalo en un est ado de liquido sobreenfriado. Por debajo de una cierta
1. Agua 49

Vidrio •.

~~
Cristal

Figura I.25: Diferentes caminos de solidificaci6n para un liquido formador de vidrio en termi-
nos del volumen V. Las line as quebradas indican el efecto de disminuir la velocidad de
enfriamiento. Para una velocidad extremadamente reducida la linea tomaria el valor del
cristal para T=T=.

temperatura Tv se produce la transici6n vitrea. Podemos observar en la figura que


se ha marc ado mas de una linea posible de cambio de pendiente del volumen es-
pecifico. Eso se debe a que la temperatura aparente de transicion vi"trea depende de
la velocidad de enfriamiento (0 calentamiento si el proceso se realiza desde el est ado
vi"treo). Esta ambiguedad no es tan dramatica, al menos en terminos generales, ya
que se puede obtener la Tv con una pequeiia dispersion utilizando velocidades de
enfriamiento del orden de 10 K/minuto.
El liquido sobreenfriado aumenta su viscosidad al descender la temperatura y
cae en el est ado vi"treo mediante un proceso que, como puede verse en la figura
para la variacion del volumen especifico, no tiene transiciones bruscas, sin embargo
la viscosidad llega a valores en los cuales la respuesta del material a un esfuerzo
externo se comport a como un solido. Convencionalmente se consider a que se llega al
est ado vi"treo cuando la viscosidad excede 10 13 Pa s, es decir que Tv se logra cuando
17(Tv) ~ 10 13 Pa s.
Las propiedades de los vidrios dependen de su historia previa, adem as del procedi-
miento de preparacion del mismo. Dado que no se encuentran en un est ado estable,
la distribucion molecular 13 de los vidrios esta en continuo cambio. A ese proceso
se 10 denomina envejecimiento y es una de las caracteristicas que distingue a los
vidrios frente a otros materiales amorfos. El envejecimiento no se realiza a una tasa
constante sino que es mas rapido a tiempos cercanos ala formaci on del vidrio.

13De acuerdo con la definici6n que dimos de estructura seria impropio hablar de estructura de los
vidrios.
50 Temas de Biofisicoqufmica

Tg / K
• SrO, 1473 .. /
.. GeO,
• Na 2 ·2Si0 2 713
• ZnCI,
'" MCH
380
85
810

'1/
./ //
~

enro
Q)
en
·0
D As 2Se 2
.. GeSe,
455
695
. .'
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!
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0..

./J / E
0.. L', CKN 217
E + CNH 338
/ /
OJ
0
--l
o o-tp
v pp
• tpp
246
363

.,/- .FI ...


204
.•
/
/
/


/
OJ
0
--l

;?1 ty'
~'" .jT.
-+c+-.+.--------- ++-+" ....

Tg/T

Figura I.26: Representaci6n de Arrhenius de 1a viscosidad de diversos materia1es. Se indica


1a temperatura de transici6n vitrea (T g) de cada uno de ellos.

Cuando la variacion de la viscosidad de los liquidos se realiza con una energia


de activacion constante, en una representacion de Arrhenius (In 17 versus liT) se
observa una linea recta. En una representacion de este tipo de sistemas que vitrifican
observaremos que no en todos los casos la energia de activacion es fija.
La figura 1.26 muestra una serie de sistemas donde se represent a el logaritmo
natural de la viscosidad en funcion de Tv IT a efectos de normalizacion.
Podemos ver en la figura que algunas sustancias preservan la linealidad a 10 largo
de todo el gnifico en tanto que en otras esto no ocurre. Aquellas que muestran un
gnifico de Arrhenius lineal, 10 que implica una energia de activacion constante, corres-
ponden a sistemas que poseen enlaces fuertes, generalmente de canicter covalente,
en tanto que los otros est an asociados predominantemente por fuerzas de van der
Waals 0 de caracter ionicas. Los primeros reciben la clasificacion de fuertes y los
segundos de fnigiles [19]. De acuerdo con esta clasificacion, el agua y las soluciones
solidas de carbohidratos en agua deberian clasificarse como fragiles, en tanto que las
proteinas como fuertes. Sin embargo la complejidad del agua es tal que bajo ciertas
condiciones puede considerarse como fuerte.
El comportamiento del agua y soluciones en su est ado vitreo es de mucha im-
portancia en los fenomenos de congelamiento y sec ado de materiales biologicos, los
dos mecanismos utilizados para preservacion de aliment os y medicamentos. La crio-
preservacion tiene tambien importancia para la conservacion de celulas. En terminos
1. Agua 51

generales el fenomeno se 10 designa como estres hidrico ya que en ambos procesos las
transformaciones son muy similares. El uso de carbohidratos (obviamente en solu-
cion acuosa) para la proteccion del est res hidrico es bien conocida y las propiedades
en el est ado vitreo son de vital importancia.
Bibliograffa

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[2] C.N.R Rao, Theory of H-bonds, en: Water, Vol. 1, editor F.Franks, Plenum
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53
54 Temas de Biofisicoqufmica

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680, 1964.

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[18] A.H. Narten, & H.A. Levy, Science, 65, 2263 ,1969.

[19] C.A. Angell, J.Phys. Chern., 49, 63, 1988.

Lecturas suplementarias

General

El siguiente material present a una descripci6n detallada del agua en sus diferentes
aspectos y puede ser una fuente litil para el interesado en profundizar el estudio sobre
el tema.

• O. Ya. Samoilov, Structure of Aqueous Electrolyte Solutions and the Hydration


of Ions, Consultants Bureau, New York, 1965.

• H.J.C. Berendsen, Water Structure en: Theoretical and Experimental Bio-


physics, editor A.Cole, Marcel Dekker, New York, 1967.

• D. Eisenberg & W. Kauzmann The Structure and Properties of Water, Oxford


Clarendon Press, Oxford, 1969.

• N.H. Fletcher The Chemical Physics of Ice, Cambridge University Press, Cam-
bridge, 1970.

• F. Franks, Editor, Water. A Comprehensive Treatise Vol. 1-7, Plenum Press,


New York, 1972-1982.

• F. Franks Water, a matrix of life. Royal Society of Chemistry, Cambridge,


2000.
Capitulo II

Soluciones

... ceux de MaCl3doine sont tres melanges. 1


GOSCINNY- U DERZO Asterix aux jeux Olympiques.

En el capitulo anterior hemos visto algunas propiedades del agua, ya que la vida es
imposible sin ella. Sin embargo, el agua en los seres vivos no se encuentra nunca pura;
por 10 tanto, en nuestro camino hacia el estudio del medio en el cual se desarrolla la
vida, pasaremos a un est ado mas complejo: las soluciones.

11.1. Potencial qufmico de soluciones


Una soluci6n ideal se define como aquella en la cuallos potenciales quimicos de
sus componentes se expresan como:

(11.1 )
donde R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta, Xi la fraccion molar
de la componente i Y J-l: el potencial quimico del est ado de referencia, que depende
unicamente de la presion y temperatura. 2
En los casos que nos interesan no se puede considerar que las soluciones se compor-
taran como soluciones ideales. Debemos ampliar la definicion de manera de incluir
soluciones reales. Una de las alternativas es utilizar un parametro que reemplace
la fraccion molar del componente de manera de guardar la forma de la expresion
11.1. Este nuevo parametro es la actividad de la especie iesima: ai. La expresion del
potencial quimico para soluciones reales queda:

1 ... los de Macedonia estan muy mezclados.

2Esta definici6n de la soluci6n ideal a partir de la expresi6n 11.1 es mas rigurosa que la que se
suele utilizar diciendo que es aquella formada por particulas que no interactuan entre sf.

55
56 Temas de Biofisicoqufmica

(11.2)
expresion que es valida independientemente de cuanto la solucion se aparte de la
idealidad. De la misma manera que en la ecuacion 11.1, 1_< es funcion solamente de
la presion y temperatura.
Es util escribir la ecuacion 11.2 como:

(11.3)
donde hemos reemplazado al actividad por el producto de la fraccion molar del
componente i multiplicada por el coeficiente de actividad del mismo, Ii, el cual
puede depender tanto de la presion y temperatura como de la concentracion.
La ecuacion 11.3 no define completamente el coeficiente de actividad Ii (y conse-
cuentemente ai) ya que es necesario establecer en que condiciones el coeficiente de
actividad es igual a la unidad. Existen diversas convenciones para definir univoca-
mente Ii segun las caracteristicas de la solucion.
Para el caso en el cual el 0 los solutos son solidos 0 gaseosos tendremos:

solvente /-Lo = /-L~ + RT In Xolo con 10 --t 1 cuando Xo --t 1, (11.4)


soluto /-Li = /-L: + RT In Xiii con Ii --t 1 cuando Xi --t O. (II.5)

El subindice 0 indica el sol vente. El significado de esta condicion es que a diluci6n


infinita tanto el coeficiente de actividad del soluto como del solvente son iguales a
la unidad y la solucion se comport a como ideal.
De todas formas estas medidas experiment ales son el reflejo del comportamiento
de la solucion como un todo por 10 que nos brindan informacion del valor medio del
coeficiente de actividad y no de cada ion en particular.
Consideraremos por el momenta soluciones de sales de solamente dos iones. El
potencial quimico total del electrolito sera

(11.6)
donde 17+ Y 17- son los coeficientes estequiometricos. Podemos defiinir el potencial
quimico media como

(II. 7)
donde 17 = 17+ + 17-· Combinando las ecuaciones 11.7 y 11.2 llegamos directamente a
la actividad media

(II.8)
II. Soluciones 57

De la misma forma obtenemos los coeficientes de actividad media

(11.9)

Es claro que la actividad media no nos refleja el hecho de que en muchos pro-
blemas biologicos existe especificidad. Por ejemplo, la funcion nerviosa depende de
las actividades (concentraciones) de [K+] y [Na+] en tanto que no depende de la
actividad del anion.
Por esta razon es frecuente ver referencias a la concentracion "libre" de iones 0
"efectiva" mas que ala concentracion total 0 la actividad media de la sal.
Es posible en principio medir la actividad individual de iones mediante electrodos
selectivamente sensibles a un ion en particular, como se hace con los protones. Estos
electrodos est an disponibles en el comercio para diferentes iones pero aun cuando
contemos con la selectividad completa, 10 que no es posible obtener, no nos libramos
del problema de la referencia.

11.1.1. Actividad individual de iones


La nocion de que la actividad es una concentraci6n efectiva sugiere que una
analogia formal de las ecuaciones (11.1) y (II. 2) puede extenderse a los electroli tos.
Esto nos lleva a aceptar la existencia de la actividad individual de los iones. Esta
idea es rechazada por muchos fisicoquimicos (ver ref. [1]), insistiendo que dado que
la solucion siempre consta de iones de diferente carga para mantener la neutralidad
10 relevante es la actividad de la sal y no de los iones individuales. Sin embargo se
acepta como un procedimiento teorico para permitir realizar ciertos calculos.
El hecho experimental de que ciertas reacciones, en particular de interes biologico,
dependen de la concentracion disponible para la reaccion de algunos iones indivi-
duales nos lleva a tomar la idea de la actividad individual de iones como algo mas
que un artificio teorico.
Debemos notar que la medici on del pH no es ni mas ni menos que la medici on de
la actividad individual de los prot ones presentes en la solucion. Uno de los problemas
cruciales de la actividad individual es, como resulta evidente de la medici on del pH,
la eleccion del est ado de referencia. El problema se resuelve si se adopta un est ado
de referencia fijo, tal como ha sido establecido para el pH.
Si es la actividad, y no la concentracion, la que determina la reactividad, es
evidente que describir los experiment os en terminos de actividad en lugar de con-
centracion resulta importante.
Es posible, como mostraremos a continuacion, obtener estimaciones confiables
de la actividad individual de iones de manera de analizar nuestros experiment os
apropiadamente.
58 Temas de Biofisicoqufmica

Determinacion experimental de la actividad

Existen varias tecnicas experiment ales para medir la actividad (0 los coeficientes
de actividad) de soluciones, incluidas las sales, tales como la presion osmotica, la
presion de vapor y la fuerza electromotriz (fern) de pilas. Todas estas propiedades
dependen del potencial quimico de la solucion y, en consecuencia, permiten calcular
los coeficientes de actividad.

Electrodos selectivos

Los electrodos selectivos contienen membranas de intercambio que seleccionan


el ion deseado, el cual produce una diferencia de potencial. El circuito se cierra
con otro electrodo, el electrodo de referencia estandar, usualmente un electrodo de
calomel. Tambien se produce un potencial de juntura en el electrodo de referencia.
El potencial medido se expresa como

(11.10)

donde E j es el potencial de juntura, F la constante de Faraday, ZA la carga Y aA la


actividad del ion A.
En presencia de un ion B que se encuentra en la solucion con una actividad aB,
se produce una interferencia y el potencial se torna

(11.11 )

donde KAB es la constante de asociacion del ion B con la membrana, la cual depende
de cuan select iva es la membrana al ion A en presencia de B.
Incluso si tuvieramos una selectividad perfecta tendriamos siempre presente el
potencial de juntura. Este potencial depende incluso de la forma de la juntura y la
agitacion de la interfase inmediata a la misma. Este valor tiene una incerteza del
orden de 5mV. La calibracion con soluciones del ion investigado son titiles en tanto
conozcamos la actividad de ese ion en las soluciones de calibracion, 10 que dudosa-
mente ocurra. La calibracion no sera buena cuando la diferencia en concentraciones
y composicion ionica de la solucion problema sea muy diferente de la del patron.
La dependencia funcional del potencial con la actividad nos indica que un error
de 5mV, por ejemplo, no es grave para actividades muy pequeiias (para las cuales
la aproximacion a ~ x puede ser aceptable) pero puede llegar a dar errores del
orden del 50 % a actividades medianamente altas. En la figura 11.1 podemos ver esta
dependencia donde se ha indicado en lineas de punta el rango de variacion para un
valor de E j de ±5 mY.
II. Soluciones 59

ElmV

-136

:+-A---+:
, '
, '
-200 '-'--'-'------'--_----"''--_ _'L-_ _--'-_ __
0,001 0,021 0,041 0,061 0,081
Actividad

Figura 11.1: Fuerza electromotriz generada en una pila con un electro do selectivo en funci6n
de la actividad i6nica. La linea llena corresponde al valor con E j = 0 y las line as de puntos
al result ado con E j ± SmV. Se han seiialado dos valores de E y su correspondiene error (~)
debido a los errores en el potencial de juntura. El error aumenta abruptamente con E.

Dadas las dificultades de medir con precision la actividad, podemos preguntarnos


si una teoria aceptable nos puede dar un valor estimativo aceptable a partir de
dJculos.

La teorla de la actividad ionica


Cuando un electrolito fuerte, como el NaCl, se disuelve en agua, cada ion indi-
vidual se rodea de agua. Las propiedades de los diferentes iones dependen de las
interacciones ion-ion e ion-solvente.
Para poder atacar este problema debemos utilizar modelos simples que tengan
en cuenta las interacciones mas importantes. El modelo mas simple y exitoso este
sentido es el de Debye y Huckel, que trata el solvente como un continuo de constante
dielectrica (permitividad) E.
En esta aproximacion los iones son tratados como particulas puntuales.
Se consider a que cada uno de esos iones puntuales esta rode ado de una nube
ionica que cancela exactamente su carga. 3 La figura 11.2 muestra un esquema que
represent a el caso.
El potencial entre dos iones es:

(11.12)
donde e es la carga del electron, Zi i Zj son los numeros de carga de los iones i y j,
rijla distancia ion - ion y c la permitividad electrica.

3S egun el enfoque que se utilice esta suposici6n puede ser una consecuencia. Hemos adoptado
una forma simple de presentar el problema.
60 Temas de Biofisicoqufmica

Figura II.2: Representaci6n esquematica de un electrolito. N6tese que cada ion esta rode ado
por un grupo de iones de carga opuesta.

Observemos la figura (Fig. 11.2). Debido a la naturaleza de largo alcance de las


fuerzas Coulombianas debe existir neutralidad local, 10 que significa que cada ion
debe estar rode ado de cargas de signo opuesto cuyo valor total debe ser igual a
su propia carga. Esto ocurre porque cada ion "comparte" su carga con varios iones,
como puede verse en la figura. Esta situacion se produce incluso en iones no-esfericos
y alrededor de cargas en grandes estructuras, como en las macromoleculas.
Nuestro objetivo es poder calcular las propiedades termodinamicas en equilibrio
y fuera del equilibrio. En el caso mas simple de un ion esferico queremos obtener la
energ{a de carga del sistema (es decir, la energia necesaria para pasar de un sistema
sin cargas a un sistema en el cual tanto el ion central como su "nube" est en cargados).
Esto se puede representar como la energia de carga de un condensador de un radio
dado, el condensador equivalente. La energia total se calcula adicionando carga al
condensador esferico. El problema resulta basicamente igual a calcular el radio del
condensador.

a) b)

Figura II.3: Dos representaciones de la distribuci6n de contra-iones en una soluci6n elec-


trolitica: (a) un ion central y su nube de contra-iones y (b) un condensador esferico equiva-
lente.
II. Soluciones 61

La solucion clasica del problema es la dada por Debye y Huckel (DH) que re-
solvieron la ecuacion de Poisson con la aproximacion importante de que la concen-
tracion de los contra-iones es proporcional a la energia de interaccion con el ion
central. Lo importante de este resultado es que la distribucion ionica es funcion de
un solo parametro, la longitud inversa de Debye k

(11.13)
donde c es la permitividad electrica, T la temperatura absoluta, R la constante
universal de los gases ella Juerza ionica, es decir,

(11.14)

donde Ci es la concentracion de la iesima especie ionica expresada en moles por litro.


En la teoria de DH todos los parametros termodinamicos se pueden expresar en
terminos de K,. 4
Pese a que la teoria de D-H solamente es valida para soluciones extremadamente
diluidas (c < 0,001 mol/I), aun es una teoria muy popular ya que es simple y
explicita. Solo recientemente han aparecido teorias similares en simplicidad y que
permiten ir a concentraciones altas.
El error mas serio de la teoria de DH es que no tiene en cuenta el tamaiio ionico.
Con esta aproximacion vemos que todos los iones de igual carga tienen exactamente
las mismas propiedades. Es claro que para muchisimas aplicaciones esta resulta
ser una aproximacion muy grosera, como ocurre en problemas biologicos donde las
diferencias entre N a + y K+, por ejemplo, son notables. Dentro del campo de la
biologia es tambien inaceptable considerar soluciones tan diluidas como 10 requiere
la aproximacion citada. Una solucion biologic a tiene tipicamente una concentracion
del orden de 0.150 mol/I, concentracion en la que la teoria de DH predice funciones
termodinamicas extremadamente grandes cuando se la compara con los resultados
experimentales.

La aproximacion esferica media (AEM)


La necesidad de contar con una teoria simple y confiable para electrolitos ha
llevado a muchos investigadores a trabajar sobre el tema. Actualmente disponemos
de la llamada aproximacion esferica media (AEM) que resulta ser una muy buena
extension de la teoria de DH donde se toma en cuenta el tamaiio ionico. Se trata
de la solucion de la misma ecuacion que llevo a Debye y Huckel a sus resultados (la

4La ecuaci6n II.13 es la apropiada en el 81, donde K, se expresa en m- 1 . Frecuentemente la


encontramos en el sistema cgs (con K, en cm- 1 ) como: K, = (81fe 2 /lOOOcRT) 1/2 11/2.
62 Temas de Biofisicoqufmica

ecuacion de Poisson-Boltzmann debidamente linealizada) pero aplicada no a cargas


puntuales sino a una mezcla de esferas rigidas cargadas. El modelo de esferas rigi-
das cargadas, Ham ado modelo primitivo, no represent a evidentemente la interaccion
ionica exactamente, pero esta aproximacion represent a un avance importante sobre
los resultados de DR.
En la AEM aparece un panimetro 2r que toma ellugar de K" y represent a tambien
una longitud reciproca [2]. Las formulas que expresan las propiedades termodinami-
cas guard an la misma forma que en DR con el reemplazo de K, por 2r mas terminos
adicionales. Un resultado interesante es que la equivalencia con un condensador
esferico, que brinda el resultado exacto, vale tambien para otras geometrias.
El parametro K, depende solamente de las cargas ionicas y de la concentracion,
en tanto que 2r depende tambien del diametro de los iones intervinientes. Esto
permite diferenciar la calidad de los iones segun su tamaiio, aun cuando tengan la
misma carga. Vemos que la Juerza i6nica -que depende de cargas y concentraciones-
no tiene toda la informacion necesaria. Su utilizacion en problemas biologicos debe
tomarse con cautela.
Contrariamente a la teoria de DR el parametro caracteristico no se puede calcular
con una formula simple. Sin embargo, es posible obtenerlo mediante una ecuacion
que se resuelve facilmente, en forma iterativa, aun con una calculadora de mano. r
se obtiene de:

(11.15)

donde Ci es la concentracion del ion i, Zi la carga y (Ji el diametro. 5


En la seccion 11.1.1 consider amos las actividades individuales de los iones. Median-
te la AEM se puede calcular con facilidad este parametro para diferentes soluciones
de sales 0 mezcla de sales. La contribucion electrostatica de la actividad individual
de iones de una solucion se calcula mediante

(11.16)

El diametro ionico (J puede tomarse de los datos cristalograficos (diametros de


Pauling), 10 que da resultados razonables [3], sin embargo hay otros aspectos que
considerar. El diametro de los iones que se introduce en la teoria no solamente debe
considerar el volumen excluido generado por el propio ion sino que tiene que tener en
cuenta el agua de hidratacion (que estudiamos en la seccion 11.2), la cual no tiene las

5Ya que r aparece en los dos terminos de la expresi6n debe resolverse iterativamente.
II. Soluciones 63

Cuadra 11.1: Panimetros obtenidos para los diametros de algunos iones en la AEM [de Triolo,
Grigera y Blum J.Phys.Chem. 86: 1030-1032 (1982)].

Ion I (Jd.A I adAA 3

Na+ 3,053 -26,310


Ca++ 5,386 -26,828
Mg++ 5,723 -20,736
Cl- 3,600 0,000

mismas propiedades del agua libre. Podemos considerar que el diametro de la teoria
es en realidad un diametro efectivo. Existe la alternativa de tomar el diametro ionico
como una variable ajustable pero, dado que el tamaiio de la esfera de hidratacion
ionica depende de la concentracion de los iones es mejor considerar la dependencia
del diametro efectivo con la concentracion [4]. En ese caso consider amos el diametro
como

(11.17)

donde (Ji es el diametro efectivo, Ci la concentracion total y (J? Y ai parametros de


ajuste.
Un resultado excelente se obtiene ajustando los parametros con los datos del
coeficiente osmotico de sales simples, de los que hay muy buenos experimentos, la
tabla 11.1 muestra valores obtenidos mediante ese procedimiento para algunos iones
de nuestro interes. Posteriormente est os diametros se pueden utilizar para calcular
otras propiedades termodinamicas no solamente de soluciones de sales simples sino
de mezclas, 10 que resulta de sumo interes.
La tabla 11.2 muestra los valores calculados de la actividad media de una mezcla
(CaCb y NaCl) para diferentes composiciones de la misma, comparados con datos
experimentales. Se observa un muy buen acuerdo. Estos valores de actividad media
se calculan a partir de las actividades individuales. En realidad son las actividades
individuales las que nos interesan.
En la tabla 11.3 podemos ver los valores de los coeficientes de actividades in-
dividuales de Ca++ en soluciones donde encontramos NaCl y Ca++Cb. A concen-
traciones del orden de las fisiologicas (150 mM NaCl) vemos que para 150 mM de
Na+ y 5 mM of Ca++el coeficiente de actividad individual del Ca++ es 0,205. Esto
significa que la actividad de Ca++ es de alrededor de 1 mM.
64 Temas de Biofisicoqufmica

Cuadra II.2: Coeficiente de actividad media de una mezcla de NaCl-CaCb en el rango de


interes fisio16gico. En la primer a columna ml indica la concentraci6n molar de N aCl y m2 la
concentraci6n molar de CaCb. En el cuerpo de la tabla la fila superior muestra los valores
calculados de la actividad media con la AEM y la fila inferior el valor experimental obtenido
por Butler [Biophysical J. 8: 1426-1433 (1968)].

ml 1m2 0.001 0.005 0.03 0.05


0.05 0.664 0.645 0.571 0.538
0.645 0.628 0.562 0.538
0.15 0.553 0.546 0.514 0.495
0.540 0.535 0.516 0.504
0.20 0.524 0.519 0.495 0.480
0.520 0.517 0.500 0.490

Cuadra II.3: Coeficiente de actividad individual de Ca++ en una mezcla de NaCl-CaCb.


La linea superior nos indica la concentraci6n molar de CaCb y la primer columna la con-
centraci6n molar de N aCl. El valor para la condici6n fisio16gica esta resaltado -tornado de
Vericat y Grigera J.Phys. Chem. 86: 1030-1032 (1982).

ml m2 0.001 0.002 0.003 0.005 0.010 0.020 0.030 0.050


0.130 0.304 0.301 0.298 0.293 0.280 0.259 0.241 0.213
0.140 0.294 0.292 0.289 0.284 0.273 0.253 0.236 0.209
0.150 0.285 0.283 0.281 0.276 0.265 0.247 0.231 0.205
0.160 0.277 0.275 0.273 0.268 0.258 0.241 0.226 0.201
0.170 0.270 0.268 0.265 0.261 0.252 0.235 0.221 0.198
II. Soluciones 65

La importancia biol6gica

El resultado anterior es muy ilustrativo. El concepto de la actividad como "con-


centracion efectiva" nos sirve para ver la importancia de conocer con seguridad la
solucion con la que est amos trabajando.
Un experimento tipico en enzimologia es el estudio del efecto de iones en la
actividad enzimatca 6 mediante el procedimiento de mantener fija la concentracion
de un ion y variar la de otro. Una vez obtenido el valor optimo para el primero,
la concentracion de este se mantiene fija y se varia el otro. Lamentablemente este
procedimiento casi rutinario no nos lleva al resultado real. 7 La variacion de la con-
centracion de un solo ion cambia la actividad de todos los otros presentes en la
solucion. Puesto que la actividad de la enzima sera sensible a la concentracion "efec-
tiva" del ion bajo estudio, el experimento no sera de mucha utilidad, y aun mas, nos
puede llevar a una interpretacion erronea.
La figura 11.4 muestra una curva de actividad de la ATPasa gastrica estimulada
por potasio (H,K-ATPasa) que describe el mencionado caso. Observamos que el au-
mento de la concentracion de potasio hace crecer la actividad enzimatica hast a un
cierto valor, luego del cualla misma disminuye. En la figura 11.4 se represent a la ac-
tividad enzimatica a la presunta actividad optima de magnesio constante ([Mg++]=2
mM/l) en funcion de la concentracion de potasio. Podemos preguntarnos l.el decrec-
imiento de la actividad del magnesio debido al incremento de la concentracion de
potasio es 10 que baja la actividad enzimatica? 0, por el contrario, l.existe un mecan-
ismo de accion por el cual se produce un efecto competitivo entre Mg++ y K+ por el
sitio de union? Si no conocieramos el efecto de interaccion entre los iones deberiamos
considerar sin mas la segunda opcion. La respuesta real es efectuar el experimento
a actividad constante de Mg++.
Es evidente que para poder realizar el experimento apropiadamente debemos
considerar no las concentraciones de los iones sino su actividad, cosa que es posible
calcular con una aproximacion razonable.

11.2. Hidrataci6n i6nica


En una solucion de moderada concentracion, la interaccion entre los iones (el
soluto) y el agua (el solvent e) es una interaccion de largo alcance. Esto significa que
no solamente est an involucradas las moleculas de agua en la vecindad del ion sino

6No debemos confundir la actividad enzimatica con la actividad i6nica.

7Toda persona con conocimientos de diseno de experiment os objetaria el procedimiento si no se ha


demostrado previamente que ambas variables (concentraciones de cada ion) no son independientes,
es decir, no hay interacci6n entre ellas.
66 Temas de Biofisicoqufmica

ffi 500
ctl';"
Il. c
!;;: ·E
Q)';"
""0 OJ
""0 E
ctl-
""0 0
.s: E
:;:::; c
~-
100 J'
0,5 2 5 10 20 100
[Kf I mM

Figura II.4: Dependencia de la actividad enzimatica de la ATPasa gastric a estimulada por


potasio con la concentraci6n de K+ a [Mg++] constante (resultados de referencia [5]

que tambien participa gran parte del resto del solvente. A efectos de comenzar el
estudio consideremos, provisoriamente, solamente las moleculas de agua que rode an
al ion.

11.2.1. La esfera de hidratacion


Cada ion interactua fuertemente con las moleculas de agua vecinas al ion, de-
nominada la esfera de hidratacion 0 co-esfera. 8
Las orientacion de las moleculas de agua en esta co-esfera de hidratacion esta de-
terminada fuertemente por la carga electrica del ion, formando 10 que llamamos
esfera de hidrataci6n primaria. Otras moleculas de agua que subsecuentemente se
incorporaran, debido a su mayor distancia, poseen una orientacion no tan definida
como las de la primer a esfera. Si consider amos solamente dos esferas de hidratacion
vemos que mientras que la estructura de la primer a esta determinada por las carac-
teristicas del ion, la segunda deb era hacer de transicion entre la primer esfera y el
seno delliquido. En este proceso pueden existir varios puentes de hidrogeno consid-
erablemente distorsionados entre las moleculas de agua. En consecuencia, y depen-
diendo del tamaiio y carga del ion, la segunda esfera puede llegar a ser altamente
desordenada segun que en esa transicion ambas estructuras puedan compatibilizarse
facilmente 0 a costa de un alto des orden propio.
La interaccion entre dos iones de carga opuesta esta mediada por el agua circun-
dante. En la figura II.5 vemos dos iones separados con su co-esfera de hidratacion,
dos iones en "contacto", donde este contacto se efectua a traves de las moleculas
de agua pertenecientes a la primer a esfera de hidratacion y, finalmente, dos iones
en contacto directo. El segundo 0 tercer caso dependera de la rigidez de la primer a

8Recibe frecuentemente el nombre de la co-esfem de Gurney.


II. Soluciones 67

a) b) c)

Figura II.5: Tres casos de interacci6n ion-ion: (a) Las esferas de hidrataci6n no interactuan,
(b) La proximidad de los iones hacen que parte de las esferas de hidrataci6n se superpon-
gan permaneciendo los iones separados por algunas moleculas de agua y (c) Los iones se
encuentran en contacto.

esfera de hidratacion y el costa energetico entre establecer un contacto mediado por


agua 0 "despojarse" de parte de la segunda esfera de hidratacion. Notese que en los
dos ultimos casos al entrar en contacto parte del agua de hidratacion pas a al seno
delliquido. Esta transferencia es favorable entropicamente al moverse esas moleculas
de agua desde un est ado de movilidad restringida a uno de mayor movilidad.

Numeros de hidratacion

Una forma simple de considerar el grado de hidratacion, aunque muy aproximada,


es el establecer cwintas moleculas de agua se encuentran involucradas en la primer a
esfera (0 capa) de hidratacion. Es claro que este numero depended, de la definicion
de esta capa.
Hay casos en los cuales la fijacion del agua a los iones es suficientemente fuerte
como para determinar claramente cuaJ es la geometria de esa esfera, tal el caso
del Cu++(H2 0), frente a situaciones como la del Na+ 0 del K+, cuya geometria
esta mucho menos definida, poseyendo una esfera de hidratacion de mayor movilidad.
El numero de hidratacion que obtengamos va a depender del criterio particu-
lar de su determinacion. De la misma manera estadistica que consider amos cuando
hablamos de la estructura delliquido -el tiempo de vida de los cumulos (clusters)
y las funciones de distribucion radial- podemos obtener los numeros de hidratacion
como medida del promedio de moleculas de agua que rodean al ion; 10 que estara aso-
ciado a un tiempo de resolucion especifico ligado a la escala de tiempo experimental.
La estabilidad de la esfera sera ciertamente de corta duracion y su valor dependera de
la propiedad que utilicemos para determinarla.
Como ejemplo veamos los valores informados en la literatura para el numero de
hidratacion del N a+. Encontramos valores tales como 71; 66; 44,5; 16,9; 16,2; 6,7;
4,5; 4; 2,5; 2, 1. 9 No debe pensarse que se trata de experiment os mal desarrollados
sino que las escalas de tiempo experiment ales son diversas.

9Citado por Samoilov en [6] referencias 121-131.


68 Temas de Biofisicoqufmica

Cuadra II.4: Valores minimos de los mimeros de hidrataci6n para algunos iones positivos.

Ion n Ion n
6 Mg++ 14
4 Ba++ 14
4 La+++ 22

Para las diferentes situaciones experiment ales es posible definir un radio efectivo
de los iones. La situacion se puede ver con claridad para experiment os hidrodinami-
cos. El comportamiento de las particulas en el fluido depende del radio de las mismas;
de los resultados experiment ales podemos calcular cual seria el radio de particulas
con las mismas propiedades hidrodinamicas que la solucion en estudio, esto define
el radio efectivo. Es evidente que un ion que es capaz de retener moleculas de agua
a su alrededor actua como si tuviera un radio mayor que el que posee en ausencia
de hidratacion.
Pese a las dificultades de definicion, y manteniendonos dentro de una cierta escala
de tiempo, el numero de hidratacion obtenido como result ado de mas de una tecnica
experimental puede darnos una idea sobre el est ado de hidratacion. En la Tabla 11.4
se muestran los numeros de hidratacion mas utilizados para unos pocos iones. Estos
numeros no son, obviamente, unicos, sino que se trata de valores que se mencionan
corrientemente y, dado que todos se refieren a un mismo criterio, sirven a efectos de
comparacion entre los iones citados.
Otro efecto a notar es que cuando aumenta la concentracion de sales en una
solucion la actividad del agua disminuye, y con ella la disponibilidad de agua para
cada ion. Ademas de esta consideracion, vemos que la alta concentracion de iones
produce un efecto de apantallamiento de cargas que disminuye la atraccion del agua y
tambien la interaccion mutua entre iones. Consecuentemente es claro que el numero
de hidratacion, cualquiera sea la definicion utilizada, disminuira con el aumento de
la concentracion.

11.2.2. Dinamica de la hidratacion


La hidratacion no solamente debe analizarse desde el punta de vista de su estruc-
tura sino que, para tener una vision apropiada del proceso, es importante considerar
su dinamica. La razon de la diversidad de numeros de hidratacion mencionados
se bas a precisamente en pretender una descripcion independiente del tiempo. No
debe pensarse que un soluto cuando se hidrata se asocia indefinidamente a un cierto
numero de moleculas de agua. Puede S1 establecerse un numero que describa un valor
II. Soluciones 69

medio en el tiempo. Samoilov [6] define un panimetro R como:

(11.18)

donde Ta es el tiempo promedio durante el cual una molecula de agua permanece


junto a otra molecula de agua en el seno delliquido y Ti es el tiempo promedio en
el cual una molecula de agua permanece junto al ion. Llamaremos a enos tiempo de
residencia.
Esto nos neva ados casos. En el primero consideremos que el tiempo de residencia
agua-ion es mayor que el correspondiente agua-agua.

por 10 tanto R>l. (11.19)

En este caso decimos que est amos en presencia de una hidrataci6n positiva, en
donde el ion restringe la movilidad de las moleculas de agua en su entorno. En el
segundo caso, que denominaremos hidrataci6n negativa, el ion, lejos de restringir el
movimiento, perturba el entorno aumentando la movilidad del agua en el entorno
ionico.

por 10 tanto R<l. (11.20)

Estos tiempos de residencia se pueden obtener mediante diferentes tecnicas ex-


perimentales, tales como relajacion dielectrica, resonancia magnetica nuclear (rmn),
laser de pulsos rapidos, y otras que veremos mas adelante. Otra tecnica interesante
para estudiar este fenomeno es la viscosidad.
La viscosidad relativa de una solucion estara relacionada con la friccion generada
en la misma. Cuando los iones poseen una esfera de hidratacion de gran rigidez la
friccion es mayor en relacion al caso opuesto y la viscosidad aumentara. Independien-
temente de nuestra capacidad para obtener los tiempos de residencia microscopicos
podemos ver claramente que los valores de la viscosidad de la solucion en relacion a la
viscosidad del solvente puro nos pueden aportar informacion valiosa de la dinamica
de la hidratacion.
La ecuacion de Jones-Dole (ver la ecuacion 11.25 en el recuadro) puede ser utiliza-
da para analizar las propiedades de hidratacion de iones. Puesto que el coeficiente
B esta relacionado con la interaccion soluto-solvente, distintos valores de B nos in-
dica las diversas caracteristicas de diferentes iones. La medici on de la viscosidad
de diferentes sales con iones comunes a diferentes concentraciones (suficientemente
bajas para asegurar la validez de la ecuacion 11.25) nos permite obtener el valor del
coeficiente B para diversos iones. Cuanto mas alto es el coeficiente B mayor sera la
interaccion ion-solvente. Valores positivos de B nos indican hidratacion positiva en
70 Temas de Biofisicoqufmica

tanto que valores negativos de B se refieren a hidratacion negativa. En la tabla II.5


se pueden observar los valores de B para algunos iones.

Cuadra II.5: Valores del coeficiente B de la ecuacion de Jones-Dole para algunos iones.

Li+ Na+ K+ Rb+ Cs+ Ba+


0,149 0,086 -0,007 -0,03 0.005 0,22

Mg++ Cl- Br- r- N0 3 80 4-


0,585 -0,007 -0,042 -0,068 -0,046 -0,209

Viscosidad
La viscosidad, cuya determinacion precis a es mas laboriosa de 10 que se puede pensar
a la ligera, nos aporta muy buena informacion para el caso de las soluciones.
Debemos distinguir entre la viscosidad reZativa 7]r
7]
7]r = -, (II.21 )
7]0

donde 7] es la viscosidad de la solucion Y 7]0 la del sol vente puro, la viscosidad especifica
7]esp

7] - 7]0 7]
7]esp = - - - = - - 1, (II.22)
7]0 7]0

y la viscosidad intrinseca [7]]

· 7]esp
[7]] Zzmc--+o-- (II.23)
c

(II.24)

La viscosidad de una solucion depende, obviamente, de la concentracion de la misma.


Esta dependencia puede expresarse como una serie de potencias de la raiz cuadrada
de la concentracion. De esta manera es posible expresar la viscosidad relativa como:

7]r -- -7] -_ 1 + A c 1/2 + B c + ... (11.25)


7]0

donde el coeficiente A esta relacionado con la interaccion soluto-soluto y B con la


interaccion soluto-solvente. Esta ecuacion se la denomina Ecuaci6n de lones-DoZe.

La relacion de B con la entropia unitaria de los iones en la solucion nos muestra


que efectivamente el valor de B puede asociarse a la interaccion ion-agua y que los
II. Soluciones 71

~s

40
30
20

0
-10
-20
-30

-0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4

Figura II.6: Entropia unit aria de iones en funci6n del coeficiente B. Se observa un compor-
tamiento lineal para diferentes familias de iones.

valores negativos de ese panimetro corresponden a una est ado mas libre del agua
que en el caso de valores positivos. La figura 11.6 muestra la relacion entre ambos
parametros.

La temperatura "estructural"

El efecto de la perturbacion de las caracteristicas del agua en solucion puede


analizarse mediante el estudio de alguna propiedad de la solucion en relacion con la
misma propiedad del agua pura a diferentes temperaturas.
Se ha definido la temperatura estructural como la temperatura en la que el agua
pura posee la misma propiedad que la solucion a 25°C. Esta es una definicion bas-
tante defectuosa, ya que deberiamos exigir que se trate de una propiedad estructural.
El concepto se ha generalizado de manera que se acepta la definicion para un cierto
numero de propiedades que no aport an informacion de la estructura. Tal es el caso
de la viscosidad.
Si medimos la viscosidad relativa de la solucion a 25°C. y luego buscamos en
las tablas de viscosidad del agua en funcion de la temperatura, obtendremos la
temperatura estructural. Es decir que la temperatura estructural de la soluci6n
sera la temperatura a la cual el agua posee la misma viscosidad que la solucion.
Es claro que esta temperatura no nos da informacion de la estructura del agua,
por 10 que no es muy propio hablar de temperatura estructural, sin embargo nos da
informacion dinamica de la hidratacion ya que, como mencionamos mas arriba, el
tiempo de residencia del agua alrededor de los iones determinara el coeficiente de
friccion y, consecuentemente, alterara la viscosidad.
Podemos utilizar la informacion de la temperatura estructural para clasificar la
72 Temas de Biofisicoqufmica

hidratacion. Cuando la temperatura estructural es menor de 25C estaremos en un


caso de hidrataci6n positiva, ya que la presencia de los iones han producido un au-
mento de la viscosidad a un valor que se puede obtener en agua pura solamente
reduciendo la temperatura. En el caso opuesto, es decir que al temperatura estruc-
tural es mayor de 25C estaremos en presencia de hidrataci6n negativa.
Esta misma idea se puede utilizar para analizar el corrimiento de lineas en el
infrarrojo, ensanchamiento de bandas de rmn, etc.
Dado que el coeficiente B responde a la interaccion ion-agua, para el caso que
nos interesa, se puede utilizar para caracterizar las propiedades de dicha interaccion
con referencia a la dinamica de hidratacion en terminos de hidratacion positiva y
negativa.
Debe tenerse en cuenta que toda solucion salina contiene ambos iones, por 10
que asignar propiedades a una sola de las componentes ionicas con una medicion,
requiere el estudio de varias sales con iones comunes a efectos de separar los efectos
del co-ion asociado.
Dos iones de relevancia biologic a son el N a+ y el K+, por 10 que resulta intere-
sante comparar los coeficientes B correspondientes. Se observa que dicho coeficiente
es positivo para el ion sodio y negativo para el ion potasio. Lo que nos indica el
caracter de la hidratacion que sera positiva para el primero y negativa para el se-
gundo. No obstante debe tenerse presente que ambos poseen valores cercanos.

11.2.3. lones "promotores" y "destructores" de estructura

Ya mencionamos que la segunda esfera de hidratacion posee una estructura que


responde a la transicion entre la estructura de la esfera primaria de hidratacion y el
seno del liquido, y que la primer a capa estara condicionada por las propiedades del
ion, especialmente su carga y tamaiio.
Esto nos lleva a que el efecto en favor 0 en contra del ordenamiento del agua
en su totalidad dependera del balance orden-des orden entre las diferentes esferas de
hidratacion (tengamos en cuenta que la division en dos 0 tres capas de hidratacion
es una aproximacion ya que ciertamente hay un continuo en la variacion de las
interacciones agua-ion). Este balance en terminos dinamicos es 10 que se refleja en
los parametros que definen hidratacion positiva y negativa, pero tambien existen
fenomenos estructurales. Existen algunos experiment os que brindan datos sobre la
posible estructura de hidratacion, como la difraccion de rayos x, as! como simulacion
computacional.
Es frecuente encontrar en la literatura definiciones diferentes para "formacion"
y "destruccion" de estructura por parte de los iones. En este punta nos debemos
preguntar sobre que estructura est amos hablando: l,la estructura regular del agua
o la estructura propia de hidratacion de los iones? En uno u otro caso tendremos
II. Soluciones 73

Cuadra II.6: Valores de las masas atomicas, radios cristalognificos y radios hidrodinamicos
de algunos iones.

Ion I mas a atomica I rc/ A I rh/ A


Li+ 6,941 0,6 3,83
Na+ 22,989 0,95 3,65
K+ 39,098 1,33 3,48
Mg++ 24,305 0,65 4,39
Ba++ 136,327 1,35 4,00
C- 34,453 1,81 3,46

algunos iones que pasan de ser formadores a destructores 0 viceversa.

Radios ionicos. Radios cristalograficos y de hidratacion

Los radios ionicos se pueden obtener a traves de resultados de difraccion de


rayos X en crist ales de sales. Cuando se analizan propiedades de transporte en solu-
cion acuosa los radios cristalograficos no son compatibles con el comportamiento
de la solucion. Esto se debe a la hidratacion y es necesario considerar los radios
hidrodinamicos que tienen en cuenta la esfera de hidratacion asociada al transporte
de cada ion. Como ya hemos dicho, el numero de hidratacion depende fuertemente
de la metodologia experimental utilizada para determinarlo.
La tabla 11.6 muestra la mas a atomica, el radio cristalografico (r c) Y el radio
hidrodinamico rh obtenido a traves de la conductividad equivalente lO de algunos
iones.
Si com par amos los radios cristalograficos (del ion "desnudo") con los radios
hidratados, podemos ver que el orden de tamaiio entre los iones no se corresponde
cuando los ordenamos con uno u otro caso. Ese radio hidratado es en realidad un
radio equivalente. El radio (0 diametro) equivalente nos refiere a una esfera tal que
posea las mismas propiedades de transporte que el ion estudiado.
Es interesante comparar los valores de los radios hidratados con los radios equiva-
lentes obtenidos mediante otras tecnicas. En la AEM (§IL17) se utilizan diametros
equivalentes (ej, tabla 11.1) que, si bien el procedimeinto para obtenerlos es total-
mente diferente, tienen en cuenta, entre otros factores, la hidratacion. Podemos ver
alli (ecuacion 11.17) que cuando aumenta la concentracion el diametro equivalente se

lOLa conductividad equivalente es la capacidad de transporte de la corriente por un equivalente


de soluto.
74 Temas de Biofisicoqufmica

ve afectado. Esto se debe a que el apantallamiento de las cargas reduce la hidratacion


ionica.
La viscosidad se puede relacionar con el diametro de la particula que se mueve
en un fluido por la relacion propuesta por Einstein

177" = 1 + 2, 5¢ (11.26)

donde 177" es la viscosidad relativa (ecuacion 11.25) y ¢ es la fraccion de volumen de


soluto en la solucion.
Esta fraccion de volumen es la fraccion del volumen equivalente 0 volumen efectivo
del soluto, de donde conociendo la concentracion del mismo se puede calcular el
radio (0 diametro) equivalente. Si se trata de particulas esfericas y si el solvente no
se asocia con ellas, el radio equivalente sera igual al radio de la esfera. Este no es
nuestro caso y el radio efectivo tiene en cuenta que parte de las moleculas de agua
se mueven con el soluto.
El estudio de la difusion de particulas en un fluido permite relacionar el radio
equivalente (efectivo) con el coeficiente de difusion a traves de la relacion, tambien
debida a Einstein,

D= RT_l_ (11.27)
N 67r17r'
donde R es la constante de los gases, T la temperatura absoluta, 17 el coeficiente de
viscosidad de la solucion y r el radio equivalente.

11.2.4. La estructura de hidratacion


La interaccion electrostatica depende de la inversa de la distancia al centro de la
carga. Un ion pequeno ejercera una atraccion 0 repulsion mayor que uno grande de
su misma carga. Es asi que uno espera que el Li+, por ejemplo, posea una esfera de
hidratacion mas rigidamente unida al ion que en el caso del K+.
Los detalles experiment ales son muy complejos porque, adem as de tener que op-
erar sobre soluciones en las cuales sus componentes no tienen posiciones fijas en
el espacio, la presencia de multiples tipos de iones demandan tantos experiment os
independientes como variables tengamos (la regIa es la misma que la del numero
de ecuaciones y de incognitas que debemos tener para la resolucion de un sistema
de ecuaciones). Para una solucion de MgCb se requeririan 11 experiment os inde-
pendientes para considerar todas las interacciones, incluida la del agua. Si tomamos
soluciones muy diluidas, donde se puede suponer que cada ion interacciona solamente
con el agua, tendriamos que efectuar cuatro experiment os diferentes. En este caso la
situacion es mas favorable y se puede lograr mediante reemplazos isotopicos a efectos
II. Soluciones 75

de realizar los diferentes experiment os requeridos. La simulacion computacional es


de gran auxilio para la interpretacion de los experimentos.
La figura II. 7 muestra resultados de simulacion donde se present a la densidad de
agua alrededor de iones Lt, K+, Cl- e 1-. En dicha figura el centro de cada "crater"
esta ocupada por el ion y las lineas represent an la densidad del agua circundante.
Podemos ver como los tamaiios relativos de la co-esfera de hidratacion (cuyo radio
sera igual al radio del "crater" correspondiente) difiere para cada caso.

cr

K'

Figura II.7: Distribuci6n de agua alrededor de Li +, K+, Cl- y 1- de acuerdo con simulaciones
de dinamica molecular [de K. Heinzinger, in Water: Biomolecule Interactions, edit ado por
M. U. Palma and M. B. Palma-Vittorelli, Soc. Italiana di Fisica, Bologna, (1993)].

11.3. La serie liotr6pica

En 1888 Hofmeister [7] analizo el hecho de que ciertas sales aumentan la solu-
bilidad de las proteinas globulares y otras producen la precipitacion de las mismas.
En base a la concentracion de cada sal para producir la precipitacion establecio la
Hamada serie liotropica. La secuencia de sales en orden decreciente de su efecto
precipitante resulta:

(precip.) Li 2S0 4, Na2S04, K 2HP0 4 > (NH4)2S04 > MgS04


>KCH3 COO, NaCH 3 COO>NaCl>NaN0 3 (solub.)

En base a est os datos (y otros adicionales) es posible ordenar los iones individuales
por su acion en la precipitacion de proteinas solubles. El resultado de las series
resultantes para aniones y cationes es :
76 Temas de Biofisicoqufmica

para aniones

para cationes

La explicacion del efecto de los iones sobre las proteinas no es completamente


convincente pero se sabe que dicho efecto depende de la carga, del diametro ionico,
la interaccion especifica de los diferentes iones sobre el agua y la polarizabilidad
ionica. Si bien aun esta pendiente la explicacion detallada del fenomeno, desde el
punta de vista practico el conocimiento de la existencia de la serie liotropica es de
mucha importancia.

11.4. Sustancias hidrofflicas


Consideremos ahora sustancias que no tienen carga neta pero que no obstante
tienen afinidad por el agua, recibiendo, por 10 tanto, la denominacion de hidrofilicas.
La mayoria de las sustancias que tienen la capacidad de formar puentes de hidrogeno
caen dentro de la categoria. Una molecula que posee muchos sitios formadores de
puentes de hidrogeno resulta similar a los iones en cuanto a la avidez de agua, sin
embargo existen grandes diferencias. Las energias puestas en juego son menores en
comparacion con la de los iones. Las interacciones agua-sitio a traves de puentes de
hidrogeno son energeticamente del mismo orden de magnitud que las interacciones
agua-agua.
Por una parte vemos que el concepto de "esfera de hidratacion" debe cambiarse
por el de "sitios de hidratacion" . Por otra, la distribucion de esos sitios en la super-
ficie no tiene por que ser uniforme. De hecho esa distribucion es de gran importancia
en cuanto a la estabilidad de la hidratacion en su conjunto.
El estudio detallado de la hidratacion no es simple de llevar a cabo y tal vez
los mono-sacaridos sean los que han sido estudiados con mas detalle. Ademas de
su importancia biologica,l1 son un modelo muy interesante para el estudio de la
hidratacion de macromoleculas.
En una primer a aproximacion, y puesto que la energia de los puentes de hidrogeno
agua-agua y agua-azucar son similares, la probabilidad de fijacion de agua a los

llSi bien tradicionalmente los sacaridos han sido considerados casi exclusivamente como fuente
de energia, la funci6n biol6gica como moleculas de reconocimiento molecular es una de las carac-
teristicas mas notables.
II. Soluciones 77

azucares deberia ser una cuestion de concentracion. Sin embargo, moleculas muy
semejantes quimicamente y con el mismo numero de sitios capaces de formar puentes
de hidrogeno pueden mostrar propiedades muy diferentes en agua. Por ejemplo, el
sorbitol y el manitol son esteroisomeros (pentitoles lineales) que difieren solamente
en la posicion de un grupo hidroxilo pero tienen un comportamiento en solucion
acuosa bien diferente.
Pese ala diferencia minima de ambos compuestos la solubilidad a 25°C en agua
del sorbitol es dos veces y media mayor que la del manitol. En solucion acuosa la
cadena del sorbitol adopta una conformacion flexionada en tanto que el manitol
posee una conformacion plana en zig-zag. Dada la similitud de los compuestos la
unica explicacion plausible es que la interaccion soluto-solvente es la que determina
la conformacion, la que depende del arreglo de los puentes de hidrogeno mas que
simplemente del numero de hidratacion [8].
Uno de los aspectos mas notables, y que nos permiten observar 10 relevante de
la hidratacion para las propiedades de la solucion molecular, es la diferencia en el
comportamiento de ambos azucares cuando se disuelven en agua 0 en sustancias
no-polares. En el segundo caso los dos muestran una conformacion plegada, en tan-
to que en agua la estructura extendida del manitol puede observarse tanto desde el
punta de vista experimental (ej. viscosidad) como mediante simulacion. Otro aspecto
interesante es la diferente solubilidad. Desde el punta de vista energetico y teniendo
ambos el mismo numero de puentes de hidrogeno para compartir con el agua resulta
inexplicable la diferencia observada. Sin embargo, los estudios de simulacion mues-
tran una movilidad notablemente mayor en el sorbitol cuando se 10 compara con el
manitol en solucion acuosa. Esta movilidad aport a una contribucion entropica a la
energia libre de solubilidad que explica el comportamiento experimental.
Otro ejemplo interesante es el de la glucosa. Existen dos anomeros de glucosa
(0: y (3), la ruptura y reformacion del enlace 05-Cl permite la rotacion del grupo
anomerico y, en consecuencia, la transformacion de uno en otro. En solventes no
acuosos el equilibrio es tal que el anomero 0: represent a aproximadamente el 45 %
del total (45 % en piridina y 44 % en dimetil sulfoxido). Esta fraccion es similar a la
que se encuentra a traves de los calculos semi-empiricos utilizando aproximaciones
cuanticas en vacio. En agua se observa experimentalmente que la fraccion de 0:
es del 37% (34% en D 2 0). Este ejemplo es otro caso donde vemos claramente la
influencia del medio en las propiedades moleculares. La configuracion de los enlaces
de hidrogeno son determinantes en este caso.
Mediante experiment os de resonancia magnetica nuclear (nmr) llevados a cabo en
diferentes azucares [8], se puede concluir que la molecula de glucosa posee un cierto
numero de sitios de hidratacion bien definidos. El numero de hidratacion depende
no solamente del numero de sitios de posible formaci on de puentes de hidrogeno sino
tambien de la orientacion espacial de los mismos. Para una concentracion alta de
78 Temas de Biofisicoqufmica

glucosa el numero de hidratacion es 3,7. La glucosa en la forma 0: tiene tres grupos


OR ecuatoriales y en la forma {3 cuatro. Suponiendo que los puentes de hidrogeno
en los grupos ecuatoriales son mas eficientes para ligar agua que los grupos en forma
axial, podemos considerar la presencia de cuatro de enos. El calculo del promedio
de puentes de hidrogeno con moleculas de agua (pesado con sus tiempos de vida) es
3,6.
Lo que resulta muy ilustrativo es que cuando los grupos OR se encuentran en
forma ecuatorial tienen una orientacion espacial compatible con la estructura regular
del agua. Por esta razon la glucosa tiene una hidratacion mas est able que otras
moleculas con estructura similar. La predominancia de la forma {3 en solucion acuosa
es producto de una mejor compatibilidad de su estructura de hidratacion con la
estructura del sol vente.
Estas observaciones se pueden extender a otros miembros de la familia de las
piranosas. Si comparamos la hidratacion de la {3-g1ucosa y la 0: y {3-talosa es posible
observar[9] que la orientacion de los grupos hidroxilo en el anillo determina las
propiedades de hidratacion.
I

Figura II.S: Hidratacion del eritrol de acuerdo a simulacion computacional. La proximidad


de las line as es proporcional a la ocupacion del agua en la region. (de J. R. Grigera, T. S.
Grigera, E. 1. Howard & A. D. Podjarny, Int. J. of Quantum Chem., Quantum Biol. Symp.
21: 109-116, 1994).

Los carbohidratos tienen propiedades muy interesantes en relacion con el agua.


Todos poseen varios grupos OR y por 10 tanto son potencialmente capaces de formar
puentes de hidrogeno. Sin embargo muchos de enos poseen regiones hidrofobicas. En
la figura H.8 podemos ver la representacion de la estructura de hidratacion del eritrol
II. Soluciones 79

(polialcohollineal de cuatro carbonos) obtenida por simulacion computacional. La


densidad del agua en su entorno es proporcional al tiempo de ocupacion del agua
en cada punto. En la figura se muestran las lineas de densidad en un reticulado
tridimensional. Podemos ver claramente las regiones hidrofilicas e hidrofobicas de
esta molecula.
La compatibilidad estructural entre soluto y solvente es un factor determinante
de la hidratacion. En sustancias que poseen un gran numero de sitios formadores de
puentes de hidrogeno, pero donde existe incompatibilidad estructural con el solvente,
la hidratacion produce una disrupcion de la estructura circundante. Un ejemplo de
este tipo de moleculas es la urea.

11.4.1. Clatratos

Los clatratos son hidratos cristalinos de caracteristicas peculiares. Las moleculas


de agua se encuentran dispuestas de manera singular de suerte que, si bien poseen
puentes de hidrogeno como en el caso del hielo, su configuracion es diferente. En el
hielo las moleculas de agua se encuentran en configuracion gauche en tanto que en los
clatratos est an en configuracion cis. Si bien en principio estas estructuras podrian
formarse de por S1, su estabilidad es baja. La presencia de una molecula 0 grupo
"huesped" en su interior estabiliza el complejo. Las moleculas que se introducen en
la cavidad son variadas, en general gases nobles, pequeiios hidrocarburos, H 2 S, CO 2 ,
N 2 , O 2 y Cb, aS1 como oxido de etileno, trimetil oxido y otros.
Debido al caracter no-polar de la mayoria de las sustancias, la inclusion de los
clatratos en esta seccion no resulta muy clara pero sus caracteristicas hacen que su
ubicacion resulte extraiia en cualquier seccion. Las figuras 11.9 y 11.10 ilustran dos
casos particulares. Es interesante notar que estas entidades, debido a su geometria,
no son capaces de llenar el espacio completamente.
Es posible formar est os hidratos comprimiendo agua saturada con gases nobles
a relativamente baja temperatura. Es interesante ver que se forman y precipitan
clatratos, y que en algunos casos aparecen cajas vadas.
Desde el punta de vista industrial se ha utilizado la formaci on de clatratos para
eliminar agua de acido sulfurico. Por otra parte, la prevencion de la formaci on de
est os hidratos es de importancia para evitar la presencia de los mismos en las lineas
de transporte de gas.
80 Temas de Biofisicoqufmica

a) b)

Figura H.9: Estructura de clatratos, (a) Tipo I y (b) Tipo II (redibujado de D. W. Davidson,
in Water: A Comprehensive Treatise, Vol. 2, edit ado por F. Franks, Plenum Press, New
York, 1973).

b)

Figura IUD: a) Caja (octaedro truncado ideal) encontrada en HPF 6 . 6H 2 0, y (b) Forma
distorsionada de (CH3)4NOH . 5H 2 0 (redibujado de Davidson, op. cit.).
Bibliograffa

[1] J.O'M. Bockris & A.K.N. Reddy, Modern Electrochemistry vol 1,


Plenum/Rosetta, New York 1973.

[2] L. Blum, Mol. Phys., 30, 1529, 1975.

[3] J.R Grigera & L. Blum, Chern. Phys. Letters, 38,486, 1976.

[4] R Triolo, J.R Grigera & L. Blum, J. Phys. Chem.,80, 1858, 1976.

[5] B. Wallmark & F.Mardh, J. Biol. Chern, 254, 11899, 1979.

[6] O. Ya. Samoilov, Structure of Aqueous Electrolyte Solutions and the Hydration
of Ions, Consultant Bureau, New York, 1965.

[7] F. Hofmeister Arch. Exptl. Pathol. Pharmakol., 24, 247, 1888.

[8] F. Franks, J. Dadok, RL. Kay & J.R Grigera,J. Chem.Soc. Faraday Transac-
tions, 87, 579, 1991.

[9] S.A. Galema, E.T Howard, J.B.F.N. Engberts, & J.R Grigera , Carbohydrate
Research, 265, 215, 1994.

Bibliografla general

• K. Denbigh, The Principles of Chemical Equilibrium, Cambrigedge University


Press, Cambridge, 1981.

• F. Franks, Editor Water. A Comprehensive Treatise Vol 3. Plenum Press, New


York, 1973.

• F. Franks& J.R Grigera, Solution Properties of Low Molecular Weight Poly-


hdroxy compounds, Water Sci.Rev., 5, 187, 1990.

81
Capitulo III

Interacci6n Hid rof6bica

Though deeply divided among themselves, princes and people became


'Cymry' -fellow countrymen- in the face of the Anglo-Saxon threat. 1
THE BEGINNING OF WALES, Caernarfon Castle

La existencia de sustancias que repelen el agua, hidrofobicas, se conocen desde


la antiguedad. Sin embargo, la interaccion que existe entre tales sustancias cuando
se encuentran en solucion acuosa -interaccion hidrofobica- fue introducida en su
formulacion actual por Kauzmann [1] en 1959. Contrariamente a otro tipo de inte-
racciones (enlaces covalentes, interaccion electrostatica, puentes de hidrogeno) no se
trata de una accion molecular 0 atomica uno a uno sino que es un proceso colec-
tivo. La importancia de la interaccion hidrofobica incluye aspectos conceptuales en
fisicoquimica y biologia y tiene consecuencias practicas. Dicha importancia ameri-
ta un estudio cuidadoso del Ham ado eJecto hidroJ6bico que, si bien podria Hamarse
en terminos generales efecto solvoJ6bico, adquiere trascendencia particularmente en
agua.

111.1. Termodinamica del efecto hidrof6bico


La solubilidad de las sustancias no-polares en agua es no solamente baja compara-
tivamente con las sustancia polares sino que ademas disminuye con la temperatura.
Esto resulta contrario a la experiencia que tenemos con otro tipo de interacciones.
En terminos termodinamicos significa que la energia libre de solubilizacion, que
definimos como la energia libre de transferir al agua una sustancia no-polar desde
su fase de vapor, aumenta cuando aumentamos la temperatura,

1 Pese a la profunda divisi6n existente entre ellos, principes y gente comun se convirtieron en
'Cymry' -conciudadanos- frente al ataque anglosaj6n.

83
84 Temas de Biofisicoqufmica

~Gsol = ~Hsol - T~Ssol > o. (IIL1)


donde ~Gsol es la energia libre de Gibbs,2 ~Hsol la entalpia y ~Ssol, la entropia
de solubilizacion. Para un cambio muy pequeno de temperatura podemos suponer
que la entalpia y la entropia permanecen constantes. 3 De tal manera vemos que
la energia de Gibbs aumenta con la temperatura, 10 que nos lleva a concluir que el
termino T~Ssol debe ser positivo (-T~Ssol < 0) y, en consecuencia, que ~Ssol es
positiva. Es decir que la solubilizacion de una sustancia no-polar en agua nos lleva
a una disminuci6n de la entropia del sistema.
La entropia de solubilidad tiene un termino que se denomina entropia de mezcla
que se debe a que la mezcla de especies genera una perdida de informacion. Esta
contribucion es positiva. Dado que el valor experimental del cambio total de entropia
es positivo debemos buscar una interpretacion que nos permit a encontrar un termino
de la entropia de solubilidad que supere en valor absoluto a la entropia de mezcla
(positiva) para obtener una valor total negativo.
Para una molecula grande, como podria ser una cadena policarbonada, podemos
pensar que esa contribucion proviene de la disminucion de la movilidad de la cadena.
Sin embargo, el fenomeno se observa incluso en gases monatomicos, donde la posi-
bilidad de restringir la movilidad interna es nula,4 como el argon por ejemplo. Este
hecho nos induce a pensar que debemos atribuir responsabilidad al solvente por el
decrecimiento de la entropia, como discutiremos mas adelante en detalle.
El potencial quimico estandar, que represent a la energia libre molar, puede es-
cribirse como

(IIL2)

donde, J-lhe es el potencial quimico estandar de la molecula hidrocarbonada en un


medio no-polar, J-l~ es el potencial quimico estandar de una molecula hidrocarbonada
en agua Y ~gsol la energia libre molar de solubilidad.
La energia libre molar esta relacionada con la entalpia molar y la entropia molar
por

~gsol = (hhe - hw) - T (She - Sw) . (IIL3)

2Denominada en la literatura francesa y holandesa como entalpia libre y cuya designaci6n de


acuerdo a las recomendaciones de la IUPAC es simplemente "energfa de Gibbs".

3La entalpfa no depende de la temperatura pero la entropfa sf 10 hace. Por Ese motivo debemos
considerar que estamos en presencia de un cambio fnfimo en la temperatura.

4El solvente puede disminuir la movilidad translacional, tanto mas cuanto mas asociado sea el
solvente.
III. Interacci6n hidrof6bica 85

Cuadro IlLI: Parametros termodinamicos de transferencia de hidrocarburos desde un solvente


organico a agua (de ref. [2])
~gj(cal mol-I) ~H j(cal mol-I)
13.900 -2.500 -21
4.900 1.700 -22
C 4 H lO 5.900 -800 -23
C6H6 4.600 600 -13
C 6 H 5 CH3 5.300 600 -16
C6 H5 C2 H5 6.100 400 -19

De donde podemos escribir

(IlI.4)
Conociendo la energia libre de solubilidad a diferentes temperaturas es posible
separar las componentes entropicas y entaJpicas. La tabla IlL1 muestra algunos
datos de la transferencia de hidrocarburos a agua obtenidos de esa manera.
Podemos ver que la mayor parte de la entalpia de solubilidad es negativa, 10 que
significa que el proceso esta favorecido energeticamente. Sin embargo, se observa una
contribucion desfavorable al proceso debido a que el termino entropico (-T~Ssol)
es positivo, ya que el cambio en la entropia es negativa, 10 que se atribuye al agua.

111.1.1. Experimentos de relajaci6n


Mediante experiment os de relajacion es posible estudiar los efectos moleculares de
la hidratacion ya que los mismos dependen de interacciones locales. Alcoholes y aci-
dos carboxilicos han sido utilizados como modelo para los estudios de relajacion del
agua en presencia de sustancias hidrofobicas estudiando las restricciones inducidas
por estas en el movimiento de las moleculas de agua.
Hallenga y col. [3] utilizaron alcoholes y acidos carboxilicos de diferente longitud
de cadena como soluto en soluciones donde se midieron las propiedades de relajacion
dielectrica del agua. Los experiment os se llevaron a cabo en soluciones muy diluidas
a efectos de evitar la interaccion soluto-soluto que perturbaria la interpretacion.
La figura IlL 1 muestra el corrimiento del tiempo de relajacion dielectrica del agua
por mol de soluto en funcion de la variacion de la entropia de solubilidad para una
coleccion de alcoholes y acidos carboxilicos de diferente longitud de cadena. Este co-
rrimiento se realiza hacia tiempos mas largos (menor frecuencia), 10 que implica una
movilidad mas restringida para el agua, cuanto mayor es la superficie hidrofobica,
es decir, de la longitud de cadena. Podemos ver que la mayor longitud de cade-
na se correlaciona con un decrecimiento mayor en la entropia de solubilidad. Este
86 Temas de Biofisicoqufmica

experimento marca claramente que la restriccion del movimiento del agua esta pro-
ducida por la presencia de la superficie hidrofobica y que esta es la responsable de
la disminucion de entrop!a de la solucion.

( 't-'tO),l
-- mol
c
-.28
• •
••• •
-.24 • •
••

-.20 ' - - - - - - ' - - - - - - ' - - - - - - - -
-10 -20
1 1
L\SsOI' cal mor grad.-

Figura IlLI: Corrimiento relativo del tiempo de relajaci6n dielectrico del agua por mol de
soluto en soluciones de alcoholes y acidos carboxilicos en funci6n de la entropia de solubilidad
R ~Ssol(de ref. [3]). TO es el tiempo de relajaci6n de agua pura cia concentraci6n molar del
soluto.

Las propiedades dinamicas tambien pueden estudiarse ventajosamente mediante


resonancia magnetica nuclear (RMN). Es posible utilizar sustitucion isotopica para
caracterizar nucleos pertenecienes a diferentes solutos as! como el solvente. La figura
III.2 muestra un experimento en soluciones de acetona-agua. En la figura se observa
la relajacion de soluciones de acetona/agua a diferentes concentraciones. En un
experimento la acetona esta marcada con 0 17 y el agua se observa a traves de la
relajacion de los prot ones (HI); en el otro se trata de una solucion de acetona en
agua pes ada y la relajacion de la acetona se sigue a traves de la relajacion del proton.
Se puede ver que el tiempo de correlacion rotacional del agua aumenta hast a una
fraccion molar de aproximadamente 0,3, dependiendo de la temperatura, y luego
decrece.
Estos resultados son muy importantes y de enos se pueden extraer conclusiones
esclarecedoras del proceso de hidratacion de las sustancias hidrofobicas. En primer
termino vemos que la presencia de acetona hace mas lenta la rotacion de las molecu-
las de agua, efecto que desaparece cuando la concentracion de acetona es muy alta,
es decir, cuando tenemos una solucion de agua en acetona en lugar de una solucion
de acetona en agua. En segundo termino vemos tambien que la movilidad del agua es
III. Interacci6n hidrof6bica 87

'T"/nc10

;:.."~ ~,~ H 0 _ 5°C


2
;:.."""""~ ~O - 25°C
- - Acetona - 5°C
6

0.25 0.5 0.75 1.0


X,

Figura III. 2: Tiempo de correlacion rotacional del agua en acetona en funcion de la concen-
tracion de acetona. Las line as llenas corresponden a 25°C y las line as quebradas a 5°C. Las
line as negras muestra la relajacion del 17 0 de la acetona y las line as grises se refieren a los
tiempos de correlacion rotacional del proton (HI). Se observa que el cambio en los tiempos
de correlacion de la acetona casi no sufre variaciones para las diferentes concentraciones
en tanto que la acetona afecta considerablemente los tiempos de correlacion del agua. Se
observa que los tiempos de correlacion del agua son mayores que los de la acetona a pesar
del menor tamano de la molecula.

menor que la de la acetona, pese a que el tamaiio molecular es menor. La movilidad


diferente de ambos compuestos nos indica que la "hidratacion" no tiene las carac-
teristicas que vimos para iones, por ejemplo, en donde la rotacion de las moleculas
de agua estaba asociada al movimiento del ion. Por ultimo podemos observar que
la movilidad del agua es mas dependiente de la temperatura que la de la acetona,
10 que indica una mayor energia de activacion para la rotacion del agua que para la
acetona.

111.2. Dinamica, estructura y termodinamica

En las secciones anteriores hemos encarado el problema de la interaccion hidrofobi-


ca desde el punta de vista termodinamico (macroscopico) y dinamico, en donde,
utilizando tecnicas de relajacion, nos concentramos en la dinamica molecular. Los
resultados obtenidos de uno otro metoda son totalmente compatibles y complemen-
tarios. Si embargo aun podemos ampliar nuestro conocimiento del problema si
88 Temas de Biofisicoqufmica

observamos las caracteristicas y transformaciones estructurales del sistema. Para


esto definiremos primero la hidrataci6n hidrof6bica.

111.2.1. Hidrataci6n hidrof6bica


Cuando estudiamos la hidratacion de sustancias polares (Capitulo II) vimos que
la hidratacion depend1a de la interaccion mutua ion-agua. En las soluciones acuosas
de sustancia no polares no podemos esperar una hidratacion de ese tipo ya que las
moleculas y grupos hidrofobicos interactuan mediante fuerzas debiles, tanto entre
S1 como con el agua (fuerzas de van der Waals). Sin embargo, existen evidencias de la
existencia de hidratacion de sustancias hidrofobicas, 10 que se denomina hidrataci6n
hidrof6bica.
De los experiment os de relajacion dielectrica vemos que existe una reduccion en
la movilidad de las moleculas de agua. Esa informacion se refiere a un valor medio
sobre toda el agua presente. Si suponemos que est amos en presencia de agua en dos
est ados dinamicos diferentes (solamente dos especies de agua) podriamos estimar el
volumen de agua alrededor de las sustancias hidrofobicas. El tiempo de relajacion
observado seria

1 f 1- f
-=--+--, (IIL5)
Tabs Thid Ta

donde f es la fraccion de agua participante de la esfera de hidratacion con tiempo


de relajacion Thid Y Ta es el tiempo de relajacion del agua en el seno delliquido.
Dado que conocemos el valor del tiempo de relajacion en el agua liquida, tenemos
dos incognitas sin resolver (f y Thid). Podemos suponer, en un primer intento, que
existe una sola esfera de hidratacion de tal manera que podemos estimar a f bajo
estas condiciones. El calculo de Thid a partir de los datos experiment ales con estas
suposiciones nos da un valor extremadamente alto y totalmente fuera de la realidad.
Por otra parte los resultados de RMN en acetona nos dicen que el soluto rota mas
rapidamente que el agua.
Frente a estas circunstancias debemos concluir que la estructura de hidratacion
no es compatible con una union entre el soluto y el solvente, como en el caso de los
iones, y que debe extenderse a mas de una esfera de hidratacion.
Los experiment os de difraccion, muy dificiles de llevar a cabo, serian de gran
utilidad. Existen resultados en sales de tetralquilamonio en agua [20] que muestran
que el reticulado de puentes de hidrogeno se refuerza por al presencia de la sal
que, por otra parte, tiene una region ionica cuyas caracteristicas de hidratacion se
encuadrarn en 10 que ya hemos visto.
Los resultados obtenidos mediante simulacion computacional arrojan informacion
importante. Un estudio realizado en moleculas hidrofobicas simples [21] muestran
III. Interacci6n hidrof6bica 89

que el agua alrededor de las moleculas polares tienen un tiempo de vida corto (T <
6, 5ps) pero que forman una "caja" alrededor del soluto similar a las estructuras de
hidratacion de los clatratos. Los estudios de simulacion en superficies planas son aun
mas ilustrativos ya que permiten estudiar el efecto de una superficie de mayor area.
Una ventaja de los metodos computacionales es que, en tanto reproduzcan las
propiedades macroscopicas, nos sirven para "espiar" en el mundo microscopico a
nivel atomico y molecular. En el caso de las simulaciones con paredes planas formadas
por atomos hidrofobicos y que poseen vibracion termica, nos muestran que el agua
modifica sus propiedades a distancias de la pared relativamente largas (del orden de
10nm = 100 A), 10 que es coincidente con los resultados de relajacion dielectrica y
RMN. Asimismo el reticulado de puentes de hidrogeno nos muestra un corrimiento
hacia una distribucion centrada en 4 puentes de hidrogeno a temperaturas en las
cuales el agua libre esta centrada en tres puentes de hidrogeno por molecula. Eso
significa que la pared hidrofobica induce una estructura de mayor orden y estabilidad
que la del seno delliquido. El resultado termodinamico sera una disminucion en la
entropia. La figura III.3 muestra esos resultados.

o Aguapura
_ Con membrana hidrofobica

0.4

.~ 0.3
u
c
(J.)
:::J
~ 0.2
.!::

0.1

0.0 -+--0-""1"---'+ 2 3 4 5 6
Numero de enlaces de hidrogena par malecula de agua

Figura III. 3: Distribuci6n de enlaces de hidr6geno por molecula para agua pura, agua en
presencia de una pared hidrofilica y agua frente a una pared hidrof6bica obtenidos mediante
simulaci6n por dinamica molecular (de ref. [4]). El modelo de agua es SPC IE.

Vemos que tanto los estudios sobre dinamica como los estructurales nos muestran
que las sustancias no polares reducen la entropia de la mezcla induciendo restriccion
del movimiento de las moleculas del agua, 10 que produce el descenso de la entropia
de solubilidad.

111.2.2. Interacci6n hidrof6bica


La existencia de la hidratacion hidrofobica, la que produce el descenso de
la entropia de solubilidad de las sustancias hidrofobicas, nos da la pauta de la
90 Temas de Biofisicoqufmica

razon de la interacci6n hidrof6bica.


En terminos generales podemos definir a la interaccion hidrofobica simplemente
como la interaccion entre sustancias no polares en agua. Evidentemente las sustan-
cias hidrofobicas interactuanin entre si a traves de fuerzas de van der Waals, pero
eso no es todo. Vimos que la introduccion de sustancias no polares en agua produce
el descenso de la entropia del sistema mediante la inmovilizacion parcial de molecu-
las de agua en su entorno. El agregado de dos 0 mas moleculas no polares reduce el
area total expuesta al agua; esta reduccion fuerza a un cierto numero de moleculas
de agua del entorno a transferirse a regiones de mayor movilidad. Como resultado
de la asociacion, la movilidad promedio del agua aumenta y con ella la entropia del
sistema. Vemos que la asociacion resulta ser un proceso favorable entropicamente. La
solubilidad de las sustancias no polares es poco favorable, ya que la inmovilizacion
del agua disminuye la entropia, en tanto que la asociacion de esas moleculas en el
agua aumenta la entropia -un proceso favorable-. Esta contribucion se adiciona a
la atraccion debida a las fuerzas de van der Waals presentes en cualquier medio.
Asi como los experiment os de relajacion dielectrica y RMN nos muestran que
para bajas concentraciones la movilidad del agua disminuye, tambien vemos que
al aumentar la concentracion (ver figura 3.1) la movilidad comienza a crecer. Ese
efecto, que tambien se observa mediante relajacion dielectrica [5], nos indica que
la asociacion molecular transfiere moleculas de agua de la region de movimiento
restringido a regiones de mayor movilidad.
Podemos separar las contribuciones de la interaccion de las moleculas no polares
en dos partes, una correspondiente a la interaccion de van der Waals -independiente
del solvente- y la otra proveniente de los cambios en el sol vente. Es frecuente designar
como interacci6n solvof6bica unicamente a la contribucion del sol vente. La denomi-
nacion de interaccion solvofobica es mas general que la de interaccion hidrofobica, ya
que la ultima se restringe al agua. Si bien en todo liquido estructurado encontramos
el efecto solvofobico, la magnitud de dicho efecto es cuantitativamente mucho mas
importante en el agua que en cualquier otro sol vente. Dado nuestro interes par-
ticular en los sistemas biologicos, donde el agua juega un rol importantisimo, nos
ocuparemos preferentemente del efecto hidrofobico, y asi 10 designaremos a 10 largo
del texto.
El desdoblamiento de las contribuciones de la interaccion de sustancias polares
en agua que hemos mencionado en el parrafo anterior puede ser expresado rigu-
rosamente. Consideremos dos moleculas simples (por ejemplo, argon 0 metano) en
agua. Al iniciar el proceso las dos moleculas se encuentran separadas por una gran
distancia. Si rl Y r2 son las posiciones al principio del proceso, el est ado inicial
sera r12 = Ir2 - rll = 00. En el est ado finalla distancia intermolecular sera del orden
de sus diametros, es decir r12 ~ (J, con (J el diametro molecular; mantenemos la
temperatura T y presion P constantes. Podemos expresar la energia libre de Gibbs
III. Interacci6n hidrof6bica 91

del proceso de traer las moleculas desde una distancia infinita hast a su contacto
como

flG(oo ---t 0") = G(T, P, composicion del solvente, r12 = 0") (IlL6)
-G(T, P, composicion del solvente, r12 = (0). (III. 7)

La energia libre de Gibbs contiene la contribucion total del proceso, sin embargo
podemos separarla para poner en evidencia las dos componentes, es decir

(IlLS)
donde U(O") represent a la contribucion direct a de la interaccion independiente del
solvente y el segundo termino (flGhi(O")) la interaccion dependiente del solvente.
Desde este punta de vista deberiamos denominar interaccion hidrofobica sola-
mente a la contribucion del sol vente. La interaccion total contiene tanto contribu-
ciones entropicas como entaJpicas, todas ligados a la reorganizacion del sol vente,
contribuciones que no est amos en condiciones de separar con precision. Por 10 tanto
consideraremos la energia libre de la interaccion hidrofobica como:

(IlL9)
donde incluimos todas las contribuciones al proceso de union de las sustancias no-
polares, ya sean direct as 0 indirectas.
La adopcion de este criterio tiene la desventaja de involucrar interacciones que
tambien est an presentes en la asociacion de las sustancias no polares en cualquier
medio, sea este agua, otro liquido estructurado 0 un solvente no-polar. Perdemos
asi especificidad pero trabajamos con expresiones que est an conectadas con parame-
tros que pueden determinarse experimentalmente.

l.Cual es el alcance de la interacci6n hidrof6bica?


Claramente la interaccion electrostatica es de largo alcance, pero Lcual es el al-
cance de la interaccion hidrofobica? En general se la consider a de muy corto alcance,
es mas, 10 mas comun es tomarla como una interaccion de contacto. Esta opinion se
bas a en los modelos mas viejos de interaccion hidrofobica donde se tomaba una capa
de hidratacion monomolecular -del tipo clatrato- de tal manera que el atraccion me-
diada por la contribucion entropica solo tenia efecto cuando las moleculas entraban
en contacto y asi desplazaban las moleculas de agua de menor movilidad. Hemos
visto que la hidratacion hidrofobica puede extenderse a distancias de varios diame-
tros moleculares, 10 que eliminaria la interpretacion del efecto de contacto. Por otra
92 Temas de Biofisicoqufmica

parte existen algunas determinaciones direct as de fuerzas de atraccion hidrofobica


que insinuan que la interaccion es de largo alcance.
Los experiment os directos de interaccion entre superficies hidrofobicas se hacen
midiendo la atraccion de dos superficies de mica a las que se Ie ha fijado una mono-
capa de sufactante, la que se asocia a la mica por la interaccion polar de las cabezas,
exhibiendo sus "colas" hidrocarbonadas al exterior [22, 25]. En otros casos se han
utilizado con superficies de silice 0 mica las que se han tratado quimicamente para
producir la metilacion [23, 24].Debido a las dificulades para mantener la superficie
hidrofobica est able existen dudas sobre la calidad de las medidas. No obstante un
anaJisis critico de los experiment os [26] indica que se puede considerar que 10 nm
es un valor razonable para la distancia de interaccion. Experimentos mas recientes
[27] concluyen que el alcance de la fuerza llega a distancias de entre 10 y 200 nm.
Dicha fuerza decaeria exponencialmente 0 con una ley de potencias, de acuerdo con
la distancia de la pared.
Los experiment os no son siempre faciles de interpretar en tanto que puede haber
contribuciones varias, adem as de la interaccion hidrofobica (fluctuacion de cargas,
transferencia de protones, etc.). Sin embargo, los resultados de simulacion muestran
que aun para interaccion hidrofobica pura el alcance podria ser del orden de 20 nm
[28].

111.2.3. Efectos de la temperatura


La interaccion hidrofobica tiene una dependencia con la temperatura que la hace
unica. Si observamos la ecuacion III.9 vemos que el termino Tf:)..Shi, que contribuye
con un aumento de la entropia, es el que determina el comportamiento con la tem-
peratura. 5
Si suponemos un intervalo de temperatura pequeno es posible considerar que
tanto la diferencia de entalpia como la de entropia permaneceran constantes. Puesto
que f:)..Shi > 0, surge inmediatamente que un aumento de la temperatura llevara a una
disminuci6n de la energia libre, es decir, a un aumento de la interaccion hidrofobica.
Podemos preguntarnos cuan apropiada es la suposicion de que los cambios en
entalpia y entropia de la interaccion hidrofobica permanecen constantes con la tem-
peratura. Por una parte vemos que la entalpia depende de interacciones tales como
las fuerzas de van der Waals y electrostaticas, las que no dependen de la tempera-
tura. 6 Con respecto a la entropia, esta esta ligada a la estructura del agua y, segun

5N6tese que la entropia de solubilidad disminuye con la temperatura pero, la entropia de inter-
acci6n hidrof6bica aumenta con la misma.

6El aumento de la temperatura usualmente produce un debilitamiento de las fuerzas de interac-


ci6n, pero esto es debido a la agitaci6n termica y no a un cambio en las fuerzas de atracci6n.
III. Interacci6n hidrof6bica 93

vimos, tanto los resultados experiment ales de difraccion de rayos X como los resul-
tados de simulacion nos muestran claramente que la funcion de distribucion radial
del agua -que podemos tomar como un indicador de la estructura- pierde definicion
al aumentar la temperatura (figura 1.18,)
Puesto que la contribucion entropica del agua a la interaccion hidrofobica de-
pende de la existencia de estructura en el agua, la perdida de la misma, ya sea por
la temperatura u otras causas, debilitara e incluso anulara la interaccion hidrofobi-
ca. Aqui nos encontramos con dos efectos contrapuestos. Es claro que a ciertas
temperaturas existe una contribucion positiva de la entropia, por 10 que deberemos
encontrar un aumento de la interaccion con la temperatura; al mismo tiempo vemos
que el aumento de la temperatura hace disminuir el orden y, por ende, la contribu-
cion entropica, debilitando la interaccion. La pregunta inmediata es en que rango de
temperaturas predomina uno u otro efecto, ya que es de esperar entonces que exista
una temperatura a partir de la cual el proceso se invierta.
Desde el punta de vista experimental se observa que en algunos sistemas el au-
mento de la interaccion hidrofobica llega a producir una separacion de fases mucho
antes de que los efectos de disminucion de la interaccion por debilitamiento de la es-
tructura acuosa se vuelvan importantes. Un caso relevante es la temperatura critica
de separacion de fases (critical de mixing temperature) que se encuentra, por ejemplo,
en mezclas de tetrahidrofurano-agua yen algunos surfactantes como el Triton X65.
Un ejemplo mas comun es el de las bebidas carbonatadas ("gaseosas"), que liberan
el anhidrido carbonico al ser calentadas. Diversas estimaciones indican que en el
rango de 0 a 60°C la interaccion hidrofobica aumenta y a partir de los 60°C comien-
za el proceso inverso. Existen experiment os que sugieren una disminucion continua
de la entropia de solubilizacion (que, como hemos visto, trae como consecuencia la
interaccion hidrofobica) a temperaturas mucho mayores [6]. Esto no es totalmente
sorprendente ya que, pese a que se debilita la estructura, el punta importante es
la diferencia entre la estructura del agua pura y la modificacion inducida por los
agentes hidrofobicos. Lo importante es que se mantenga la capacidad del agua de
producir mayor orden frente a las moleculas no-polares.

111.2.4. Efecto de la presion


A presiones de alrededor de 1 a 2 kbar, las propiedades del agua cambian gra-
dualmente perdiendo su caracteristica de liquido asociado, tal como se observa en
numerosos experiment os [7, 8, 9]. La perdida de las propiedades peculiares del agua
se debe a la disrupcion de la estructura tetraedrica regular del liquido. En otras
palabras, la presion mueve el balance entre las estructuras tetraedricas y hexagonales
hacia esta ultima.
Tal como hemos indicado mas arriba, el efecto hidrofobico se bas a en la existencia
94 Temas de Biofisicoqufmica

del reticulado de puentes de hidrogeno. La perdida de estas estructuras convierte al


agua en un liquido que carece de efecto solvofobico. El estudio de sistemas modelo
-sistemas de agua y particulas no-polares- muestran claramente que ese es el ca-
so [12]. Esta situacion resulta relevante para la estabilidad de las proteinas, cuyas
estructuras dependen fuertemente de dicho efecto. Si bien las estructuras proteicas
est an determinadas por un conjunto de fuerzas -electrostaticas, de van der Waals,
puentes de hidrogeno e hidratacion-los contactos de los grupos no-polares no sola-
mente dependen de las fuerzas de van der Waals sino tambien del efecto hidrofobico.
Se consider a la interaccion hidrofobica como el factor esencial para mantenerla es-
tructura nativa. Consecuentemente, la debilitacion de la interaccion hidrofobica, por
cualquier causa, producira la desnaturalizacion.
Se ha demostrado experimentalmente que las proteinas pierden su est ado nativo
cuando se las somete a presiones superiores a 2 kbar, llegando a desnaturalizacion
drastica a presiones mayores [10, 11], 10 que coincide con la perdida de la estructura
del agua. Curiosamente, la interpretacion, casi evidente, de que el debilitamiento del
efecto hidrofobico es el causante de la desnaturalizacion proteica fue cuestionada.
Sin embargo, , resultados recientes de simulacion mediante dinamica molecular han
reforzado fuertemente la hipotesis [13, 14, 15].

111.2.5. Otros factores que modifican la interacci6n hidrof6bica

La interaccion hidrofobica se bas a en la preexistencia de orden en el agua, la


que se ve increment ada por la presencia de las sustancias no-polares. Un aumen-
to importante en la temperatura 0 la presion hacen que el orden regular del agua
desaparezca 0 se torne muy pequeno. En esas condiciones esperamos que la presen-
cia de las moleculas hidrofobicas produzcan muy poco -si algo- de orden extra, y
consecuentemente una interaccion debil. Intuitivamente podemos considerar que la
ventaja de que se establezca la aproximacion de las moleculas no-polares desapare-
cera al "no existir orden que destruir" .
Ademas de la presion y la temperatura existen otros factores que pueden debilitar
la estructura del agua, como por ejemplo la adicion de otras sustancias que llamamos
"destructoras de estructura". Asi como las sustancias hidrofobicas inducen orden,
puede haber, y de hecho las hay, otras que induzcan desorden. Ya hablamos de estas
sustancias en la seccion §II.2.3.
La urea es una sustancia interesante para estudiar la interaccion hidrofobica.
Sabemos que la urea forma "buenos" enlaces de hidrogeno de manera que, de alguna
forma, genera estructura en el agua. Sin embargo, no llamamos a la urea formado-
ra sino destructora de estructura debido a que la estructura de hidratacion de la
urea es incompatible con la estructura media del agua libre. Ya que la estructura
de hidratacion de la urea compite con la estructura regular del agua, el efecto en
III. Interacci6n hidrof6bica 95

la interaccion hidrofobica sera adverso. Las sustancias hidrofobicas inducen orden


cuando el agua esta en condiciones de aumentar su numero de enlaces de hidrogeno
con otras moleculas de agua, la urea no solo retiene algunas moleculas de agua
en estructuras adversas al proceso sino que muchas de las moleculas del entorno
se yen afectadas por la hidratacion inducida, perdiendo su capacidad de ordenarse
regularmente. La urea es, por 10 tanto, un inhibidor de la interaccion hidrofobica.
Es bien conocido el hecho de que la urea desnaturaliza las proteinas, a reI a-
tivamente alta concentracion. Este efecto fue consider ado por mucho tiempo como
derivado de la competencia de la urea con los puentes de hidrogeno intra-moleculares
de la proteina.
En realidad, para considerar que la urea compite con los puentes de hidrogeno
proteicos debemos evaluar si los puentes de hidrogeno urea-proteina son mas favo-
rabIes que los correspondientes a los proteina-proteina y de alli estimar hacia donde
se desplazara el equilibrio. En general se supone que esos puentes de hidrogeno son
comparables, informacion que no nos sirve para definir claramente la controversia.
Una demostracion clara la ofrece el trabajo clasico de Klotz [16], quien estudio un
polimero sintetico (polivinyl-methiloxazolidiona) carente de capacidad para formar
puentes de hidrogeno, aunque capaz de generar interaccion hidrofobica, necesaria
para estabilizar su estructura. La accion de urea produce la "desnaturalizacion" del
polimero, si es que asi se puede llamar al cambio de conformacion de un polimero
sintetico.
Existen otros sistemas, incluso mas simples, que prueban el efecto de urea como
inhibidor de la interaccion hidrofobica, como 10 son las micelas, en las que tampo-
co encontramos puentes de hidrogeno que las estabilicen y cuya estabilidad se ve
totalmente alterada por la presencia de urea.
Asi como encontramos inhibidores de la hidratacion hidrofobica (y por ende in-
hibidores de la interaccion hidrofobica), podemos encontrar promotores. Esto es
posible ya que asi como la urea se hidrata de forma tal que atenta contra la estruc-
tura regular del agua, otras moleculas pueden hidratarse con estructuras totalmente
compatibles con la estructura del agua. Una molecula que estabilice la estructura
del agua tambien favorecera la formaci on de estructuras ordenadas inducidas por las
sustancias hidrofobicas y de alli favoreceran la interaccion de tales moleculas.
La aldosas son un ejemplo, ya que todas son capaces de formar un numero con-
siderable de puentes de hidrogeno, siendo la talosa y la glucosa dos de las que dispo-
nen de sus sitios formadores de puentes de hidrogeno de tal forma que promueven
estructura en el agua [17] y, por 10 tanto, favorece la interaccion hidrofobica. La es-
tabilizacion de micelas por glucosa son una prueba experimental de este fenomeno.
El problema de la estabilidad de proteinas es un campo amplisimo, tanto des-
de el punta de vista fundamental como de sus aplicaciones, ya que la interaccion
hidrofobica juega un rol preponderante. En el capitulo IV avanzaremos sobre este
96 Temas de Biofisicoqufmica

tema, aunque en las proximas secciones consideraremos algunos aspectos relevantes


para el problema.

111.3. Los momentos hidrof6bicos y la amfifilicidad


111.3.1. Parametros de solvatacion atomica (PSA)
Uno de los problemas que planea el estudio de la interaccion hidrofobica es la
dificultad de cuantificar la misma, pese a 10 cual se ha intentado establecer una es-
cala de hidrofobicidad. Esta escala no ha resultado, lamentablemente, {mica, ya que
su definicion se bas a en alguna propiedad mensurable que caracterice la hidrofobi-
cidad (es decir, la repelencia al agua) de las moleculas, y las diferentes propiedades
ensayadas no acuerdan totalmente en el orden en que las moleculas deb en colocarse
en la escala.
Las moleculas que interesan en este campo son los aminoacidos, acidos grasos,
lipidos, asi como drogas 0 potenciales drogas. Casi la totalidad de las moleculas men-
cionadas no son totalmente hidrofobicas ni totalmente hidrofilicas. Esta propiedad
de compartir caracteristicas de unas y otras se denomina amfifilicidad.
El prototipo de molecula amfifilica es el correspondiente a los surfactantes, donde
encontramos una "cabeza" polar y una "cola" hidrocarbonada. La interaccion hidrofobi-
ca de las colas tiende a producir agregacion; cuando la concentracion es suficiente
la totalidad de las colas hidrofobicas queda oculta al agua exponiendo las cabezas
polares al medio.
Para cuantificar la interaccion hidrofobica, Eisenberg y colaboradores [18] pro-
pusieron que la interaccion agua-soluto puede considerarse mediante la suma de un
parametro, el panimetro de solvataci6n at6mico (PSA), que describe dicha interac-
cion para cada atomo del compuesto.
La idea basica que subyace en la propuesta es que la energia libre de interaccion
puede expresarse como la energia libre de cada grupo atomico. Se utiliza tambien el
concepto de area expuesta al solvente, definida mediante una operacion que consiste
en hacer rodar una esfera de 0,14 nm de radio sobre la superficie molecular (Hamada
tambien superficie de Conolly, el area cubierta represent a el area a la cual el agua
podria acceder 7 (ver figura III.4b). El area asi calculada no es igual a la suma de las
areas individuales de cada atomo. La contribucion atomica a la energia libre resulta
entonces igual a la suma de la superficie expuesta de cada atomo multiplicada por el
parametro de solvatacion correspondiente. Asi tenemos la contribucion de un atomo
i como

7N6tese que la elecci6n del radio de la esfera puede cambiar considerablemente la superficie
expuesta.
III. Interacci6n hidrof6bica 97

(III. 10)
donde 6.(Ji es el panimetro de solvatacion atomica del atomo i yAel valor del area
expuesta correspondiente.
En cuanto a la energia libre total de transferencia de una molecula desde el medio
acuoso al interior de una proteina, esta se expresa como

(III. 11 )

a) b)
Superficie
Agu~a~.......~ accesible I

~)
o Soluci6n
ocuoso
~~%-~~

Figura IlI.4: Esquema que muestra la base para calcular la energia libre de transferencia de
un soluto desde el agua al interior de una proteina. a) un atomo aislado; b) una molecula
mas compleja. Se observa que para el ultimo caso el area expuesta total no es igual a la
sum a de las areas individuales debido al apantallamiento de ciertas regiones por los atomos
vecinos.

El area de la superficie expuesta depende de la configuracion molecular de manera


que cualquier estimacion de la energia libre debe partir de un conocimiento adecuado
de tal conformacion. Alternativamente, si tenemos una muy buena informacion sobre
el valor de A podriamos intentar obtener datos de la conformacion. El problema se
transfiere a cuan bueno es el valor del parametro de solvatacion atomica. En general
se aceptan los valores calculados por Clothia [30], quien parte de una coleccion de
solventes organicos encontrando un valor de 1.05 kJ jnm 2 (25 calj A 2), valor que
difiere del sugerido posteriormente [31] de 1.925 kJjnm 2 (46 caljA2). Estos valores
98 Temas de Biofisicoqufmica

no han sido completamente confirm ados y, como se puede ver, est amos frente a un
dJculo aproximado.

111.3.2. La energfa de solvataci6n y el plegamiento de protefnas

Siendo el plegamiento de proteinas un problema candente en la biologia estruc-


tural de hoy, es evidente que las ideas anteriores han sido utilizadas para intentar
obtener informacion sobre plegamiento. Se podria evaluar al menos la componente
de solvatacion de la energia libre de plegamiento utilizando el panimetro ~(j si pu-
dieramos evaluar el area accesible al solvente tanto en el est ado de referencia como en
el est ado plegado. La contribucion de la solvatacion a la energia libre de plegamiento
puede escribirse como

(III. 12)

donde A es el area accesible al solvente del atomo i en el est ado plegado y A~ es


el valor correspondiente al est ado de referencia. Cuando la ecuacion III.12 se aplica
sucesivamente a diferentes est ados con la misma referencia, podemos obtener las
diferencias ("~~") sin importar cual es la referencia particular.

111.3.3. Momentos hidrof6bicos

La hidrofobicidad de una compuesto no puede describirse sino imperfectamente


con un unico parametro. Dado que las moleculas y grupos funcionales frecuente-
mente participan de propiedades hidrofobicas como hidrofilicas, la contribucion de
cada una nos dara un valor para la hidrofobicidad. Sin embargo ese valor medio
sobre toda la molecula 0 grupo no nos dice como est an distribuidas sus compo-
nentes. Eisenberg y col. [18] definieron el concepto de momentos hidrof6bicos con
una idea analog a a la que conocemos para las cargas electricas. Aun una molecula
neutra puede tener un momenta dipolar electrico, de la misma manera una molecu-
la perfectamente balanceada en sus componentes polares y no-polares puede tener
una distribucion tal que podamos definir un "momento", pero hay aun mas; la dis-
tribucion no necesariamente sera de un tipo dipolar, distribuciones mas complejas
pueden derivar en moment os hidrofobicos de orden superior (cuadrupolo, octupolo,
etc.). La idea ha sido desarrollada con cierto detalle hast a los moment os hidrofobicos
de primer orden (eq ui valente al di polo elect rico ) .
El momenta de orden cero es el valor neto de la hidrofobicidad. Con respecto
a una molecula amfifilica, como un aminoacido, el momenta hidrofobico de primer
orden dependera de la distancia entre el centro de las regiones polares y no-polares
y de su magnitud.
III. Interacci6n hidrof6bica 99

Cuadra III.2: Escala de hidrofobicidad de los amin01icidos. Los valores corresponden ala esc ala
de consenso descripta por Eisenberg, Weis, Terwillinger y Wilcox [Faraday Symp. Chem.
Soc. 17: 109 (1982)]. Los residuos estan dispuestos en orden decreciente de hidrofobicidad.
La magnitudes son aproximadamente al valor necesario para transferir el aminoacido de una
fase hidrof6bica a una hidrofilica expresada en kcal mol- 1

RESIDua ESCALA
Ile 0.73
Phe 0.61
Val 0.54
Leu 0.53
Trp 0.37
Met 0.26
Ala 0.25
Gly 0.16
Cys 0.04
Tyr 0.02
Pro -0.07
Thr -0.18
Ser -0.26
His -0040
Glu -0.62
Asn -0.64
GIn -0.69
Asp -0.72
Lys -1.1
Arg -1.8
100 Temas de Biofisicoqufmica

Un dipolo hidrof6bico se represent a mediante un vector cuya direcci6n se encuen-


tra hacia la direcci6n de la porci6n hidrof6bica. Para una macromolecula completa
el dipolo hidrof6bico sera igual a la suma vectorial de los moment os dipolares de
cada componente. Como todo vector, para su identificaci6n es necesario indicar la
magnitud, direcci6n y sentido.
El momenta hidrof6bico se define como

(IlL13)

donde ri es el vector desde cualquier origen al centro del iesimo grupo y Hi la hidro-
fobicidad del mismo grupo. La figura IlL5 muestra una representaci6n grafica del
momenta dipolar hidrof6bico de la arginina .

• NH'

Figura IlL5: El momento hidrofobico de la arginina puede representarse como se muestra


en la figura. La fiecha apunta desde a la region mas hidrofilica a la mas hidrofobica de la
molecula.

Se ha invertido mucho esfuerzo en el desarrollo de una escala de hidrofobicidad


de los aminoacidos. La tabla IlL3 muestra la escala de consenso establecida para los
aminoacidos junto con sus moment os hidrof6bicos. Podemos ver que tres aminoacidos
(Met, GIn, Asp) tienen el mismo valor absoluto de momenta dipolar hidrof6bico
(1J-l1 = 1,9), sin embargo la orientaci6n de los mismos los hace completamente di-
ferentes. Los moment os hidrof6bicos son mucho mas informativos que una simple
escala de hidrofobicidad. La direcci6n del momenta hidrof6bico se define desde el
carbono 0: al centro geometrico de la cadena lateral. Esta direcci6n se indica como
cos () en la ultima columna de la tabla IlL3.
La hidrofobicidad tambien puede calcularse con el (PSA) haciendo Hi = ~(jiA.
Los moment os hidrof6bicos son ahora muy populares en los program as para pre-
decir conformaci6n molecular y plegamiento. Sin embargo es frecuente encontrar en
tales lugares referencias a un unico valor del "momento hidrof6bico" el que, al ser
un vector, queda indefinido. La utilidad del momenta hidrof6bico queda totalmente
desvirtuada, como dijimos un vector necesita m6dulo, direcci6n y sentido para su
definici6n.
III. Interacci6n hidrof6bica 101

Cuadra III. 3: Energias libres de solvataci6n (en kcal mol-I) para amin01icidos con sus mo-
mentos hidrof6bicos (en kcal mol- I A) segun Eisenberg y McLachlan Nature 319: 199 (1986).

AMINO.ACIDO ~Gtobs ~GR IILal cos ()


Gly (0) (0) (0)
Ala 0.42 0.67 0
Val 1.66 1.5 0.48 0.84
Leu 2.32 1.9 1.0 0.89
Ile 2.46 1.9 1.2 0.99
Pro 0.98 1.2 0.18 0.22
Cys (half) 1.34 0.38 0.17 0.76
Met 1.68 2.4 1.9 0.94
Thr 0.35 0.52 1.5 0.09
Ser -0.05 0.01 0.73 -0.67
Phe 2.44 2.3 1.1 0.92
Trp 3.07 2.6 1.6 0.67
Tyr 1.31 1.6 1.8 -0.93
Asn -0.82 -0.60 1.3 -0.86
GIn -0.30 0.22 1.9 -1.0
Asp -1.05 -1.2 1.9 -0.98
Glu -0.87 -0.76 3.0 -0.89
His 0.18 0.64 0.99 -0.75
Lys -1.35 -0.57 5.7 -0.99
Arg -1.37 -2.1 10.0 -0.96
GRUPO ~G+obs ~GR
-CH T 0.67 0.56
-C 6 H 5 - 1.91 1.6
-OH- -0.76 -0.66
-CHTCONH- -1.14 0.66

tFauchere y Plishka: Eur. J. Med. Chem.-Chim. Ther., 18, 369, (1983).


+Cohn y Edsall: en ACS Monograph Series, Vol. 9: Protein, Amino Acids and Pep-
tides as Ions and Dipolar Ions, Reinhold, New York, 1943.
102 Temas de Biofisicoqufmica

111.4. La medici6n de la interacci6n hidrof6bica


Hay varias constantes experiment ales para establecer escalas de hidrofobicidad,
ninguna de ellas aceptada universalmente. La mas comun se refiere ala energia libre
de transferencia, la cual puede ser relacionada con el coeficiente de particion.

111.4.1. Coeficientes de particion y su interpretacion en terminos de interaccion


hidrofobica

El coeficiente de particion de una especie molecular es la razon entre las concen-


traciones de la misma entre dos fases en equilibrio. El coeficiente de particion ha sido
utilizado para el estudio de las fuerzas intermoleculares de compuestos organicos.
Los resultados en ese campo pueden auxiliarnos para diseiiar las determinaciones de
los coeficientes de particion en relacion a la interaccion hidrofobica.
Si suponemos dos soluciones ° y w y un soluto comun en equilibrio, tendremos

J-l~ + RTlnxo = J-l':n + RTlnxw, (IlL 14)


donde Xo Y Xw represent an las fracciones mol ares del componente i en los solventes
° y w respectivamente. De la ecuacion IlL14 surge que
(IlLI5)
Designamos a la razon

(IlLI6)
como el coeficiente de particion termodinamico, para distinguirlo del coeficiente de
particion experimental

(IlLI7)
La diferencia existente entre ambos coeficientes debe ser tenida en cuenta. Se
puede escribir

6.J-l = RT In p'. (IlLlS)


En tanto que con P tendremos

(IlLIg)
donde Vo Y Vw son los volumenes mol ares de los solventes ° y w respectivamente.
Los valores pi y P est an relacionados con la energia libre de transferencia. Fre-
cuentemente en la literatura se cita ellogaritmo (decimal) del coeficiente de particion
III. Interacci6n hidrof6bica 103

experimental (log P) de los cuales se encuentran disponibles largas tablas de valores.


Desafortunadamente la informacion relativa al volumen molar, necesaria para obte-
ner los datos termodinamicos, no se encuentra siempre disponible.
Podemos aprender mas de la hidrofobicidad de una sustancia expresando el coefi-
ciente de particion entre agua y un dado solvente organico de referencia. Utilizando
el mismo solvente de referencia es posible construir una tabla de hidrofobicidad,
pero debe tenerse en cuenta que dicha tabla no sera "universal" ya que el cambio
de referencia puede incluso invertir el orden de algunos compuestos en la tabla.
Dado que el coeficiente de particion se refiere al equilibrio de solubilidad entre dos
fases, en nuestro caso una polar y otra no-polar, el coeficiente de particion esta en
realidad ligado tanto a la hidrofobicidad como a la hidrofilicidad, es decir, refleja la
amfifilicidad de la sustancia.
La ecuacion IlL18 consider a solamente la afinidad quimica entre los dos medios,
sin embargo otros efectos pueden estar presentes tales como el cambio en la entropia
conformacional de rotacion producido por la transferencia de medios. Una formula
mas general puede escribirse como

6.J-l = RTlnP' + JFH, (IlL20)


donde JFH es una funcion que tiene en cuenta la posible contribucion a la energia
libre de particion. Los tratamientos mas simples, que podriamos Hamar clasicos,
no consider an esta contribucion. La ecuacion IlL18 resulta ser igual a la IlL20 con
JFH = 0; a la vez podemos considerar la ecuacion IlL18 dentro del tratamiento
tradicional con JFH = RTIn(Va/Vw), que depende solamente del solvente.
Una propuesta basada en la teoria de Flory-Huggins [19] da terminos adicionales
ala expresion que resulta

JF H = RT In (_v - '! ) .
Vw Va
(IlL21 )

Los coeficientes de particion agua/solvente organico han sido frecuentemente


referidos a sistemas octanol-agua. Sin embargo el octanol puede tener interaccion
polar especifica, en algunos casos resultando en una falsa impresion para ciertas
sustancias con un caracter mas hidrofobico que 10 que son en realidad, como ocurre
con el triptofano [29].
Si comparamos la escala de hidrofobicidad obtenida en base ala distribucion de
transferencia de agua a vapor y de agua a ciclohexano [29], que se muestra en la
tabla IlI.4, con la de la tabla IlL2, vemos que hay algunos cambios en el orden de
ciertas sustancias. Es notable el caso de la prolina cuya posicion fue generada por
un ciclo de transformaciones de la cadena lateral de la norvalina -para la cual se
conoce el valor exacto-. Esta evaluacion indirecta Ie da un valor mucho mayor de la
104 Temas de Biofisicoqufmica

Cuadra IlI.4: Comparaci6n de la esc ala de hidrofobicidad de amin01icidos con algunos com-
puestos obtenidos de los coeficientes de distribuci6n distribuci6n cicloexano-agua (de Rose
y Wolfenden ref. [29]).
Leu, Ile butano, isobutano
Val propano
Pro ciclopropano
Phe tolueno
Met, Trp etil metil sulfato, skatole
Ala metano
Cys, Gly metanotiol, hidrogeno
- nivel cero - Tyr fenol
Thr etanol
Ser metanol
His 4- metilimidazol
Lys, GIn N - butilamina, propionamida
Asn acetamida
Glu acido propionico
Asp acido acetico
Arg N -propilguanidina

hidrofobicidad que en la tabla de consenso mencionada, en donde resulta ligeramente


hidrofilica.
Todo esto no nos hace mas que poner en guardia frente a escalas de hidrofobicidad
construidas con metodos diferentes.

111.4.2. Balance hidrofflico-lipofflico (BHL)


La amfifilicidad se refleja en el coeficiente de particion. Las variaciones del coefi-
ciente de particion cuando se cambian los solventes resulta de suma importancia para
la separacion por contracorriente, que fuera fundamental en los trabajos pioneros de
la bioquimica de proteinas.
Dado que existe una gran cantidad de compuestos amfifilicos es importante cono-
cer en cuanto participan del caracter hidrofobico y en cuanto del hidrofilico. Este ba-
lance es de sumo interes para determinar su capacidad de union a regiones hidrofobi-
cas y su solubilidad en agua, ya que ambas propiedades pueden ser necesarias, por
ejemplo para la interaccion de una droga 0 para establecer su capacidad de emul-
sionarse. Eillamado balance hidrofilico-lipofilico (BHL) es una medida de la amfi-
filicidad y ha sido desarrollado empiricamente. Existe una relacion entre el BHL y
el coeficiente de particion que puede expresarse, aunque sin gran rigurosidad, como
III. Interacci6n hidrof6bica 105

HLB -7 = 0,361n(1/P). (III.22)

111.5. Hidrofobicidad general y especffica


Puesto que la interaccion hidrofobica no contiene "enlaces", resulta en general
inespecifica. En principio cualquier par de particulas con regiones hidrofobicas puede
unirse. Sin embargo existen ciertos casos en los cuales se observa cierta especificidad.
Cuando un pequeno ligando se une a una proteina mediante interaccion hidrofobica,
si existe un acuerdo entre la geometria de mas de una region hidrofobica, la union es
mas fuerte. La competencia de este ligando con otro en el que no existe este acuerdo
sera favorable, existiendo una cierta especificidad.
Este ejemplo es importante en la determinacion del efecto entre drogas. La union
de las drogas a las proteinas plasmaticas es en general una etapa necesaria para la
accion de las drogas, la eficiencia de las mismas esta frecuentemente afectada por
estas propiedades de union.
El caso de plegamiento de proteinas, que mencionamos antes, no es igual a la
union de pequenos ligandos a la superficie de la proteina, ya que en el primer caso
no solamente esta involucrada la superficie sino las cadenas en su integridad. La
concordancia entre las diferentes regiones de contacto hidrofobico, que se ocultaran
en su mayoria de la exposicion al solvente, requiere cierta especificidad ciertamente
presente.
En este punta es importante destacar que, si bien la gran mayoria de los grupos
hidrofobicos se encuentran en el interior proteico, los pocos grupos expuestos son
funcionalmente importantes, particularmente en las proteinas plasmaticas como la
albumina, cuya funcion es transportar sustancias con regiones hidrofobicas a 10 largo
del torrente sanguineo.
La interaccion hidrofobica especifica juega un importante papel en la contrac-
cion muscular. Cambia la relacion entre la actina y miosina durante la hidrolisis
del ATP catalizada por miosina, participando en el conjunto de los procesos de
contraccion muscular. Los residuos que interactuan con la actina y miosina son
ionicos e hidrofobicos. Por mutagenesis dirigida es posible identificar los residuos
hidrofobicos [34] mostrando la importancia de la hidrofobicidad especifica en los
procesos de interaccion.
Otra situacion en la cualla especificidad de la interaccion hidrofobica muestra su
efecto es el caso de la anemia falsiforme. El cambio de un unico residuo polar en cada
cadena por uno hidrofobico produce la asociacion de las moleculas de hemoglobina.
Esta asociacion se produce cuando la hemoglobina libera oxigeno aumentando su
tamano (el proceso de "respiracion"). Con el mayor tamano de la molecula, los
residuos hidrofobicos ahora presentes pueden contactarse formando una asociacion
106 Temas de Biofisicoqufmica

molecular en forma de filamentos. Estos agregados moleculares deform an las celulas


y producen una rigidizacion de las mismas. La interaccion especifica entre los grupos
hidrofobicos es la causante del problema.

111.6. EI desarrollo futuro


Si meditamos sobre 10 expuesto en este capitulo vemos que hay mas preguntas
que respuestas (ihemos dado tres tablas diferentes de escalas de hidrofobicidad!).
Esto nos muestra un campo importante pero en el cual se requiere mucho mas
trabajo: nuevos experiment os que aporten datos precisos, simulacion computacional
y nuevas teorias ciertamente permitiran en el futuro mejorar la capacidad predict iva
para poder resolver un sinnumero de problemas en el campo biologico.
Bibliograffa

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107
108 Temas de Biofisicoqufmica

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III. Interacci6n hidrof6bica 109

Lecturas suplementarias

General

• F. Franks, editor, Water. A Comprehensive Treatise, Vol 4, Plenum Press, New


York, 1975.

• C. Tanford, The Hydrophobic Effec, Wiley, New York 1973.

Coeficientes de partici6n (experimentos y dlculos)

• H. van der Waterbemd, Hydrophobicity of organic componds, CompuDrug


Int., Vienna, 1986.

• H.S. Chan & K.A. Dill, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 26425, 1997.
Capitulo IV

Hid rataci6n de biomacromolecu las

A dried protein is, if not dead, at least asleep. 1


J. L. FINNEY, Phil. Trans. R. Soc. Lond. (1977) B278: 3-32.

A mediados del siglo XX comenzaron a aparecer las ideas de que el agua intracelu-
lar diferia en sus propiedades del agua "regular". Comenzo a surgir el concepto de
que, por algun mecanismo desconocido, el agua se fijaba a las macromoleculas. Sin
embargo, no se pensaba que esa cantidad de agua era cuantiosa. Por ejemplo, se su-
geria que en una solucion del 5 % de gelatina alrededor dell % de agua est aria unida
ala proteina [1], una cantidad que hoy sabemos es despreciable frente al verdadero
valor. 2
Con el perfeccionamiento de las determinaciones experiment ales y la introduccion
de nuevas ideas se comenzo a edificar la concepcion de que el agua no solamente es-
taba asociada a sino que era parte integral de los sistemas biologicos, interactuando
fuertemente con las biomacromoleculas y participando en la reactividad molecular.
La evolucion de estas ideas fue muy lenta si 10 com par amos con el nipido desarro-
llo que otros aspectos de la ciencia 10 hicieron a partir de las primer as decadas del
siglo pasado. Alrededor de los arros 60-70 aparecieron ideas cuasi extremas sobre la
estructura y funcion del agua en los sistemas biologicos, ideas extremas que atra-
jeron (y escandalizaron) a muchos investigadores pero que permitieron evolucionar
el conocimiento y aceptacion de la importancia que tiene la hidratacion hoy en dia.
No debe pensarse, sin embargo, que se trata de un tema cerrado y sin controversias,
existe mucho para estudiar, ampliar y corregir de nuestros conocimientos sobre el
particular, 10 que 10 hace uno de los temas mas atrayentes.

1 Una proteina seca esta, si no muerta, al menos dormida.

2La gelatina es un estado desnaturalizado de colageno.

111
112 Temas de Biofisicoqufmica

La importancia del agua en Biologia se reconoce y consider a incluso en los cur-


sos element ales , esencialmente por sus propiedades como solvente "universal" y su
capacidad calorific a que la hace un elemento importantisimo para mantener la tem-
peratura corporal. Sin embargo la influencia va mucho mas alla; sin ignorar los
efectos mencionados y su funcion como distribuidora de nutrientes y desechos, exis-
ten otras caracteristicas que debemos tener en cuenta. Dada la interaccion del agua
con sustancias polares y no polares dentro de las celulas, que hemos delineado en
capitulos anteriores, el agua intercelular crea un medio altamente inhomogeneo en
cuanto a su viscosidad, caracteristicas de difusion de pequeiias (y grandes) molecu-
las, respuesta mecanica, etcetera. Por otra parte el agua es una fuente y sumidero
de protones, participando en innumerables reacciones quimicas que acontecen en las
celulas.
En 10 que sigue de este capitulo analizaremos diferentes alternativas y carac-
teristicas de hidratacion de biomacromoleculas en terminos amplios y en capitulos
subsiguientes veremos otros aspectos de la participacion del agua en la funcion bio-
logica, tales como flujo de agua, e intentaremos luego integrar los temas en una
descripcion global.

IV.1. Agua "Iigada"


Para entender el rol del agua en el delicado equilibrio de los sistemas biologicos
no es suficiente determinar cuanta agua esta asociada a las macromoleculas, esta
informacion -import ante- no es mas que el principio del proceso, debemos conocer
en detalle como y donde se asocia para luego extraer de alli su posible funcion.
El termino agua ligada fue incorporandose al lenguaje, pero el mismo involucra
un rango tan amplio de situaciones que puede resultar equivoco si no se especifica
cuidadosamente su concepto para el caso articular.
Existen muchas definiciones de 10 que podriamos llamar agua ligada, algunas de
ellas se listan a continuacion. La figura IV.1 ilustra el significado de alguna de ellas.
Se puede llamar agua ligada al:
• Agua que ocupa posiciones regulares en un cristal de la macromolecula detec-
tadas por rayos X 0 difraccion de neutrones.

• Agua que esta unida por enlaces de hidrogeno a la macromolecula, que puede
ser detect ada por espectroscopia Raman 0 infrarrojo.

• Agua que no congela a O°C.


• Agua que difunde mas lentamente que en el seno delliquido.

• Agua que produce ensanchamiento en las lineas de RMN.


IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 113

• Agua que se mueve con la macromolecula en experiment os hidrodinamicos,


tales como viscosimetria, ultracentrifugacion 0 difusion.

• Agua que no contribuye a la permitividad dielectrica por encima de una dada


frecuencia (la cantidad de agua definida cambia con la eleccion de la frecuen-
cia).

• Agua no-solvente, es decir agua que no este disponible como solvente para un
dado soluto. La cantidad de agua varia segun la eleccion del soluto. Tambien
se refiere a agua dentro de la Hamada interaccion preferencial.

• Agua que permanece en el sistema despues de aplicar algun metoda prefijado


de secado.

a)
macrom?bolec~la/ ~-~uto I

1""'- _ ~/

N'-{:
I "'1

~;~~Ivente Seiial de agua


pura
Seiial de agua en
una solucion de
, ...................... I - proteinas
/' \ - I
..... - /
/ -;
\
,---I /'
I

d)
Soluci6n de

-
proteinas
Agua pura

Log frecuencia

Figura IV.I: Algunas definiciones de "agua ligada": (a) Agua en la proximidad de la macro-
molecula que no disuelve un co-soluto. (b) Agua que produce un ensanchamiento de la linea
de rmn. Esto se produce por la interacci6n agua-soluto que produce una disminuci6n de sus
movimientos. (c) Experimento hidrodinamico, el agua que acompana la macromolecula seria
agua 'ligada'. (d) La interacci6n agua-soluto desplaza la linea de relajaci6n dielectric a hacia
las bajas frecuencias.
114 Temas de Biofisicoqufmica

Cada una de las definiciones dadas arriba resulta en cantidades muy diferentes
de "agua ligada" puesto que cada una de ellas analiza diferentes propiedades del
agua. No es posible definir adecuadamente las caracteristicas del agua asociada a las
macromoleculas mediante un unico experimento. Esto se debe a que cada experimen-
to actua en una escala de tiempo diferente analizando propiedades termodinamicas,
dinamicas y estructurales que, si bien relacionadas, no siempre nos indican el mismo
comportamiento.

IV.2. Hidrataci6n especffica y general

Llamaremos hidrataci6n especifica a los casos en que el agua esta unida a sitios
especificos de la macromolecula, e hidrataci6n general cuando el agua, si bien posee
una interaccion importante con la macromolecula, no se encuentra asociada a sitios
en particular (Fig. IV.2).
Estas dos formas de hidratacion no se distinguen por la energia de union sino por
la especificidad.
La hidratacion general y especifica refleja la naturaleza dinamica de la hidrata-
cion. Las moleculas de agua involucradas en la hidratacion especifica tienen mayor
tiempo de residencia en su sitio que las no-especificas, 10 que puede implicar mayor
energia de union 0 razones cineticas para ser retenidas en el sitio. En principio estas
moleculas pueden detectarse experimentalmente y establecer su participacion estruc-
tural. Su permanencia en el sitio hace que posean cierta funcionalidad en relacion
con la macromolecula a la que est an asociadas. Las moleculas que poseen un tiempo
de residencia menor se mueven en el entorno de la macromolecula participando en
la hidratacion general. Estos metodos experiment ales pueden establecer que de al-
guna manera estas moleculas se encuentran alrededor de la macromolecula pero no
es posible detectar sus sitios de union.
Las moleculas de agua que participan en la hidratacion especifica no poseen todas
el mismo grado de localizacion, los tiempos de residencia pueden variar considerable-
mente de un sitio a otro. La figura IV.2 muestra un esquema donde se han marc ado
algunas moleculas con interaccion especifica "enterradas" en la proteina (A). Esto
no significa que permaneceran todo el tiempo en esa posicion, pero ciertamente su
tiempo de residencia sera mayor que la de una molecula, tambien de hidratacion es-
pecifica, localizada en una hendidura (B), la que a su vez tendra un mayor tiempo de
residencia que una de la superficie (C). La accesibilidad de las moleculas del interior
proteico al medio circundante, 10 que determinara el tiempo de vida, depende de los
"movimientos respiratorios" de la proteina (como han dado en llamarse), es decir,
movimiento lentos que involucran grandes porciones de la molecula. Las moleculas
presentes en las hendiduras pueden moverse sin necesidad de grandes movimien-
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 115

to pero dependen del grado de acceso de la ruta hacia el medio. Obviamente las
moleculas de la superficie solamente est an retenidas por sus puentes de hidrogeno y
el escape es mas facil que en los casos anteriores.
La figura IV.2 es solamente un esquema y no se refiere a ninguna proteina en
particular, mas adelante nos referiremos a situaciones especificas donde se puede
establecer la participacion de este tipo de moleculas en la funcion proteica.

a
0 0

Especffica

General

Figura IV.2: Las moleculas de agua que poseen enlaces de hidrogeno con sitios bien definidos
de la macromolecula participan de la hidrataci6n especijica, en tanto que las que no tiene
sitios definidos de union participan de la denominada hidrataci6n general. El agua de hidra-
tacion especifica se encuentra generalmente en el interior de la protein a (A), en hendiduras
(B) 0, en ocasiones, en la superficie (C).

IV.3. La tecnicas experimentales y su escala de tiempo


La figura IV.3 muestra el rango de escala de tiempo de diversas tecnicas expe-
rimentales junto a algunas propiedades dinamicas de la materia a efectos de com-
paracion. Vemos que la difraccion de rayos-X, por ejemplo, opera en una escala de
tiempos larga (entre 19 y 104 s,) en tanto que la relajacion dielectrica cubre un
rango mucho mas amplio y su resolucion temporal alcanza tiempos relativamente
cortos. Dado que ningun metoda experimental cubre todo el rango de tiempo que nos
interesa es evidente que debemos apelar a varios de enos, todos los cuales nos pre-
116 Temas de Biofisicoqufmica

sentanin una imagen del fenomeno observado correspondiente al promedio obtenido


dentro de su escala de tiempo. Debemos tener en cuenta que la escala de tiempo no
es el tiempo que nos lleva ejecutar el experimento sino la resolucion temporal del
fenomeno. En el caso de relajacion dielectrica y resonancia magnetica nuclear, por
ejemplo, el tiempo de resolucion estara determinado por la frecuencia de medicion.

Procesos primarios
Tiempos reflejo en fotosintesis
Tiempos de vida
(impulso nervioso de fluorescencia Relajacion dielectrica
respuesta mecanica) del agua (25°C)
Inercambio de H Relajacion dielectrica
en interior proteico Tiempo de giro de
del hielo (-10 C)

+4 +2 o -2 1-4 -6 -8 -10
j -12
un electron en la
orbita interna delBhor
-14 -16 -20,
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I

Rayos-X RMN
IR - Raman
Relajacion dielectrica
Propiedades Termodinamicas Dispersion inelastica de
neutrones
Dipersion de luz Absorcion ultrasonica

Figura IV.3: Escala de tiempos de algunos procesos. Sobre la linea se muestran algunos
procesos en tanto que debajo de dicha linea se seiiala el range de tiempo que opera cada
uno de los diferentes tipos de experiment os nombrados. Tengase en cuenta que la esc ala de
tiempo es logaritmica. La idea general de la figura esta tomada de Eisenberg y Kauzmann,
The Structure and Properties of Water, Clarendon Press, Oxford, 1969.

IV.4. Estrategias para el estudio de la hidrataci6n

Examinaremos ahora particularmente la hidratacion especifica y su relacion con


la funcionalidad. Debemos tener presente que la ocupacion de los sitios primarios
depende de la disponibilidad del agua, de manera que la hidratacion general juega
un papel importante manteniendo la actividad del agua en el entorno de los sitios
para que est os se encuentren con un grado de ocupacion adecuado. tengamos pre-
sente que nuestro conocimiento sobre la hidratacion es aun insuficiente como para
describir todas sus caracteristicas. Es posible que, en el futuro, determinando tipo de
hidratacion al que actualmente no Ie asignamos funcionalidad alguna se muestre co-
mo de importancia para algun proceso. A medida que nuestro conocimiento sobre el
sistema crece, iremos asignando apropiadamente los roles de los diferentes aspectos
de la hidratacion.
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 117

En general resulta dificil el estudio de las biomacromoleculas en su est ado to-


talmente nativo. Para determinar su estructura por difraccion debemos cristalizar
el material, 10 que produce un condicionamiento que debemos tener en cuenta. Si
bien la informacion extraida es valiosa, ciertamente las macromoleculas no estanin
en el est ado en que las encontramos en la naturaleza. Esto no significa que no po-
damos utilizar tales tecnicas, sino que tenemos que estar en guardia para no atribuir
propiedades al est ado nativo que pueden no ser correctas.
Los experiment os de dispersion de luz, por ejemplo, nos dan una informacion
general sobre el tamarro del sistema en solucion diluida. Los metodos tales como la
dispersion rotatoria optica (RDO) y dicroismo circular (DC) nos aport an datos sobre
la conformacion. Estas tecnicas no nos dan informacion direct a sobre la hidratacion,
pero a traves de las posibles variaciones de la conformacion 0 el est ado hidrodnami-
co frente a cambios en la actividad del agua podemos inferir la influencia de la
hidratacion. La resonancia magnetica nuclear de alta 0 baja resolucion, la resonan-
cia magnetica bidimensional 0 de dispersion resultan muy poderosas para describir
el sistema. Con dichas tecnicas es posible, en situaciones favorables, observar direc-
tamente el comportamiento del agua en las macromoleculas.
Los calculos teoricos y la simulacion computacional son sin duda un elemento
de ayuda de importancia para la comprension del fenomeno, tanto en su totalidad
como en aspectos particulares.
No cabe duda de que el conocimiento de la estructura es un factor importante,
cuando hablamos de estructura no podemos dejar de pensar en las tecnicas de difrac-
cion (rayos X y neutrones). Aun cuando la transicion de las estructuras cristalo-
graficas al comportamiento en solucion debe hacerse con cuidado, estas tecnicas
han contribuido en los ultimos arros a ampliar nuestro conocimiento detallado de la
hidratacion de las biomacromoleculas.
En la figura IV.4 se resume 10 que acabamos de exponer. En 10 que sigue tratare-
mos de desarrollar al menos las tecnicas que nos parecen mas importantes. No obs-
tante y dado que los sistemas complejos como los que intentamos abordar deb en ser
atacados bajo numerosos aspectos, resultara imposible considerar todas las tecnicas
apropiadas al estudio de hidratacion.

IV.5. Hidrataci6n de protefnas en estado s61ido

En el resto del capitulo consideraremos el estudio de la hidratacion de macro-


moleculas bajo diferentes aspectos y en diferentes condiciones. A pesar de que el es-
tado solido no es el mas general de las proteinas en est ado nativo, existen excepciones
importantes tales como el colageno -la proteina mas abundante en los mamiferos- y
la queratina, ambas proteinas fibrilares. No debemos olvidar los carbohidratos, que
118 Temas de Biofisicoqufmica

Estudio de la hidratacion de BiomacromoIeculas

ESTADO TECNICAS

Isotermas de sorci on
Estado solido f---------+ Calorimetria
Crist ales Espectroscopia (IR,Raman) f----
(monocristales y polvo) Difraccion (RX, neutrones)
Fibras
Estado vitreo
f---------+ Simulacion
Relajacion dielectrica f----

[---------+ R.M.N.
Soluciones
Soluciones diluidas
Soluciones concentradas Propiedades termodinamicas
(est ado funcional) [---------+ Espectroscopia de absorcion f----
Propiedades de transporte
Reologia

DESCRIPCION TOTAL
I

Figura IV.4: Esquema de los diferentes enfoques utilizados para el estudio del agua en las
macromoleculas. Todos ellos deberian converger a la soluci6n del problema, el cual no es
posible resolver con una unica tecnica.

en el caso de los vegetales represent an un volumen importante, tanto en su canti-


dad como funcion. Pese a que para el resto de las proteinas, acidos nucleicos, como
tambien para los carbohidratos pequeiios, el est ado nativo corresponde a soluciones
acuosas concentradas, el estudio del est ado solido suele contribuir enormemente a
nuestro conocimiento. No debemos dejar de lado tampoco las aplicaciones que tiene
el estudio del agua de hidratacion en aliment os y medicament os , los cuales se pre-
sentan frecuentemente en est ado solido.

IV.5.1. Sorcion
La isoterma de sorci on es el nivel mas simple de informacion acerca de la hidra-
tacion. Consiste en estudiar el contenido de agua de la muestra para diferentes
presiones de vapor de agua a temperatura constante. Dada su simplicidad y ac-
cesibilidad, esta tecnica ha suministrado una gran cantidad de informacion sobre
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 119

la hidratacion de proteinas. Las isotermas de sorci on son de mucha importancia


pnictica para la industria de aliment os , medicament os y, por ejemplo, la industria
del cuero, puesto que permiten predecir la cantidad de agua que contendra el mate-
rial de acuerdo a las condiciones de humedad a la que esta expuesto.

Tenemos casos donde la sustancia es sorbida por la superficie -adsorcion- 0 pene-


tra en el seno del material-absorcion-. Esta distincion es clara en materiales como el
carbon, en tanto que en una proteina, por ejemplo, la definicion de "superficie" no es
tan clara. Un criterio de distincion entre uno y otro proceso es estudiar la cantidad
sorbida a diferentes grados de granulometria (tamaiio de particulas). Cuando este
aumenta a medida que procedemos a una molienda mas fina, queda claro que est amos
frente a una adsorcion, ya que la cantidad tomada depende de la superficie. En el
caso de las proteinas, el agua penetra en los crist ales 0 cumulos de estas y, por 10
tanto, no depende del tamaiio del grano. En este caso tendriamos una adsorcion, en
tanto consideremos la superficie proteica como la region de captacion. De esa manera
est amos definiendo la superficie a nivel de la macromolecula. A efectos de considerar
ambas situaciones, ya que el tratamiento es comun a ambas, nos referiremos en
general como sorcion.

Figura IV.5: Los cinco tipos de isotermas de acuerdo a la clasificaci6n de Bruanuer mostrando
el cubrimiento en funci6n de la presi6n de vapor relativa. El Tipo I es la isoterma clasica
de Langmuir de "mono cap a" . La del tipo II, con una fuerte sorci6n a bajas presiones de
vapor seguida de una sorci6n debil, es la tipica isoterma de porci6n de agua en protein as y
se la design a frecuentemente como de "multicapa". Las isotermas de tipo I I I indican una
debil interacci6n entre el sorbato y la superficie. Las del tipo IV y V corresponden a las de
los tipos II y III respectivamente cuando se produce condensaci6n capilar, 10 que inhibe la
sorci6n a altas presiones de vapor.
120 Temas de Biofisicoqufmica

EI proceso de sorcion

EI fenomeno de sorcion fue analizado magistralmente por Langmuir [2]. El pro-


ceso se puede describir simplemente como la medicion de la cantidad de mate-
rial depositado sobre una dada superficie en condiciones controladas. Cuando
este proceso se lleva a cabo a temperatura constante (la isoterma de sorcion)
podemos adoptar diversos procedimientos para analizarlo. El material que se
deposita (0 penetra) se 10 denomina sorbato en tanto que el que recibe se 10
llama sorbente.
Se denomina adsorcion cuando el deposito se realiza sobre la superficie y absor-
cion cuando el material penetra dentro el seno del material receptor. Cuando
hablamos de sorcion no est amos distinguiendo ambos procesos, diferenciacion
que no siempre es facil de efectuar. Uno de los criterios que se utiliza es el de
cambiar la granulometria del sorbente. Para el caso de adsorcion, al aumentar
la superficie presente en el sistema la cantidad sorbida deberia aumentar, en
caso contrario estariamos frente a un caso de absorcion. Sin embargo la inter-
pretacion no es unica. Por ejemplo, la sorcion de agua en proteinas no cambia
sustancialmente cambiando la granulometria de la muestra, ya que el agua
penetra hast a llegar a nivel molecular; desde este punta de vista estariamos
frente a una absorcion. Sin embargo, dado que la superficie molecular es grande
frente el tamaiio de la molecula de agua, la lIe gada del agua a la superficie de
la misma puede ser considerada como una adsorcion, proceso para 10 cual no
necesitamos cambiar la granulometria para lograrlo Integramente.
Consideraremos solamente la sorcion de gases por solidos. Conceptualmente
el experimento es simplemente la medicion de la cantidad de agua sorbida a
temperatura constante a diferentes presiones parciales de sorbato. Este es un
metodo sencillo para obtener una informacion preliminar de, por ejemplo, la
hidratacion de sustancias. Pero esta simplicidad no significa que la informacion
no sea valiosa, es posible incluso obtener datos termodinamicos importantes.
Las isotermas de sorcion tienen una gran importancia practica (por ejemplo,
en la industria farmaceutica, de alimentos, curticion, y otras don de la predic-
cion del contenido de agua de acuerdo a las condiciones de almacenamiento y
tratamiento son importantes).
Brunauer [3] clasifico las isotermas en cinco tipos (fig. IV.5), curiosamente
esto fue en realidad un "redescubrimiento" ya que en el trabajo mencionado
de Langmuir todos estos casos estaban previstos.
(continua)
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 121

Sorci on (continuacion)
Es posible a traves de un tratamiento apropiado expresar el comportamiento en terminos de
panimetros utiles. Las deducciones originales, tanto de Langmuir como de Brunauer y co-
labor adores [4] parten de consideraciones cineticas. Consider amos este enfoque inapropiado,
ya que est amos frente a un sistema en equilibrio a y, consecuentemente, deberiamos utilizar
otra metodologia.
Existe un gran numero de expresiones de isotermas (mas de 100) aun cuando todas se
reducen a un as pocas. Una de las expresiones mas utilizadas para las isotermas llamadas de
"multicapas" es la isoterma BET de Brunauer, Emmet and Teller [4], que se expresa como:

n = Nc (pjpo) (IV.l)
[1 + (c -l)pjPo](l - pjpo) ,
donde n es la cantidad de agua captada por la sustancia, N el numero de sitios primarios
de sorcion (malllamado area de monocapa), c una constante caracteristica, p la presion de
vapor Y Po la presion del vapor saturado.
Una expresion justificada apropiadamente a partir de consideraciones mecanico-estadisticas
corresponde a la isoterma de Guggenheim [5]. Formalmente se puede obtener facilmente de
la ecuacion IV.l sustituyendo Po por p*.
En este formalismo tanto p* como c tienen una interpretacion termodinamica siendo:

* [(11m - 11 1 )] (IV.2)
p = poexp RT '
y

(IV.3)

Tenemos entonces la isoterma de Guggengheim como:

n = Nc (pjp*) (IV.4)
[1 + (c - l)pjp*] (1 - pjp*) ,
De alguna manera se podria decir que p* es la medida de las propiedades de la "multicapa"
y c de la primer a capa.
En las ecuaciones IV.2 y IV.3, 11 es el potencial termodinamico estandar, en tanto que los
subindices m, 1 y L indican "multicapa", primer a capa y la fase liquid a respectivamente.
Vemos que para p* = Po el potencial quimico correspondiente al agua que se fija mas
superficialmente es igual que el de la fase liquid a , 10 que es para la isoterma BET una
suposicion inicial, aunque no explicit a en la teoria original.
(continua)

a Aunque, como 10 muestra 1a presencia de histeresis, no se trata de un equilibrio comp1eto.


122 Temas de Biofisicoqufmica

Sorci on (continuacion)
La nomenclatura de "mono cap a" y "multicapa" proviene de la idea de considerar una su-
perficie perfectamente homogenea. La realidad puede ser muy distinta, encontnindonos con
que la superficie puede tener regiones 0 sitios de alta afinidad por el sorbato y otras que no
la tienen, es mucho mas riguroso referirse a sitios primarios y sitios secundarios de sorci6n.
La isoterma de Guggeheim tiene una gran generalidad ya que, con un valor apropiado de
sus parametros, puede describir los tipos I, II y III. Por otra parte est os parametros tienen
una interpretaci6n fisica. La similitud de la forma de la isoterma de Gugenheim (ecuaci6n
IV.4) con la isoterma de BET (ecuaci6n IV.I) no debe Hevar a confusiones.
Histeresis
Es frecuente observar que el camino de desorci6n no coincide con el de sorci6n. Uno y otro
camino forman un lazo Ham ado de histeresis. En general la histeresis se debe a una falta
de equilibrio. Esta falta de equilibrio se produce tanto en materiales bio16gicos como no-
bio16gicos. En el ultimo caso ocurre que el material (por ejemplo, las protein as) sufre una
transformaci6n en el proceso de sec ado y rehidrataci6n que el proceso inverso no puede
recuperar totalmente.

IV.5.2. Sorcion de agua en protefnas y ,kidos nucleicos

Se han realizado muchos estudios de sorci on por biopolimeros, cuyos resultados


se han analizado generalmente mediante la isoterma de BET. La tabla IV.1 muestra
una serie de valores obtenidos en estudios efectuados ya hace tiemp03. Los valores
descriptos para los sitios primarios de sorci on van desde 0,2 a 0,5 moles de aguaj
100 g de peso seco de proteina. Estos sitios primarios de hidratacion pertenecen
presumiblemente al agua de hidratacion fija a sitios especificos. Analizaremos el
problema mas detalladamente y con algunos ejemplos.
De los 20 aminoacidos, 15 de ellos son polares 4 y por 10 tanto son capaces de
interactuar electrostaticamente con el agua. Pauling [6] propuso que se podia fijar
una molecula de agua en cada residuo polar. Si consider amos a esos sitios como
sitios primarios (ver recuadro), el numero que obtendriamos seria del orden del
70 % mayor del que se observa experimentalmente [7]. La discrepancia con los datos
experiment ales que se encuentran en la literatura si se cuentan los grupos polares
como sitios primarios es grande. Esta discrepancia se puede explicar facilmente, ya
que no todos los sitios polares est an expuestos a la superficie.
Las moleculas de agua tienen capacidad para formar buenos puentes de hidrogeno.
Cuando estas est an fijas a sitios primarios, su tiempo de residencia es largo cuando

3Utilizamos la denominaci6n descripta para las propiedades de la isoterma que, en algunos casos,
difiere de la de los trabajos originales.

4Arg, Asn, His, Lys, Asp, GIn, Glu, Gly, Cys, Met, Pro, Ser, Thr, Tyr, Trp
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 123

Cuadra IV.I: El mimero de sitios primarios de sorei6n para diferentes biopolimeros de aeuerdo
a la isoterma de BET expresados en moles de agua por 100 g de peso seeo.
>
BIOPOLIMERO N REFERENCIA
DNA 0.672 a
Lecitina 0.289 a
Lisozima 0.411 a
Hemoglobina 0.320 b
Colageno 0.529 c
Gelatina 0.485 c
Elastina 0.345 c
Seda 0.226 c
Lana 0.336 c
Albumina serica 0.374 c
Albumina de huevo 0.342 c

ap. R. C. Gaseoyne and R. Pethig: J. C. S. Faraday, 173,171, (1977).


bG. Brausse, A. Mayer, T. Nedetzka, P. Sehleteh, and H. Vogel: J. Phys. Chem., 72, 3098,
(1968) .
cH. B. Bull: J. Am Chem. Soc., 66, 1499, (1944).

se las com para con la del agua pura. 5 Esta reduccion de la movilidad implica una
contribucion negativa a la entropia. Para justificar la fijacion preferencial, el agua
de hidratacion debe formar enlaces, los cuales deben ser mas fuertes que en agua
pura. Esto nos muestra que la simple posibilidad de formar puentes de hidrogeno por
la macromolecula no es suficiente como para considerar su pertenencia al grupo de
sitios primarios. Es de esperar que sea necesaria una buena geometria que favorezca
la formaci on de varios puentes de hidrogeno para definir un sitio primario. Existen
otras posibilidades, tales como la existencia de barreras cineticas (en grietas 0 en el
interior proteico) que retarden el intercambio.
Si aceptamos que un sitio primario debe proveer al menos dos puentes de hidrogeno
para la fijacion de agua, podemos concluir que est os sitios producen "puentes de
agua", es decir, situaciones en las que el agua conecta diferentes partes de la macro-
molecula, contribuyendo eventualmente a la estabilidad de la estructura.
Pese a que la isoterma de sorci on es un metoda de "baja resolucion" la informacion
que se puede obtener es valiosa, en tanto que se la analice cuidadosamente. Es
interesante hacer notar que la mayoria de los experiment os de sorcion, incluyendo los
que cit amos en la tabla IV.1, parten de efectuar un vacio severo para secar totalmente

5Debemos recordar el concepto de Samoilov de hidrataci6n positiva definida en §II.2.2.


124 Temas de Biofisicoqufmica

la proteina y luego incorporar agua al ambiente. Se ha demostrado que este proceso


desnaturaliza en forma irreversible la proteina, por 10 que est os experiment os deb en
ser consider ados con cautela (ver el epigrafe de ese capitulo).
La figura IV.6 muestra la isoterma de sorci on de hemoglobina. Esta isoterma se
inicio desde el est ado de alta humedad, de manera que la curva superior corres-
ponde al est ado nativo. Sucesivos ciclos de hidratacion y sec ado recorren las curvas
inferiores pero nunca recuperan el comportamiento del material nativo.

40

--
c

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0


p/po

Figura IV.6: Isoterma de sorci6n de la hemoglobin a, basada en los datos de referencia [13].
La fiechas seiialan la direcci6n en que se realiz6 el procedimiento de sec ado y humectaci6n
en cada etapa. El proceso se inici6 desde el est ado nativo (curva superior).

Luscher [8] mostro mediante el estudio sistematico de varias proteinas que las
isotermas de sorci on repiten la curva del material nativo en tanto que el sec ado
no supere un valor critico. Solamente en estas condiciones el proceso de sec ado es
reversible. El valor limite es de :=:::; 10 % y refleja el minimo de agua necesario para
mantener la estructura. Este valor no es igual al numero de moleculas de agua
minimo que deb en ocupar los sitios primarios responsables de la estructura. La
ocupacion de al menos el 50 % de esos sitios requiere mas moleculas en el entorno
que garanticen el intercambio. De la isoterma de Gugenheim es posible obtener
la fraccion de ocupacion de los sitios para cada contenido de agua total [31] y se
observa que en general el 50 % de ocupacion corresponde al valor observado de 10 %
de agua sobre peso seco establecido por Luscher como valor limite para evitar la
desnaturalizacion observada a traves de la isoterma.
Hemos visto que el sec ado de una proteina hace que las curvas sucesivas de
sorcion-desorcion sigan un camino diferente de la curva original. No debe confundirse
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 125

este comportamiento con el de la histeresis (formada por un equilibro incompleto


del ciclo) , que es el que se observa luego de la desnaturalizacion. Una vez que la
proteina se ha sec ado totalmente el cambio irreversible nos lleva a un material con
un comportamiento diferente.

EI agua y la captaci6n de oXlgeno por hemoglobina y mioglobina

La variacion de las propiedades de la hemoglobina en funcion de su contenido


de agua, tal como se observa en la isoterma de sorcion, es un ejemplo interesante
de la relevancia de la hidratacion en el comportamiento del material biologico. Este
fenomeno de transformacion irreversible se observa en todas las proteinas estudiadas
hast a el momenta con esta tecnica. Sin embargo, la influencia de esta desnaturali-
zacion en la funcion no se ha establecido aun para todas las proteinas. Es claro que
la irreversibilidad en la captacion de agua indica un cambio estructural y, a su vez,
una desnaturalizacion al menos parcial.
La hemoglobina es un ejemplo de libro de texto de una proteina alosterica. 6 El
mecanismo de fijacion de oxigeno se bas a en la cooperatividad de los cuatro grupos
hemo. Esta cooperatividad depende de algun mecanismo de comunicacion entre los
diferentes grupos. Estos caminos de comunicacion no han sido aun dilucidados pese
a que se han efectuado propuestas aun no completamente aceptadas [10]. Lo que
mostraremos a continuacion sugiere que el agua tiene una participacion importante
en el proceso.
Existen resultados experiment ales que muestran sin duda que tanto en solucion
como en peliculas hidratadas se pierden alrededor de 80 moleculas de agua de hidrat-
acion cuando se pierde oxigeno (que se recuperan en la oxigenacion). Asimismo, la
deshidratacion produce la liberacion de oxigeno, aun manteniendo la presion de
oxigeno muy por encima del nivel necesario en condiciones norm ales [11], [12], [13].
El oxigeno que activa la fijacion de mas oxigeno se denomina activador alosterico
homotr6pico. Cuando la hemoglobina se deshidrata, se observa una perdida de la
constante alosterica de activacion. Esto indica que el cambio irreversible, producido
por un sec ado excesivo de la proteina, altera, de alguna manera aun no conocida, la
conexi on entre los grupos hemo. El efecto del agua como activador heterotr6pico es
diferente si la proteina no ha sido secada totalmente nunca 0 si el material ha sido
sec ado previamente.

6El ejecta alasterica consiste en el cambio de afinidad por efecto de una 0 varias moleculas que
se asocian a la proteina. Auque simililar con la cooperatividad es un efecto mas complejo.
126 Temas de Biofisicoqufmica

IV.5.3. Tecnicas de difraccion

La informacion mas direct a de la estructura de cristal y fibras se obtiene mediante


la difraccion de rayos X 0 neutrones. En principio, los patrones de difraccion incluyen
la contribucion del agua. Por razones tecnicas la interpretacion de los resultados de
difraccion con respecto al agua son en parte ambiguos y requieren la contribucion de
otras tecnicas, tales como RMN, relajacion dielectrica y simulacion para describir el
sistema adecuadamente. Puesto que no es posible realizar experiment os de difraccion
en biosistemas nativos, est os metodos deb en ser utilizados para luego exrapolar los
resultados de crist ales 0 fibras al est ado en que se encuentran in vivo.
Una observacion superficial puede llevarnos a considerar que los crist ales tienen
un contenido de agua muy bajo. Sin embargo, el valor tipico del contenido de agua
en una proteina en polvo cristalino es de :=:::; 45 % [17], 10 que no es muy diferente
del valor en los sistemas vivos (tipicamente entre 50 a 60 %) [18]. La diferencia,
sin embargo, es considerable y se debe particularmente al empaquetamiento en el
cristal, donde las condiciones son muy distintas de las que se encuentran en la celula,
generando un comportamiento dinamico que difiere considerablemente.
En est ado solido las interacciones moleculares est an esencialmente dominadas
por la economia del empaquetamiento, 10 que no ocurre en solucion, aun en las mas
concentradas. Asimismo las condiciones de cristalizacion (pH, concentracion y tipo
de sal, etc.) difieren de las del medio natural de las macromoleculas. Por ejemplo, en
el complejo t-RNAasa cristalizado con sulfato de amonio, e180 % en peso se atribuye
al "solvente" [19f cuando en realidad solamente el 50 % es agua. Estas condiciones
ciertamente no corresponden al est ado nativo. Es de esperar cambios importantes,
tanto en el solvente como en la propia macromolecula, aun cuando se puede suponer
que los cambios estructurales en las macromoleculas seran menores que los que se
pueden producir en el agua de hidratacion.
Examinaremos muy brevemente las tecnicas de difraccion. La figura IV.7 A mues-
tra la figura de difraccion de mioglobina. La marca en el centro corresponde al haz
de rayos X; los satelites se deb en a la difraccion de la red cristalina. La estructura
molecular puede, en principio, encontrarse a partir de las medidas de la amplitud
Fj(h, k, C) y la fase Cl'j(h, k, C) de los puntos de difraccion. La distribucion de los
centros de dispersion (electrones para los rayos X y nucleos para neutrones) es:

00

p(x, y, z) = L IFj(h, k, C)I exp[-iaj(h, k, C)]. (IV.5)


j=l

7La presencia de sales en la soluci6n de crecimiento del cristal produce regularmente sefiales de
difracci6n que no pueden distinguirse de las del agua, por 10 que el "solvente" detectado resulta ser
la suma de agua y sales presentes.
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 127

a) b) C)

Figura IV.7: Etapas en la determinacion de la estructura de una protein a mediante rayos X


ejemplificada con la mioglobina. (a) imagen de difraccion. (b) mapa de densidad electronica.
(c) Estructura de alta resolucion.

De los datos experiment ales se puede obtener la amplitud de cada punta de


difraccion a partir de la intensidad de cada mancha que es proporcional a IF(h, k, C) I.
Existen basicamente dos problemas

1. La suma de la ecuacion IV.5 se extiende, en principio, en un numero infinito


de terminos, 10 que requeriria un numero infinito de reflexiones. La intensidad
de las manchas disminuye con la distancia del centro y en la practica solo un
numero finito de reflexiones son observables. Esto limit a la resolucion.

2. La estructura es la transformada inversa de Fourier de F(h, k, C), pero sola-


mente podemos obtener la amplitud de la intensidad de las manchas, en tanto
que el factor de fase Cl'j(h, k, C) se pierde totalmente y es necesario obtenerlo
mediante otra informacion.

El problema de la fase es mucho mas dificil de resolver, particularmente para


grandes estructuras. El procedimiento mas comun es el del reemplazo isom6rfico,
en el cual se insert an diferentes atomos pesados en la macromolecula. Puesto que
los atomos pesados tienen una alta densidad electronica, ellos proveen centros que
son facilmente identificables en el patron de rayos X. Si se pueden identificar las
posiciones de los atomos pesados, es posible reconstruir el arreglo espacial. Diver-
sas metodologias se utilizan para la reconstruccion de la estructura a partir de la
densidad electronica y el posterior refinamiento de la estructura para llegar a la
mayor resolucion compatible con la informacion experimental. El metoda llamado
de reemplazo isomorfico multiple Multiple Isomorphic Replacement (MIR) no puede
ser aplicado en algunos casos, puesto que los crist ales que se obtienen se apart an de-
masiado de la estructura nativa. Otro metodo, de mayores dificultades pero mejores
128 Temas de Biofisicoqufmica

resultados, es el uso de la dispersion anomala de longitudes de onda multiples Multi-


wave Anomalous Dispersion (MAD). Este metoda permite producir una descripcion
de fases apta para obtener realmente alta resolucion.
Debemos tener en cuenta que los atomos del cristal no est an fijos, las coordenadas
que se obtienen son valores medios en tiempo y espacio. Los atomos vi bran alrededor
de sus posiciones de equilibrio por efectos termicos. El movimiento termico aparece
expresado en un volumen cubierto por ese movimiento y se 10 denominan el "factor
termico" B. En realidad el valor de B no solamente depende del movimiento termico
sino que tambien refleja la delocalizacion entre las posiciones de un mismo atomo a
10 largo del cristal ya que las celdas unidad pueden tener cierta dislocacion.
La determinacion del solvente es aun mas dificil. En principio se requiere una
alta resolucion pero tambien nos encontramos con que la movilidad de las moleculas
de agua es mucho mayor que la del resto de la macromolecula y, consecuentemente,
la descripcion precisa del agua es mas compleja. Muchas veces la serral del solvente
esta a nivel de ruido.
Pese a las dificultades que se encuentran en la determinacion de las estructuras por
difraccion, especialmente en la determinacion del sol vente, las estructuras obtenidas
son un buen punta de partida para la dilucidacion del problema.

Ejemplos espedficos: metaloprote(nas


Consideraremos algunos casos en los cuales las moleculas de agua se encuentran
unidas a iones metalicos. Estos juegan en general un papel funcional muy imp or-
tante. Por ejemplo, la coordinacion cuasi tetraedrica del zinc se encuentra en la
car boxi peptidasa-A (deshidrogenasa de higado de caballo) y anhidrasa car bonica
B y C. En est os casos se encuentra una estructura de hidratacion que forma un
reticulado que aport a a la funcion proteica. Veamos un caso en mas detalles.
La anhidrasa carbonica (AC) es un caso particularmente interesante ya que el
agua es tambien sustrato. Se trata de la enzima de mayor actividad conocida que
cataliza la reaccion

(1V.6)
Para realizar la catalisis a la enorme velocidad con que se efectua la enzima debe
contar con un mecanismo que permit a una rapida transferencia de protones. Del
analisis del mecanismo cinetico y su velocidad surge que esta transferencia excede
ellimite de la difusion de prot ones en la solucion. Estas velocidades, sin embargo,
pueden alcanzarse facilmente en un mecanismo de difusion protonica tal como el del
hielo (ver Capitulo 1-1.5). En la figura 1V.8 se muestra el mecanismo propuesto por
Khalifha para la anhidrasa carbonica, mecanismo que -si bien no es concluyente-
es apoyado por los resultados de la estructura de la enzima obtenido por Liljas y
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 129

col., quienes observaron un reticulado de nueve moleculas de agua alrededor del sitio
acti vo (Figura IV. 9). Este mecanismo minimizaria adem as la des com pensacion de
cargas durante la catalisis. La cadena de moleculas de agua permite a la enzima
volver (mediante la protonacion inversa) a su forma activa 10 suficientemente rapido
como para producir la actividad catalitica que se observa experimentalmente.
La existencia de "cables para prot ones" form ados por cadenas de agua pereceria
ser un fenomeno que se manifiesta en diversos procesos biologicos, como veremos
mas adelante.

--
--
H2 0 ~ t HCO·,
EZnOH - » EZnOH 2

Figura IV.S: Mecanismo de catalisis de la anhidrasa carb6nica de acuerdo can Khalifah J.


Bio. Chem. 246, 2561, 1971. El agua en la vecindad inmediata del ion Zn++ participa tanto
como dador como aceptor de protones. Un alto grado de orden se requiere en el agua para
permitir la cinetica suficientemente nipida.

El agua, como resulta obvio, puede actuar con los grupos polares de las macro-
moleculas. Se han observado en muchos casos "puentes de agua" entre grupos polares
internos. Las moleculas de agua hacen posible conexiones entre grupos polares que
se encuentran demasiado lejos como para formar puentes de hidrogeno en forma
directa. Estos puentes salinos mediados por agua ayudan a mantener la estructura
de la macromolecula de manera tal que removiendo estas moleculas de agua por
deshidratacion extrema se puede afectar la estructura de las macromoleculas, como
10 sugieren las isotermas de sorcion. Los "puentes de agua" han sido observados,
entre otras proteinas, en o:-quimotripsina, ;3-tripsina, mioglobina, hemoglobina y
colageno.
La mioglobina ha sido estudiada extensivamente mediante tecnicas de difraccion. 8

8La mioglobina fue la primera proteina cuya estructura se resolvi6 mediante rayos X.
130 Temas de Biofisicoqufmica

Gin 139

Figura IV.9: La estructura del sitio activo de la anhidrasa carb6nica donde se muestran nueve
moleculas de agua con estructura similar a la de hielo h (basada en el trabajo de Liljas y
col. Nature New Biology, 235, 131, 1972.

Puesto que con difraccion de neutrones es posible localizar los prot ones (en realidad
solamente el deuterio, y no los prot ones , tiene la seccion eficaz de coherencia de
dispersion scattering tal como para ser detect ado ). Esta tecnica es cara, compleja y
requiere crist ales de gran tamano (del orden de varios milimetros) pero no produce
dana en los cristales, los que se pueden entonces estudiar por tiempos largos.
Existen datos obtenidos por difraccion de neutrones en la mioglobina que per-
miten estudiar la hidratacion con cierto detalle. Utilizando los datos de Schoenborn y
Hanson [22] hemos estudiado las conexiones entre diferentes grupos de la mioglobina
a traves del agua. La figura IV.10 muestra muy esquematicamente como las cone-
xiones entre diferentes puntos de las cadenas de la mioglobina establecen cadenas
que podrian contribuir a la estabilidad de la estructura.
La mioglobina muestra el mismo comportamiento que la hemoglobina y otras
proteinas en cuanto al contenido de agua. Despues de una deshidratacion profunda
es imposible recuperar el comportamiento del material nativo. Hemos visto que la
isoterma de sorci on nos puede indicar la poblacion de sitios primarios para cada pre-
sion de vapor de agua (y, consecuentemente, para cada contenido total de agua). Es
interesante notar que la irreversibilidad del proceso de sorcion-desorcion se produce
cuando la ocupacion de los sitios primarios cae por debajo de aproximadamente el
50 %. Un estudio cuidadoso de las cadenas de agua en mioglobina [32] establece que
si se cuentan las moleculas de agua detectadas por difraccion de neutrones conec-
tadas al menos por dos puentes de hidrogeno (ya sea directamente 0 a traves de otras
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 131

Figura IV.I0: Representaci6n esquematica de los puentes de agua en la mioglobina. Las


moleculas de agua conectan residuos tanto a traves de una unica 0 varias moleculas de agua
formando cadenas.

moleculas de agua), el numero obtenido es muy similar al determinado mediante la


isoterma de sorcion. Esto nos autoriza a considerar que los puentes de agua en la
mioglobina corresponden a los sitios primarios de sorci on y, por 10 tanto, podemos
utilizar dichos datos para tomar en cuenta la poblacion de las cadenas de agua. Bajo
estas circunstancias podemos ver que si las cadenas de agua contribuyen a soportar
la estructura, la eliminacion de la mitad de ellas puede significar el colapso de la
estructura original.
Nos podremos preguntar si enlaces tan debiles como los que aport an las cadenas
de agua pueden contribuir a la estabilidad
Existen dos aspectos interesantes del efecto estabilizador de est os puentes a la
estructura. Por una parte, tenemos la energia puesta en juego por cada "puente" y
por otra, y relacionado, el tiempo de vida de dichos puentes. Las moleculas de agua
que forman parte de los puentes se intercambian con el resto del agua presente; esta
aseveracion ya se encuentra entre los concept os aceptados, los experiment os que la
soportan senin expuestos mas adelante. Existe una tendencia a considerar solamente
las moleculas "estructurales" como importantes, pero para que estas se encuentren
cumpliendo su funcion debemos contar con el resto de las moleculas del entorno que
permit an la ocupacion casi permanente de los sitios de union. El tiempo de vida de
los puentes de agua es del orden de 10- 6 _10- 7 s. Si los puentes de agua tienen una
vida media breve (con respecto al tiempo de estabilidad molecular) significa que su
energia de enlace es pequeiia, asi como las barreras cineticas. Si la energia de enlace
132 Temas de Biofisicoqufmica

es pequeiia, l.como pueden estabilizar la estructura? Podriamos Hamar a este efecto


el "efecto Gulliver" (Figura IV.11).
Si bien los hilos de los liliputienses son debiles para la fuerza de Gulliver, el con-
junto es suficiente para mantenerlo retenido. Aun cuando periodicamente un numero
de hilos se desprendan simultaneamente, como ocurre con los puentes de agua debido
al intercambio, en tanto se rehaga la conexion, Gulliver continuara apresado. Esta
situacion es bien comun en los sistemas biologicos, donde una multitud de enlaces
debiles y fluctuantes mantiene las estructuras permitiendo, cuando Hega el caso,
reordenarlas con un costa energetico bajo para cada paso de la transformacion.

Figura lV.ll: Gulliver apresado por los liliputienses.

Lo expuesto se ajusta al caso de la hemoglobina cit ado antes. Es posible, y aun


probable, que los puentes de agua no solamente tengan una funcion estructural de
tipo general sino que tambien participen de la comunicacion entre sub-unidades que
permite la operacion cooperativa de los grupos hemo.
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 133

Cuadra IV.2: Algunas prapiedades dielectricas de compuestos seleccionados. Se indica con Eo la


permitividad a frecuencia cera, con f.L el momento dipolar y con T el tiempo de relajaci6n dielectrico.

EO j.lIDebye TiPs
n-Hexano 1,89 0
Benzene 2,234 0
Clorobenzeno 5,649 2,324 11,8
Ni tro benzeno 35,96 4,23 45,3
Agua (30°C) 76,8 1,94 7,2
Agua (20°C) 80,4 1.94 9,3
Agua (lO°C) 84,1 1,94 17,9
Agua (O°C) 88,3 1,94 12,6
Hielo (O°C) 92,0 1,94 2 x 10 7
G licina (en agua) 19,20 49,0
o:-alanina (en agua) 18,6 92,0
Triglycine (en agua) 36,8 258

Ya mencionamos que los datos de difraccion carecen de informacion dinamica,


aunque en casos favorables se pueden inferir ciertos procesos de la estructura. Com-
plementando con resonancia magnetica nuclear y relajacion dielectrica, por ejemplo,
se puede obtener una descripcion mas completa del sistema.

Propiedades dielectricas

Cuando se aplica un campo electrico los dipolos electricos del agua tienden a
orientarse produciendo la polarizacion del medio (ver el recuadro en §I.5, Capitulo
I). En el Capitulo I discutimos el problema de la dependencia de la permitividad del
agua con la frecuencia. En las macromoleculas biologicas, tal como las proteinas, no
solamente el agua asociada a la proteina contribuye a la permeabilidad, sino que los
grupos polares 0 polarizables presentes en la molecula hacen tambien su aporte a la
permitividad total y relajan a su frecuencia caracteristica.
La tabla IV.2lista algunas propiedades dielectricas de interes para unas pocas sus-
tancias. Notese que tanto la permitividad como el tiempo de relajacion difieren mar-
cadamente entre los diferentes compuestos. Esto permite, en algunos casos, analizar
el comportamiento dielectrico de los diferentes compuestos en una mezcla 0 solucion.
Veamos el caso de una proteina hidratada en est ado solido. 9 La proteina en su
interior tiene una permitividad baja (Eo:=:::; 5) en tanto que para el agua "libre" es

9Para el caso puede ser un monocristal, un polvo cristalino 0 un material amorfo.


134 Temas de Biofisicoqufmica

mucho mas alta (Eo:=:::; 76). Los grupos laterales polares cuando la hidratacion es 10
suficientemente alta poseen tambien una movilidad relativamente alta y contribuyen
a la permitividad total, pero con una frecuencia de relajacion que difiere notable-
mente de la rotacion de la proteina completa y de la del agua. Este comportamiento
nos permite obtener una descripcion razonable de la dinamica del sistema.
Comencemos viendo el caso de medidas en un rango restringido de frecuencias. La
figura IV.12 muestra la dependencia de la permitividad de una proteina hidratada
en polvo con el contenido de agua a algunas frecuencias.

a) 0.1 MHz b) 1 MHz c) 10 MHz


e' e' e'

.4 .2

9 H.O/g peso seeo

Figura IV.12: Permitividad dielectric a de albumin a serica bovina en plovo en funci6n del
contenido de agua a diferentes frecuencias. (a) 0,1 MHz; (b) 1 MHz; (c) 10 MHz. (Datos de:
Rosen, Trans. Faraday Soc., 59, 2178, 1963.

De la interseccion de las rectas trazadas por los puntos superiores e inferiores se


puede observar una "hidratacion critica" 0 un "fenomeno umbral". A medida que el
contenido de agua crece, se establece la percolacionlO de tal manera que los electrodos
est an conectados por uno 0 mas caminos a traves del agua y, consecuentemente, la
permitividad crece con el contenido de agua a una razon mayor. Debajo del umbral,
las molecula de agua se distribuyen de una forma no uniforme sobre la superficie
molecular; la interaccion con la superficie restringe la movilidad del agua, de manera
que tales moleculas hacen una contribucion modest a a la permitividad de la muestra.
Cuando se llega al umbral de hidratacion no solamente aparecen moleculas con may-
or movilidad sino que se establecen contactos, generando una polarizacion colectiva
que hace crecer considerablemente la permitividad total. Ademas de 10 menciona-
do, la percolacion permite a los iones desplazarse longitudes mayores contribuyendo
tambien a la polarizacion de la muestra. Notese que si bien la pendiente (particu-
larmente en la parte superior de la curva) varia con la frecuencia, el valor umbral
de hidratacion permanece razonablemente constante. El aumento de la pendiente al
bajar la frecuencia se debe ala contribucion de la polarizacion debida a los iones.

lOExiste percolaci6n cuando se establece contacto entre los elementos de tal forma que se conectan
los extremos.
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 135

Relajaci6n dielectrica

Cuando estudiamos la permitividad en funcion de la frecuencia vemos que los


procesos de polarizacion no se mantienen durante todo el rango. La contribucion
de un proceso de relacion dipolar (0 de otro origen) no puede responder al cam-
bio de orientacion a cierta frecuencia, y por 10 tanto se produce una disminucion
de la permitividad. Este fenomeno de relajacion no se produce para las diferentes
contribuciones simultaneamente sino que pueden estar muy separados entre s1. Este
comportamiento nos permite utilizar las curvas para estudiar la dinamica de los
diferentes componentes con la "espectroscopia dielectrica" . El analisis de un espec-
tro dielectrico no siempre es facil en tanto que en ocasiones los diferentes procesos
se superponen.

Cil

1010
f/Hz

Figura IV.13: Esquema del espectro dielectrico de col age no hidratado. (basado en los datos
de Grigera, Vericat, Hallenga & Berendsen; Biopolymers, 18, 35, 1979).

En la figura IV.13 se muestra un esquema general del espectro dielectrico de


colageno hidratado; se muestra solamente la componente real de la permitividad.
De dicho espectro se puede analizar el comportamiento dinamico de una buena
parte de la proteina. Podemos distinguir claramente tres regiones en el espectro que
corresponden a tres regiones de relajacion, a saber: (i) 100 KHz-5 MHz (ii) sobre
100-1 GHz, (iii) 8 GHz-23 GHz.
La proteina en su conjunto tiene -como todas las proteinas- un momenta dipolar
electrico. Debido a la gran mas a (y gran momenta de inercia) el proceso de relajacion
debido a la rotacion molecular debe contribuir al espectro con una relajacion a
baja frecuencia. Es posible detectar esta contribucion en las soluciones de proteinas;
para los solidos, como en este caso, la relajacion de la proteina como un todo cae
por debajo del rango de frecuencias estudiado. Por 10 tanto, la primer a region de
relajacion que vemos en la figura IV.13 no corresponde a ese efecto.
Uno de los aspectos que debemos tener en cuenta cuando analizamos un espec-
tro dielectrico es el de la posible inhomogeneidad microscopic a del sistema. Esta
situacion aparece tanto en solucion como en est ado solido y produce un efecto de
136 Temas de Biofisicoqufmica

relajacion que no corresponde a una relajacion dipolar. Veremos que ese es el caso
de la relajacion observada entre los 100 kHz y 5 MHz.
Antes que Debye formulara su teoria de relajacion dipolar, Wagner [20] mostrola
existencia de un fenomeno cuyo resultado macroscopico es similar al estudiado por
Debye. La presencia de interfases con discontinuidades en la relacion entre la permi-
tividad y conductividad, el sistema frente a un campo variable muestra una caida
de la permitividad. El fenomeno es simple de entender utilizando los concept os de
moment os dipolares. Cuando aplicamos un campo alterno a un sistema como el
mencionado, las cargas se desplazanin hast a las regiones de interfase donde se pro-
ducira una acumulacion temporaria de las mismas, generando un momenta dipolar
efectivo "ionico". En la medida en que la movilidad de las cargas es suficiente como
para responder a los cambios de la frecuencia, se obtiene un valor de la "permi-
tividad aparente" muy grande. El aumento de la frecuencia por sobre la respuesta
temporal del sistema de cargas hace que esta permitividad aparente caiga. El tiem-
po de relajacion del proceso puede obtenerse analizando la geometria del sistema, y
para un amplio rango de estructuras dicho tiempo es proporcional al cociente entre
la permi ti vidad y la cond ucti vidad (T ex: E/ W) .
En el caso particular del colageno tenemos las fibras con agua en su superficie y
contra-iones. El resto del espacio puede ser aire, para el caso de las humedades ba-
jas, 0 agua, que tambien recibira contra-iones pero cuya conductividad sera diferente
(los contra-iones estaran asociados generalmente a la proteina, por 10 que solamente
una parte de enos pasara al seno del agua). En esta geometria (para ambos casos) se
cumple la relacion T ex: E/W. El analisis de la relajacion en estudio en funcion del cam-
bio de conductividad, ya sea aumentando el contenido de agua 0 adicionando sales,
indica que efectivamente el proceso se debe a un problema interfacial, denominado
ejecta Maxwell- Wagner.
La region intermedia (100 KHz-5 MHz) tiene una particularidad. La variacion de
la serral con la temperatura indica que la amplitud de la permitividad aumenta en
tanto que la frecuencia de relajacion disminuye cuando aumentamos la temperatura.
Esta respuesta a los cambios de temperatura es opuesta al comportamiento de una
relajacion dipolar. El comportamiento tipico de la relajacion dipolar indica una
disminucion de la amplitud debido a que la agitacion termica dificulta la orientacion
de los dipolos para una misma intensidad de campo; al mismo tiempo se observa
que la movilidad de los dipolos es mayor (por ejemplo, disminucion de la friccion
viscosa) aumentando la frecuencia de relajacion) (ver figura IV.14).
Frente a este comportamiento, podemos concluir que se trata del movimiento
de cadenas laterales polares, las que al orientarse contribuyen a la permitividad del
sistema. Cuando se aumenta la temperatura, las cadenas laterales pueden superar in-
teracciones debiles que las fijan a la superficie proteica permitiendo que una porcion
mayor de la cadena pueda moverse. La mayor longitud de la cadena brindara una
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 137

a) b)

Figura IV.14: Visualizaci6n de la respuesta de cadenas later ales a un campo elect rico variable
a diferente temperatura. La temperatura del caso a) es menor que en b).

contribucion positiva a la amplitud en tanto que la mayor longitud y mas a de la


cadena ahora en movimiento dara como resultado una disminucion de la frecuencia
caracteristica. Con el aumento del contenido de agua el sistema se flexibiliza ob-
servandose una respuesta similar con la temperatura pero con mayores amplitudes
y frecuencias, como es de esperar para un sistema de esta naturaleza.
Finalmente llegamos a la region de frecuencias mas altas observadas en este es-
pectro. La respuesta dielectrica en este rango responde a una relajacion dipolar y a
las variaciones en el contenido de agua mostrando que efectivamente corresponde a
la respuesta dielectrica del agua de hidratacion. La frecuencia de relajacion esta en
el rango de unos pocos GHz.
Desde el punta de vista de la hidratacion, es claro que existe una restriccion en la
movilidad del agua. La frecuencia caracteristica es dificil de obtener con exactitud
pero resulta mas baja que la correspondiente al agua libre. No es posible saber si
alguna pequeiia fraccion de agua contribuye a la relajacion a la region de los kHz,
ya que el efecto interfacial oculta toda contribucion menor.
Vemos que del estudio dielectrico podemos concluir que al menos una gran pro-
porcion del agua presente en una proteina solida hidratada posee una movilidad
restringida pero de relativa alta frecuencia. Si comparamos con los resultados de las
isotermas de sorci on vemos que el agua detect ada por metodos dielectricos pertenece
fundamentalmente a la region de hidratacion no-especifica, coincidiendo con la ob-
servacion de que el agua sorbida no posee las mismas propiedades que el agua libre.
Resulta imposible detectar las propiedades del agua fija a sitios primarios de sorcion.
La conclusion final hast a el momenta es que el agua de hidratacion especifica es
una fraccion pequeiia del total del agua presente en una proteina en polvo 0 en un
cristal.
138 Temas de Biofisicoqufmica

IV.5.4. Resonancia magnetica nuclear

La resonancia magnetica nuclear (rmn) es una herramienta muy poderosa y de-


beria ser un auxiliar importantisimo para dilucidar las propiedades de hidratacion.
La posibilidad de discriminar diferentes nucleos, brindar informacion dinamica y, en
casos favorables, estructural, permite ciertamente adentrarse en detalles de hidra-
tacion de mucha relevancia. En esta parte analizaremos algunos resultados de rmn
aplicados al estudio de hidratacion en proteinas en est ado solido.

Aplicacion a prote(nas en estado solido

La resonancia magnetica nuclear ha sido utilizada para el estudio de proteinas


en solucion, polvo, fibras y monocristales. Por razones didacticas desarrollaremos
un ejemplo -colageno- para conectar los resultados con los obtenidos por otras
tecnicas que ya comentamos siguiendo el camino historico. El avance tecnologico
permit a ahora ahorrar varios de los pasos que mencionaremos, pero la comprension
del fenomeno resultara mas clara para los no-especialistas en rmn si seguimos este
camino.
Las proteinas contienen un gran numero de protones, por 10 que esperamos que un
espectro de rmn de proteinas sera muy complejo y ocultara gran parte de la contribu-
cion del agua. Sin embargo, cuando est amos considerando una proteina hidratada
en est ado solido, los prot ones de la proteina (0 al menos su mayoria) contribuiran a
la serral con un ancho de linea extremadamente ancho con relacion a la del agua. El
ancho de las lineas depende del tiempo de relajacion espin-espin (T 2 ) (ver §B.4.1).
Para un solido, el ancho es mucho mas grande que para un fluido, incluido el caso
del agua de hidratacion. Bajo estas circunstancias, la linea correspondiente a los
prot ones de la proteina represent a la linea base de la del agua de hidratacion; este
caso se esquematiza en la figura IV.15.

Figura IV.15: Esquema del espectro de rmn de una protein a salida hidratada. El detalle
muestra el aspecto de la linea correspondiente al agua.

Los tiempos de relajacion, espin-red (T 1 ) y espin-espin (T 2 ,) est an relacionados


con la inversa del tiempo de correlacion rotacional (§B.4.4), de manera que aport an
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 139

una informacion relevante a la dinamica de la hidratacion.


Otra propiedad importante de la rmn es el efecto del desdoblamiento dipolar
(§B.4.2). El desdoblamiento dipolar es una propiedad interesante para el estudio de
la hidratacion. En el pasado este efecto requeria que el sistema pudiese ser orientado
con respecto al campo externo; esto no es necesario para observar el fenomeno me-
diante sistemas pulsados. Dado que la hidratacion especifica puede producir un orden
espacial en las moleculas de agua, es posible mediante rmn describir el fenomeno con
cierto detalle.
Continuaremos con el ejemplo del colageno. El colageno fue la primer a proteina
estudiada mediante rmn [23] a efectos de describir su hidratacion. En esos expe-
rimentos se realizo el estudio de fibras de colageno orientadas respecto del campo
magnetico. El espectro (figura IV.16) muestra tres lineas, una central angosta y
dos laterales producto del desdoblamiento dipolar, mas anchas. La rotacion de la
muestra respecto del campo produce la variacion del valor del desdoblamiento, de
donde se puede extraer informacion sobre el valor promedio de la orientacion de las
moleculas de agua.
La linea central indica que no existe orientacion preferencial, en tanto que su
ancho denota una alta movilidad. Las lineas del desdoblamiento tienen un ancho
que corresponde a un tiempo de correlacion del orden de 10- 7 s. La interpretacion
original proponia la existencia de una fraccion de agua ordenada y de rotacion lenta
-en comparacion con la rotacion del agua libre- y otra fraccion con las caracteristicas
regulares del agua.

Figura IV.16: Espectro de rmn de fibras orientadas de colageno. Se represanta la derivada de


las lineas, tal como se producian en los aparatos de banda ancha.

La explicacion, razonable a la vista de los primeros resultados, se derrumbo con la


aparicion de resultados de colageno hidratado con agua pesada. La serral del deuterio
puede producir desdoblamiento por interaccion cuadrupolar con un comportamiento
con el angulo de orientacion igual al desdoblamiento dipolar. El espectro del colageno
ala frecuencia propia del deuterio exhibe dos lineas, producto de un desdoblamien-
to, pero carece de la linea central. En la region de frecuencias de los prot ones se
140 Temas de Biofisicoqufmica

mantiene la linea angosta que, necesariamente, resulta producto de alguna region de


la prote!na, presumiblemente cadenas laterales, que posee alta movilidad.
Resulta imposible pensar que, incluso a contenidos de agua del orden de 90 %
aguajpeso seco, toda el agua se encuentre ordenada y restringida en su movimiento.
Diversas propuestas se ofrecieron al problema hast a que finalmente el modelo de
intercambio resulto la solucion final. Ya mencionamos (§IV.5.2), aunque sin mucho
detalle, el intercambio del agua de hidratacion. El modelo de intercambio, como se 10
llama, esta actualmente plenamente aceptado. Precisamente las investigaciones sobre
colageno fueron el inicio de un proceso que culmina en la aceptacion generalizada
de dicho modelo.

EI modelo de intercambio
La formulacion rigurosa del modelo de intercambio se bas a en la interpretacion
de los resultados de rmn, tanto en cuanto a los aspectos dinamicos (tiempos de re-
lajacion) como estructurales (los factores de orden de las moleculas de agua). La
interpretacion inicial de dos fracciones de agua con propiedades dinamicas y estruc-
turales diferentes parte de la suposicion de que las dos fracciones poseen propiedades
dinamicas que operan en escalas de tiempo bien diferenciadas. Un compuesto de
bloque de hielo en agua nos dara dos seiiales separadas, ya que pese a que hay inter-
cambio entre los dos "compartimientos" (agua e hielo) ese intercambio se producira a
una frecuencia muy inferior a la de nuestro sistema de deteccion. l l
Supongamos que tenemos diversas fracciones en un sistema que intercambian a
una razon del orden 0 mayor que el tiempo de resolucion de nuestro sistema de
medicion. El tiempo de relajacion de rmn observado sera

1 ""' Pi (IV.7)
Tobs - ~ T(i) ,

donde Tobs es el tiempo de relajacion observado, Pi es la probabilidad de ocurrencia


de la fraccion i, y T(i) el tiempo de relajacion (ya sea Tl 0 T@) de los componentes
de la fraccion i.
Si el movimiento es lento -siempre respecto del tiempo de observacion- obtenemos
una "instantanea" del sistema y el promedio se aplica solamente al espacio, en tanto
que si es rapido debemos promediar sobre el espacio y tiempo. Para fijar ideas
supongamos que se trata de agua fija a sitios primarios que intercambia rapidamente
con el resto del agua de hidratacion.
As! podemos expresar el promedio espacio-temporal de los tiempos en general
(una expresion similar se aplica a tiempos de relajacion dielectrica y otros).

11 Para rmn el tiempo caracteristico esta determinado por la (inversa de la) frecuencia de medici6n.
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 141

Supongamos ahora que tenemos el caso concreto de la hidratacion de una proteina,


en el caso particular el colageno. Consideramos el intercambio -rapido- entre el agua
de los si tios primarios y el resto del agua presente (si tios secundarios). El tiem po de
relajacion espin-espin observado sera

1 j (1 - f)
T,0bs = T,b + T,l ' (IV.8)
2 2 2

donde j es la fraccion de agua presente en los sitios primarios y los superindices de


b y l indican sitios primarios y secundarios.
La expresion IV.8 nos relaciona el tiempo de relajacion espin-espin observado con
los tiempos de relajacion de cada fraccion de agua. Nos aparece un valor experimental
(T2bs) y tres incognitas, el j, T~ y T~. Para poder resolver el problema es necesario
que dos de las incognitas puedan resolverse mediante experiment os independientes.
Con las modernas tecnicas de rmn (con dependencia de la frecuencia y bidimen-
sional, por ejemplo) es posible recabar la informacion completa ya que se introducen
otras variables controlables. Siguiendo el ejemplo historico, indicaremos como se
puede resolver sin apelar a esos metodos.
Los resultados de relajacion electrica nos muestran que la mayor parte del agua
posee una frecuencia de relajacion promedio del orden de 1GHz, 10 que nos indica
una asociacion relativamente debil con la proteina. Concluimos asi que la {mica
fraccion relevante al espectro dielectrico del agua la constituye el agua en sitios
secundarios. Por 10 tanto podemos relacionar el tiempo de relajacion dielectrico de
esta fraccion con el tiempo de relajacion espin-espin de la misma fraccion. La relacion
entre los tiempos de relajacion espin-espin y espin-red y el tiempo de correlacion
rotacional para una situacion como la que est amos tratando ha sido mencionada
en §B.4.2. El tiempo de correlacion rotacional Tc es del mismo orden del tiempo de
relajacion dielectrico Td. 12 El tiempo de relajacion dielectrica experimental es del
orden de 10- 10 para esa fraccion, 10 que resulta en T~ :=:::; 600ms. Ya que el tiempo de
relajacion experimental T 2bs esta por debajo de los 10ms, resulta evidente que, aun
sin conocer el valor exacto, vemos que la contribucion del termino correspondiente
al agua en sitios secundarios en la ecuacion IV.8 puede ser despreciada. Nos rest a
ahora establecer f.
La poblacion de los sitios primarios ha sido estudiada mediante la isoterma de
sorci on y resulta un valor conocido experimentalmente para cada contenido de agua
en la proteina. Por 10 tanto, tenemos finalmente

12La relaci6n entre ambos tiempos es Tc=aTd do de ::; a ::; 3. El valor de a depende del enfoque
te6rico utilizado y aun no existe un acuerdo unanime.
142 Temas de Biofisicoqufmica

~~L (IV.9)
T2 - Tf
Esta relacion permite obtener un valor para el tiempo de relajacion del agua
fija a sitios primarios y de alli el tipo de correlacion rotacional. Nos encontramos
por 10 tanto frente a la situacion que solamente una fraccion cercana al 10 % del
total del agua determina el resultado experimental bajo las condiciones de medici on
utilizadas. Un razonamiento similar nos lleva a que el desdoblamiento observado
corresponde al promedio total dominado por esa pequeiia fraccion. De alli pode-
mos establecer la orientacion promedio de esas dos moleculas de agua cada tres
aminoacidos que hacen de puente entre las diferentes cadenas del colageno.

EI modelo de hidratacion

En la seccion anterior hemos analizado en detalle el proceso que llevo a establecer


el modelo de intercambio aplicado a la hidratacion del colageno. Los resultados y la
interpretacion, altamente convincentes, fueron verificados para un cierto numero de
proteinas (Lisozima [30, 31]' monocristales de hemoglobina [32] y otras) y apoyados
por otros resultados experiment ales sobre colageno, tales como los experiment os de
congelacion [33] y despolarizacion inducida termicamente [34]. Con el advenimiento
de recursos tecnicos mas poderosos el modelo fue confirm ado , yes 10 que podriamos
llamar el modelo "estandar" de hidratacion. Repasemos los puntos destacados del
modelo:

r) El tiempo de residencia de las moleculas de agua es, para el promedio del agua
en sitios primarios, del orden de 10- 7 s.

II) La cantidad de sitios primarios con su poblacion completa corresponde a apro-


ximadamente el diez por ciento de peso seco de proteina (que en el caso del
colageno represent an dos moleculas de agua cada tres aminoacidos).

III) Es posible identificar las posiciones del agua en los sitios primarios.

La relativamente pequeiia proporcion de agua de hidratacion en los sitios primar-


ios tiene una participacion importante en la estructura y funcion de las proteinas,
alguno de cuyos ejemplos hemos mencionado. Por otra parte la identificacion de est os
sitios y sus propiedades es frecuentemente posible ya sea mediante rmn 0 metodos
de difraccion. El modelo de intercambio con solamente dos sitios es muy simplista.
Algunas moleculas de agua se encuentran en el interior de la proteina y poseen un
recambio mucho mas lento que las de la superficie 0 grietas. La inhomogeneidad en
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 143

las energias de enlace, aun de las moleculas superficiales, hara que estas participen
con tiempos de residencia diferentes. Un estudio detallado de los sitios primarios nos
indica que el rango de tiempos de residencia es muy amplio. Sin embargo, el modelo
de dos est ados es un buen punta de partida y permite describir una amplia gama de
situaciones.

I
-N

Figura IV.17: Modelo de hidrataci6n del colageno. Dos moleculas de agua cada tres aminoaci-
dos ocupan sitios haciendo puente entre diferentes cadenas de la triple helice. La figura de la
derecha muestra el modelo construido en base a los datos experiment ales y la de la izquierda
es un detalle de un result ado de simulaci6n por dinamica molecular de un polipeptido tipo
colageno.

Posicion y orienta cion

Una descripcion detallada de las moleculas en sitios especificos requiere mas que
su fraccion y el tiempo de residencia. El modelo de intercambio nos dice que el pasaje
de una fraccion a otra es suficientemente rapido como para que observemos el prome-
dio espacio-temporal entre ambos estados. Esto, que aplicamos a la determinacion
del tiempo de residencia, es valida para la orientacion molecular. Cuando, como en
el caso que hemos descrito, podemos obtener informacion sobre la orientacion media,
podemos aplicar el mismo esquema. Un "parametro de orden" que se puede utilizar
144 Temas de Biofisicoqufmica

esta basado en la expresion del desdoblamiento de la linea por interaccion dipolar


(§B.4.2) que, como dijimos, es valida tambien para el desdoblamiento cuadrupolar.
Para describir completamente la orientacion de las moleculas de agua se requieren
dos parametros de orden 5 = ~ (3 cos 2 0: - 1) donde 0: es, para un caso, el angulo
entre las lineas que conectan los prot ones de la molecula y el campo magnetico ex-
terno, y para el otro, el bisector del angulo HOH. Para los parametros de orden se
cumple que

(IV.I0)

donde sobs es el parametro de orden observado y Si es el parametro de orden de la


especie icon probabilidad de ocurrencia Pi.
Para nuestro caso sabemos que de acuerdo a los resultados de rayos X de fibra,
en los cuales no resulta simple establecer las posiciones de las moleculas de agua,
Ramachandran and Chandrasekharan [29] propusieron un modelo donde dos molecu-
las de agua cada tres aminoacidos forman puente entre dos cadenas diferentes del
colageno. Consideramos entonces estas dos moleculas como pertenecientes a sitios
primarios y podemos escribir entonces

(IV.11)

donde f es la fraccion de ocupacion de cada sitio, SO es el promedio espaciaZ del


parametro de orden de las moleculas de agua "libres" (SO = 0) Y 51 Y 52 correspon-
den al promedio espacial del parametro de orden para cada tipo de molecula fija a
sitios primarios.
Dada la propuesta de Ramachandran y Chandrasekharan, es posible atacar el
problema, resolviendo las ambiguedades del modelo original y confirmando su validez.
El modelo construido en base a rmn, rayos-X y la isoterma de sorci on se mues-
tra en la figura IV.17 donde adem as se ha incorporado una figura obtenida de la
simulacion de un polipeptido tipo colageno [14] donde se muestran las moleculas de
agua haciendo puente entre diferentes cadenas de la triple helice, en acuerdo con el
modelo experimental.
Las moleculas de agua que hacen los puentes inter-cadena producen la estabilidad
de la fibra. Cuando se elimina el agua, el colageno se distorsiona y pierde flexibilidad.
La figura IV.lS muestra la simulacion del polipeptido tipo colageno ya mencionado
en agua y deshidratado donde se puede ver el efecto sobre la estructura de la molecula
(de ref. [14]).
IV. Hidrataci6n de biomacromoUkulas 145

Figura IV.IS: Estructura de un polipeptido tipo colageno obtenida mediante simulaci6n por
dinamica molecular. a) en presencia de agua. a) Deshidratado (de referencia [14])

IV.6. La hidrataci6n: el estado actual

Poniendo junta toda la informacion experimental disponible podemos tratar de


delinear los aspectos salientes de la hidratacion de proteinas, conociendo a priori que
esta imagen global puede ser temporaria; nuevos experiment os e interpretaciones
pueden ampliar 0 descartar gran parte de nuestro panorama actual.
Es indudable que el agua tiene una influencia importante en la estructura y
funcion de las macromoleculas biologicas. Hemos visto que puede ocurrir que los
cambios estructurales se produzcan por la eliminacion del agua capaz de formar
puentes que conectan partes de la proteina, la que se encuentra en intercambio con
el resto del agua presente. Pese a que el agua de hidratacion especifica es solamente
del orden del 10% (aguajpeso seco) , esta posee una influencia muy fuerte en las
propiedades de las macromoleculas.
Los puentes de agua no solamente producen un efecto estructural sino que pueden
actuar como conduct ores de prot ones , como una via nipida para las reacciones.
Vimos el ejemplo de la anhidrasa carbonica, pero este no es el unico ejemplo. En la
146 Temas de Biofisicoqufmica

Cuadra IV.3: Liberaci6n/captura de agua durante cambios conformacionales


Proteina Proceso Moleculas de agua Referencia
Hemoglobina Ox-+--+Deox- 60 [11, 12]
Citochormo c-oxidasa Transferencia electronica 330 [15]
Hexoquinasa Fijacion de glucosa 100 [24,25]
Canal de Na+ acti vacion +--+desacti vacion 730 [16]

aldosa reductasa se encuentran dos "canales" de agua que acceden lateralmente al


sitio activo, que permit irian el intercambio protonico.
La cantidad del agua de hidratacion no solamente cambia cuando las condiciones
externas se alteran, sino que en ocasiones 10 hacen cuando se producen cambios
internos. El ejemplo de la hemoglobina -donde alrededor de 60 moleculas de agua
se movilizan cuando se intercambia oxigeno- no es el unico. La tabla IV.3 muestra
algunos casos donde se observan cambios de hidratacion frente a cambios conform a-
cionales.
La toma y liberacion de agua implica un cambio de volumen que, por ejemplo,
en hemoglobina es del orden de 1800A3 poniendo en juego una energia de aproxi-
madamente 0.2 kcaljmol [11]. Estos cambios ciertamente est an relacionados con la
funcion.
La hidratacion "debil" que constituye la reserva de agua tiene propiedades que
difieren ligeramente del agua "libre" yen algunas circunstancias pueden actuar como
motor para cambios conformacionales, particularmente debido a sus propiedades
como solvente, alteradas frente a la situacion regular.
Esta agua "no solvente", como se la suele Hamar, tiene importancia en la estabi-
lizacion-desestabilizacion molecular. Dado que constituye, desde el punta de vista de
su solubilidad, un nuevo componente de la solucion, el sistema que fuera de dos fases
(agua+co-soluto y proteina) queda conform ado por tres fases: agua+co-soluto, agua
no-sol vente y macromolecula. Cuando el co-soluto queda excluido de la region cir-
cundante a la proteina, la fuerza termodinamica tendera a lograr una conformacion
que minimice la presencia de la tercera fase.
El agua alrededor de la proteina no es no-solvente para cualquier soluto. Por 10
tanto, la presencia de algun co-soluto en particular puede modificar el equilibrio
produciendo estabilizacion (algunos glicoles en proteinas globulares [26]) 0 desesta-
bilizacion (glicoles en estructuras fibrosas) 0 induciendo cambios conformacionales.
El panorama general de hidratacion no es definitivo pero nuevos aportes experi-
mentales, teoricos y computacionales nos permitiran avanzar en el conocimiento del
caso.
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York, 1975 .

• E. Westof, editor Water and Biological Macromolecules. McMillan, Londres,


1993.
Capitulo V

Flujos

.. . l'agua pasa y no se queda.


ATAHUALPA YUPANQUI-RoMILDO RISSO.
El aroma.

Todos los organismos vivos, desde los mas primitivos hast a los mas complejos,
utilizan el agua como vehiculo para el intercambio de nutrientes y desechos. En
los organismos mas complejos el agua circula en la sangre y linfa 0 savia, para la
distribucion de nutrientes, desechos, hormonas regulatorias, etc., en tanto que en
las formas mas primitivas de vida el intercambio se lleva a cabo directamente con
el medio circundante. Tanto en unos como en otros existe un intercambio directo
de las celulas con su entorno, sea este el medio externo 0 el fluido intracorporal, a
traves de las membranas celulares.
Para considerar el problema debemos tener presente primero las leyes que go-
biernan el pasaje de sustancias a traves de una membrana. Dado que los sistemas
biologicos est an fuera del equilibrio, debemos considerar este pasaje de sustancias
en el marco de la termodinamica del no-equilibrio.

V.l. EI concepto de flujo

El fiujo de una sustancia a traves de una superfice se define como la mas a que
pas a por la unidad de superficie en la unidad de tiempo. Se trata entonces de la
variaci6n de la mas a a uno y otro lado de la superfice definida, superficie que puede
ser una superficie real (ej. una membrana) 0 una superficie ideal. Puesto que el flujo
debe definirse con una direccion y sentido, es claro que tiene un caracter vectorial.
Las unidades del flujo resultan igual al producto de concentracion por velocidad.
Dado que la concentracion molar es c = n/vol, donde n es el numero de moles y vol
el volumen, encontramos que n = c x vol y el cociente n/(t x a) = c x vol/(t x a),

151
152 Temas de Biofisicoqufmica

con a igual al area. Es facil ver que las unidades resultantes son iguales al producto
concentracion por velocidad.
El concepto se puede generalizar a flujos en los cuales no se produce transporte
de masa, por ejemplo un flujo magnetico. Insistimos en que el flujo es una magnitud
vectorial, ya que el pasaje se realiza en una direccion y sentido.
Los flujos a traves de las membranas se producen por el efecto de una fuerza
termodinamica. A efectos de enfatizar que no necesariamente se trata de fuerzas
newtonianas (mecanicas) se las denomina Juerzas generalizadas. Estas fuerzas son
gradientes de potenciales termodinamicos, tales como gradientes de presion P, de
temperatura T, de potencial quimico /-l, de concentracion c, de potencial electrico V
u otros.
En un formulacion tradicional el flujo de una sustancia se debe a la accion de
una sola fuerza. Sin embargo. la experiencia nos muestra que esta situacion no
siempre se cumple. Un ejemplo 10 constituyen los efectos termoelectricos. 1 Estos (y
otros) efectos requieren, en un tratamiento clasico, consideraciones ad hoc. Veremos
mas adelante que el formalismo de la termodinamica del no-equilibrio nos permite
incluirlos en un tratamiento general

V.1.1. Flujos y fuerzas generalizadas

Comencemos con un sistema cerrado (sin intercambio de materia ni energia con


el entorno) que contiene una sustancia pura [1]. El sistema esta dividido en dos sub-
sistemas por una membrana de espesor nulo, como se esquematiza en la figura V.l.
Designamos a cada subsistema como A y B. La temperatura, potencial quimico,
volumen y numero de particulas son: TA, /-lA, VA, NA Y TB, /-lB, VB, NB.
Si la membrana esta en una posicion fija, entonces:

constante (V.1)
constante (V.2)
constante (V.3)

Puesto que el sistema no intercambia energia ni materia con el entorno, los valores
tot ales de ambos permanecen constantes,

E = EA + EB = constante, (V.4)

1 Los efectos Peltier y Thompson constituyen la base de las celdas utilizadas para enfriamiento

o calentamiento mediante la aplicaci6n de un campo elect rico y el uso de los pares termoelectricos
para la medici6n de temperatura.
v. Flujos 153

A IN B
NA NB
VA VB
TA TB
JE
EA EB
/-LA /-LB

Figura V.I: Esquema de un sistema formado por una caja cerrada dividida por una membrana
ideal. El sistema contiene solamente una sustancia pero la temperatura y potencial quimico
de la misma en cada parte de la caja es diferente. Se consider a que las propiedades de la
sustancia cambian abruptamente cuando la misma pasa de una region a otra, de tal manera
que cada parte del sistema es homogeneo

N = NA + NB = constante. (V.5)
De acuerdo al segundo principio de la termodinamica sabemos que la entropia
total del sistema no puede disminuir, por 10 tanto sera:

(V.6)
donde el signo igual se cumple solamente para el equilibrio.
El cambio de energia en cada subregion sera:

(V.7)

dEB = (%~;) dSB+ (~~:) dNB, (V.8)

U tilizando las relaciones termodinamicas

(aE)
as
_T
V,N
y (V.g)

obtenemos

dEA = TAdSA + /-LA dNA (V.lO)


dEB = TBdSB + /-LBdNB. (V.11)

De estas relaciones es facil obtener el cambio de entropia para cada subsistema


154 Temas de Biofisicoqufmica

_ dEA-I"AdNA
- TA (V.12)
_ dEB-I"BdNB
TB (V.13)

De V.4 Y V.5 sabemos que dEA = -dEB Y dNA = -dNB, de tal manera que
utilizando (V.6) obtenemos

(V.14)

de donde

(V.15)

Dividiendo la expresion dada en la ecuacion V.14 por el area A de la membrana


podemos definir el flujo de energia y materia como

J _ dNB/dt
N- A ' (V.16)

10 que nos lleva a

¢ = dS/dt = JE (~ _ ~) + IN (/-LA _ /-LB) 2: o. (V.17)


A TB TA TA TB
La ecuacion V.17 represent a el cambio de entropia por unidad de tiempo y unidad
de area como la suma del producto de los flujos por un factor que denominaremos
Juerzas conjugadas. La funcion ¢ es la Juncian de disipacian y tiene un rol prep on-
derante en el formalismo de la Termodinamica del no-equilibrio. 2
Para el sistema considerado, las fuerzas conjugadas son:

1 1
XE --- (V. IS)
TB TA
/-LA /-LB
- - -,
XN (V.19)
TA TB
por 10 tanto podemos escribir a la funcion de disipacion como

(V.20)

2N6tese que hemos indicado el flujo como vector. Esto surge ya que las derivadas de la ener-
gia y materia en la ecuaci6n V.13 corresponden a la componente del gradiente en la direcci6n
perpendicular a la membrana. Estas derivadas corresponden a las fuerzas conjugadas.
v. Flujos 155

donde los productos de flujos por fuerzas son productos escalares entre ambos vec-
tores, consecuentemente la funcion de disipacion es escalar.
En general para N flujos y fuerzas podemos escribir

(V.21)

Dado que los flujos y fuerzas disminuyen cuando el sistema se acerca al equilibrio,
la produccion de entropia se realizara mas rapidamente cuanto el sistema mas lejos
este del mismo. En el equibrio todos los flujos y fuerzas son nulos y, por 10 tanto, la
funcion de disipacion tambien 10 es.
Vemos en las ecuaciones V.lS y V.19 que la fuerza conjugada del flujo de energia
es igual a la diferencia (el gradient e) de la inversa de la temperatura, y la fuerza
conjugada del flujo de materia es igual a la diferencia (el gradient e) entre el cociente
del potencial quimico y la temperatura cambiada de signo. Debe tenerse en cuenta
que solamente para un sistema isotermico esta fuerza depende unicamente de los
valores del potencial quimico.
Nuestro objetivo es encontrar expresiones para los flujos. Puesto que no sabemos
su dependencia funcional, utilizaremos un desarrollo en serie de potencias. Para
varias variables, un desarrollo de Taylor alrededor de cero se expresa como:

Utilizaremos este procedimiento para obtener una expresion general para los flujos
mediante un desarrollo alrededor de cero; para un flujo generico i tenemos

Ji(X 1 , X 2 , ... , Xn) = Li +L LijXj +L L LijkXjXk + ... , (V.23)


j j k

donde hemos definido

(V.24)

f}2 J i
LiJk = f}XJf}Xk
(V.25)
156 Temas de Biofisicoqufmica

Puesto que el desarrollo se realiza alrededor del cero, el primer termino corre-
sponde a J i para Xl, X 2 , ... , Xn = 0, y, consecuentemente, dado que todas las
fuerzas alli son nulas, el primer coeficiente sera Li = Ji(O, 0, 0, ... ,0) = O.
Para un sistema cerca del equilibrio podemos quedarnos en la aproximacion lineal
y despreciar todos los terminos de segundo grado en adelante, obteniendo

Ji = LLijXj . (V.26)
j

Para el caso del ejemplo, donde tenemos solamente dos flujos resulta

LNNXN + LNEXE (V.27)


LENXN + LEEXE. (V.28)

Los coeficientes Li no pueden ser obtenidos teoricamente, son coeficientes fenome-


nol6gicos que dependen del sistema en particular (especialmente de las propiedades
de la membrana). Si los coeficientes cruzados Lij no son nulos, significa que hay
acoplamiento entre distintos tipos de flujo.
Estos coeficientes de acoplamiento responden a las llamdas relaciones reciprocas
de Onsager.

(V.29)
En el marco de la Termodinamica, estas relaciones constituyen un postulado.
Es de hacer notar que la existencia de esta simetria hace que el numero de coefi-
cientes fenomenologicos, a determinar experimentalmente, se yea reducido en forma
considerable.
Otra relacion importante, que se obtiene de la condicion de que la funcion de
disipacion debe ser positiva; esto nos indica que los coeficientes fenomenologicos
correspondientes a las fuerzas conjugadas de los flujos deb en ser positivos.
Simbolicamente tenemos

Lii > o. (V.30)

V.2. EI estado estacionario


Si dejamos evolucionar el sistema libremente dicha evolucion llevara al mismo a
una situacion en la que la totalidad de las fuerzas, y por 10 tanto los flujos, seran
nulos. Habremos llegado al est ado de equilibrio, donde la funcion de disipacion tome
valor cero. El sistema esta en equilibrio.
v. Flujos 157

Podemos mantener una 0 varias fuerzas en un valor constante si aplicamos restric-


ciones externas de tal manera que el sistema evolucione minimizando y finalmente
anulando algunos de los flujos pero, en razon de la accion externa, algunos flujos
seguinin actuando. Estos est ados particulares revisten especial importancia. En es-
tos casos tendremos cierto numero de flujos constantes diferente de cero y otros
nulos. Como resultado, observamos que pese a que el sistema no esta en equilibrio,
muchos parametros que nos interesan, como por ejemplo la concentracion, resultan
independientes del tiempo (aunque pueden no ser iguales en todas las regiones del
sistema). A est os est ados se los denomina estados estacionarios.
Facilmente observamos que si el est ado estacionario esta caracterizado por la
existencia de un cierto numero de flujos nulos, habra diferentes est ados estacionarios
de acuerdo a cuantos flujos se han anulado. Esto nos lleva a definir el orden de un
est ado estacionario.
Generalizando resulta que el equilibrio es un est ado particular de est ado est a-
cionario donde todos los flujos y fuerzas son nulos, a este est ado se 10 denomina
estado estacionario de orden cero. Un sistema con un solo flujo no-nulo sera de or-
den uno, con dos de orden dos y asi sucesivamene. Vemos que cuanto menor sea el
orden del est ado estacionario mas cerca esta el sistema del equilibrio.
Tomemos el ejemplo simple de un sistema con dos flujos y fuerzas.

LnX1 + L 12 X 2, (V.31)
L 21 X 1 + L 22 X 2. (V.32)

cuya funcion de disipacion es

(V.33)

Podemos escribir la funcion de disipacion utilizando las expresiones de los flujos


dadas en las ecuaciones V.31 y V.32

¢ (LnX1+ L 12 X 2)X 1 + (L 12 X 1 + L 22 X 2)X 1 2: 0,


Lnxi + 2L 12 X 2X 1 + L22X~ 2: 0, (V.34)

donde hemos utilizado la relacion L12 = L 21 .


La ecuacion V.34 nos muestra que la funcion de disipacion es una funcion cuadratica
que esta definida positivamente. Si la funcion tiene un extremo, este deb era ser un
minimo.
Consideremos que nuestro sistema esta en est ado estacionario de orden 1, es decir
que uno de los dos flujos presentes es nulo,
158 Temas de Biofisicoqufmica

LnXI + L l2 X 2 = 0, (V.35)
L 2l X I + L 22 X 2 # o. (V.36)

Analizaremos la existencia de extremos en la funcion de disipacion, para 10 que


efectuamos la derivada de la misma respecto de Xl en la expresion dada en la
ecuacion V.34

:;¢ =
uXI
2LnXI + 2L l2 X 2 = 2J I = o. (V.37)

Vemos que para el sistema en est ado estacionario de orden 1 la funcion de disi-
pacion, es decir la produccion de entropia por unidad de tiempo y unidad de area, es
minima. Esta conclusion, que hemos obtenido para un caso particular, se puede gene-
ralizar. El caso trivial es el est ado estacionario de orden cero, el est ado de equilibrio,
donde la produccion de entropia es nula.
Este resultado es en realidad un camino para definir el est ado estacionario como
aquel para el cualla funcion de disipacion es minima para el conjuno de restricciones
aplicadas al sistema. 3

V.3. EI fen6meno osm6tico

En muchas ocasiones el flujo de agua en los sistemas biologicos esta goberna-


do por la presi6n osm6tica. Analicemos el sistema represent ado en la figura V.2.
El compartimiento 1 contiene solamente agua a, en tanto que el compartimiento 2
contiene una solucion acuosa de un soluto s. Separando los dos compartimientos
tenemos una membrana m que llamamos idealmente semi-permeable que es perme-
able solamente al sol vente, en nuestro caso agua. Ambos compartimientos est an a la
misma temperatura T e inicialmente a la misma presion.
La presencia del soluto en el compartimiento 2 hace que la actividad del agua
sea menor que la del agua pura, consecuentemente el potencial quimico del agua
de ambos compartimientos sera diferente y se producira un flujo de agua desde
el compartiemiento 1 al 2. Al ingresar agua en 2 la presion aumentara hast a que el
potencial quimico del agua en ambos compartimientos sera igual y el flujo se detiene.
La diferencia de presion se denomina presi6n osm6tica.
Si en lugar de tener una solucion y solvente puro tenemos dos soluciones de
diferente concentracion, tambien se producira un flujo hast a lograr la igualdad de
los potenciales quimicos a ambos lados de la membrana.

3A esta definici6n suele llamarse Principia de Prigagine.


v. Flujos 159

Agua Soluci6n
M
e
m

0 b
r
a
n
CD
a

Figura V.2: Dos compartimientos separados por una membrana idealmente semi- permeable.

En los sistemas biologicos la situacion no es tan simple, ya que las membranas


que dividen el sistema no necesariamente son idealmente semi-permeables sino que
en muchos caso tienen una cierta permeabilidad al soluto. Tambien nos podemos
encontrar con gradientes termicos. Avanzaremos sobre esos problemas despues de
formalizar la situacion expuesta anteriormente.

V.3.1. La presion osmotica de una solucion

Consideremos el sistema de la figura V.2, el cual se encuentra a temperatura T.


La presion, que inicialmente es igual, la indicaremos como PI y P2.
El potencial quimico de solvente sera:

para el compartimiento 1 (agua pura)

(V.38)
para el compartimiento 2 (solucion)

(V.39)
donde R es la constante universal de los gases y aa la actividad del agua en la
solucion a temperatura T y presion P2.
En el equilibrio ambos potenciales quimicos deb en ser iguales, por 10 que obte-
nemos

(V.40)
reordenando

(V.41)
160 Temas de Biofisicoqufmica

El segundo miembro es la diferencia entre los potenciales quimicos de referencia,


diferencia que aparece ya que ambos se refieren a diferentes valores de la presion.
La variacion del potencial quimico con la presion a temperatura constante es igual
al volumen molar parcial, es decir

( OJ-l*)
op T
_
= Va, (V.42)

donde Va es el volumen molar parcial del solvente.


Resulta entonces que, siempre a temperatura constante,

(V.43)

integrando y reemplazando en la ecuacion V.41 obtenemos

(V.44)
hemos supuesto que el volumen molar parcial es independiente de la presion. 4
A la diferencia entre las presiones a uno y otro lado de la membrana la denomi-
namos presi6n osm6tica II = (P2 - PI) Y la podemos escribir, a partir de la ecuacion
V.44 como

1
II = -=-RTln(aa)r,p. (V.45)
Va

Esta expresion requiere el conocimiento de la actividad del solvente. Sin embargo


para soluciones suficientemente diluidas tales que puedan considerarse ideales, es
posible reemplazar la actividad por la fraccion molar, donde obtenemos:

(V.46)

Debe tenerse en cuenta que la condicion de ideal no se alcanza a la misma dilucion


para cualquier soluto. Esto depende fuertemente de la interaccion intermolecular. Las
soluciones electroliticas poseen dificultades mayores que veremos mas adelante.
Haciendo uso de la relacion Xa = 1 - X s , con Xa la fraccion molar del solvente y
Xs la fraccion molar del soluto, es posible escribir la ecuacion V.46 como

(V.47)

4Esto no es estrictamente cierto para el agua. Dado que: V a (p2 - Pl)[l - W(Pl - P2)] Y puesto
que W = 4 X 10- 5atm, la correcci6n resulta despreciable.
v. Flujos 161

Para una solucion diluida, el argumento del logaritmo (1 - x s ) es cercano a la


unidad, por 10 que es posible escribir 5

(V.4S)

Siguiendo con la condicion de solucion diluida, podemos avanzar mas y considerar


que Xs = ns/(ns + na) ~ Ns/(Na + N s ), con Ns y Na el numero total de moleculas
de soluto y sol vente. Obtenemos 6

1
II~ ( )RTNs . (V.4g)
Va Ns +Na
Pero para una solucion diluida podemos adem as despreciar el numero de molecu-
las del soluto frente a las del solvente, por 10 que el volumen total vt ~ vaNa y
puesto que Ns/vt = Cs , la concentacion molar del soluto en la solucion, llegamos a:

(V. 50)
Esta es la ecuacwn de van't Hoff la que debe tomarse con cautela si nuestra
solucion no cumple la doble condicion de ideal y diluida.
Para las soluciones electroliticas la condicion de idealidad se logra solamente a
diluciones extremadamente bajas, ya que la interaccion electrostatica es muy fuerte.
Por otra parte, la concentracion de particulas para una cierta concentracion de sal
depende del numero de iones en la cual se disocia. Es frecuente escribir la ecuacion
de van't Hoff como:

(V.51)
v es un coeficiente estequiometrico que indica el numero de iones presentes.
Resulta claro que estas expresiones aproximadas tienen una validez restringida
aunque su simplicidad es atrayente. Si hacemos el cociente entre la presion osmotica
real y la presion osmotica ideal (es decir la obtenida mediante la ecuacion V.50)
tenemos

¢ = IIreaz , (V. 52)


IIideaz

podemos escribir

5Recordemos que para x < 1 se cumple que In(l + x) = x - ~x2 + ... que, para valores muy
pequenos de xes: In( 1 + x) c:::' x.

6Para una soluci6n diluida tenemos Ns « N a , en consecuencia Na c:::' Ntotal; por 10 tanto
Ns/[va(Na + N s )] c:::' Ns/(vaNtotal) = Ns/Vtotal = C s , con C s la concentraci6n molar del soluto.
162 Temas de Biofisicoqufmica

(v. 53)
donde ¢ es el coeficiente osm6tico.
El coeficiente osmotico puede determinarse experimentalmente 0 mediante dife-
rentes teorias, pero debe tenerse en cuenta que depende no solamente del soluto en
particular sino adem as de la temperatura y la concentracion de la solucion. Para un
numero limit ado de soluciones existen tablas del coeficiente osmotico que permiten
prepar las soluciones deseadas en forma simplificada. 7 A traves de la Aproximacion
Esferica Media se han desarrollado formulas apropiadas para el computo de coe-
ficientes osmoticos y de actividades ionicas individuales de sales de composicion
arbiraria, particularmente de interes biologico [3].

Soluciones iso-osmoticas

La presion osmotica que hemos definido se refiere a un sistema con dos com-
partimientos separados por una membrana, en uno de los cuales tenemos solvente
puro y en el otro la solucion. Este sistema nos permite definir operacionalmente la
presion osmotica, la que hemos expresado a traves de un analisis termodinamico.
Podemos definir para una solucion la presion osmotica independientemente del dis-
positivo experimental. Definida asi, podemos comparar las presiones osmoticas de
dos soluciones. Dos soluciones se dicen isoosm6ticas si tienen igual presion osmotica.

,
V.4. Osmosis a traves de membranas reales

La membranas idealmente semipermeables son, en la realidad, casi inexistentes.


Los proceso de osmosis en biologia se llevan a cabo a traves de membranas reales,
a traves de las cuales los solutos son capaces de atravesar. Dado que en estas mem-
branas la facilidad de pasaje del agua es mucho mayor que para la mayoria de los
solutos, el fenomeno de osmosis puede ser observado y posee una importancia rele-
vante desde el punta de vista funcional.
El hecho de la falta de idealidad de las membranas hace que en el est ado biologico
funcional el equilibrio osmotico no se alcance, por 10 que el estudio del problema no
puede considerarse desde el punta de vista de la termodinamica del equilibrio.
En el experimento esquematizado en la figura V.2, las presiones a ambos lados
de la membrana varian hast a que se llega a la situacion en la que el flujo de solvente
es nulo cuando se alcanza el equilibrio. Si la membrana deja pasar parte del soluto,
es posible llegar a una situacion en la que el flujo de solvente compensa el flujo de

7Un ejemplo es el de soluciones de glucosa que se tabularon para facilitar la preparaci6n de


soluciones de uso clinico[2].
v. Flujos 163

soluto, por 10 que no se observan variaciones de volumen (0 presion) a ambos lados


de la membrana, pero el sistema no esta en equilibrio.
Analizaremos el sistema a temperatura T considerando la existencia de flujo de
soluto J s , y solvente J a . Dado que est os seran los unicos flujos existentes podemos
escribir la funcion de disipacion como

(V.54)
donde dJ-la y dJ-ls son las fuerzas conjugadas de los flujos de soluto y solvente res-
pectivamente. Recordemos que las fuerzas conjugadas del transporte de materia son
iguales a la diferencia (gradiente) del cociente entre el potencial quimico y la tempe-
ratura. En nuestro caso, dado que la temperatura es constante, tomamos solamente
la diferencia (gradiente) del potencial quimico.
Los flujos se expresan como

Ja = LadJ-la + LasdJ-ls
Js = LasdJ-la + LsdJ-ls. (V. 55)

Si desarrollamos la expresiones para las fuerzas obtenemos

flJ-la = va(P2 - PI) + flRTlna a


flJ-ls = vs(P2 - PI) + flRTlna s , (V. 56)

donde Va Y Vs son los volumenes mol ares parciales del solvente y soluto respect iva-
mente y aa y as, las actividades.
Recordando que flln u = ~u, y considerando una solucion muy diluida es posible
escribir

_ RTflc s
flJ-la = va flP - ,
Cw
_ RTflc s
flJ-ls = v sflP + , (V.57)
Cs

donde flP = P2 - PI es la presion osmotica aparente del sistema con la membrana


rea1 8 , Ca Y Cs son la concentracion molar media de soluto y solvente respectivamene,
y flca y flc s los increment os correspondientes.
De las ecuaciones V.55 - V.57 obtenemos

8Debemos tener presente que la presi6n osm6tica esta definida para el sistema en equilibria.
164 Temas de Biofisicoqufmica

= La (11a fl.p - RT6.Cs)


e a
+ L as (11s fl.p _ RT6.Cs)
C
s

= L as (11a fl.p - RT6.Cs)


e + L (11
S S
fl.p _ RT6.Cs)
C
. (V. 58)
a s

Hasta aqul no hemos hecho mas que escribir explicitamente los flujos de solvente y
soluto a traves de la membrana para nuestro sistema. Estos no son los flujos que nos
interesan en este momenta y, dado que la eleccion de flujos tiene un cierto grado de
arbitrariedad provisto que utilicemos las fuerzas correspondientes, aprovecharemos
de esa propiedad.
Definamos el fiujo de volumen J v , el cual es posible medir experimentalmente.
Tanto el solvente como el soluto inciden en la variacion de volumen en los com-
partimientos. Su contribucion es simple de calcular ya que el producto del numero
de particulas por su volumen molar represent an la contribucion al volumen total.
Teniendo en cuenta esto podemos escribir:

(V. 59)
El otro flujo que debemos considerar es el pasaje de sustancia que no contribuye
ala variacion de volumen JD, que escribimos como

JD = Js _ Ja . (V.60)
Cs Ca

que se denomina flujo de difusi6n 0 de intercambio


Reemplazado estas expresiones en V.54 obtenemos

(V.61)
y para los flujos:

Jv = Lpfl.P + LpDRTfl.c s (V.62)


JD = LpDfl.P+ LDRTfl.c s . (V.63)

Podemos analizar ahora algunos casos particulares.


Si fl.c s es cero

Jv = Lpfl.P
JD = LpDfl.P, (V.64)

El coeficiente Lp es el coeficiente de filtraci6n 0 coeficiente de permeabilidad


hidniulica, tambien Ham ado conductancia hidniulica.
V. Flujos 165

El coeficiente LpD indica el acoplamiento entre los flujos de intercambio y de


volumen; es el efecto de producir un flujo de intercambio bajo presion, es decir, la
separacion de soluto y solvente, y es la base de la ultrafiltraci6n, proceso que se
utiliza para la desalinizacion de aguas.

EI coeficiente de reflexion

Las ecuaciones V.62 y V.63 se utilizan para el estudio de osmosis en membranas no


idealmente semi-permeables. La presion osmotica aparente IIa es la presion requerida
para lograr un flujo de volumen nulo. Fijando J v = 0 en la ecuacion V.620btenemos

IIa LPD) (V.65)


= fl.p = - ( Lp RT fl.c s.

Suponiendo que inicialmente tenemos en una parte del sistema agua pura, fl.c s
es simplemente cs , es decir que la concentracion del soluto es igual al cambio en la
concentracion entre una y otra parte del sistema. Por otra parte, para una solucion
ideal la presion osmotica (en equilibrio) esta dada por la ecuacion de van't Hoff
(ecuacion V.51)

(V.66)

donde hemos indicado con II t a la presion osmotica te6rica


El cociente entre la presion osmotica aparente, medida para el sistema con la
membrana real, y la presion osmotica calculada se denomina coeficiente de refiecci6n
o coeficiente de Staveman, (J, de la membrana estudiada

IIa LpD
(J= - = ---. (V.67)
II t Lp
Este coeficiente es igual a la unidad para una membrana idealmente semi-permeable.
Para una membrana real el coeficiente (J toma un valor entre cero y uno y para casos
muy especiales hast a puede ser negativo. 9
Estas ecuaciones son las que corresponden para cambio de volumen nulo (Jv = 0).
Las soluciones participantes en el sistema se denominan isot6nicas, aunque existe
una presion osmotica. En el caso de las soluciones isoosmoticas, que definimos ante-
riormente, estabamos ante una situacion en la que la propiedad era exclusiva de las
soluciones. En este caso la definicion es valida para una membrana en particular, la
cual esta caracterizada a traves de los coeficientes fenomenologicos.

9N6tense la aparente similaridad y la diferencia entre al coeficiente osm6tico (ec. V. 53) y el


coeficiente de reflexi6n (ec. V.67).
166 Temas de Biofisicoqufmica

V.4.I. Termoosmosis y la presion termoosmotica

Si existe una diferencia de temperatura entre los dos compartimientos de la figura


V.2 se puede generar una diferencia adicional de presion. Esta presi6n termoosm6tica
tiene un efecto importante en los sistemas biologicos.
Usando las ecuaciones V.18 podemos escribir los flujos de materia y de energia
como

Jm = Lm[).(If) + LEm[). (-~)


JE = LEm[). (If) + LE[). (-~) , (V.68)

la produccion de entropia es

(V.69)

Cuando la materia atraviesa la membrana, cada molecula lleva una cantidad


de energia igual a su entalpia molar h, por 10 tanto, el flujo de calor a traves de la
membrana J Q es la diferencia entre el flujo de energia J E Y la energia que transport an
las moleculas que atraviesan la interfase

(V.70)
por 10 tanto

(V.71)
Substituyendo en las ecuaciones V.68 y V.69, tenemos

¢ = Jm { [). ( ; ) + h[)' ( - ~ ) } + JQ[). ( - ~) . (V.72)

Las fuerzas conjugadas son entonces

Xm [)'(;)+h[)'(-~) (V.73)

XQ = [).(-~), (V.74)

Vemos que hemos cambiado el conjunto de pares de flujos y fuerzas. El reemplazo


se efectuo conservando el valor de la funcion de disipacion mediante el reemplazo de
los flujos deseados.
v. Flujos 167

Sabemos que

flJ-l = vflP - sflT, (V.75)

J-l=h-Ts, (V.76)

donde s es la entropia molar.


Para un sistema cerca del equilibrio el incremento fl puede ser tratado como un
diferencial, de manera que obtenemos

(V.77)

fl(-~) (V.78)

Utilizando las ecuaciones V.75 y V.76 con las V.77 y V.78 en las expresiones de
las fuerzas (V.73,V.74), obtenemos

(V.79)

(V.80)

Llegando finalmente a un conjunto de flujos y fuerzas mas conveniente, ya que


podemos expresar las fuerzas en terminos de magnitudes que pueden ser determi-
nadas experimentalmente en forma directa, 10 que no ocurre con el potencial quimico
y la entropia.

Jm = LmV ( b./)+ LmQ (~n


JQ = LmQv (b./) + LQ ('¥f) , (V.81)

Consideraremos dos casos: el primero en donde la temperatura es igual en los dos


compartimientos (en ausencia de gradiente de temperatura) y el segundo en el cual
no hay flujo de materia. Esto nos llevara ados situaciones particulares de interes.
168 Temas de Biofisicoqufmica

Flujo termo-osmotico

En el primer caso f:)..T = 0 por 10 que las ecuaciones V.81 resultan

Jm = Lmfi(b./)
JQ = LmQfi (b./) . (V.82)

Vemos aqul que el flujo de calor se produce incluso para una diferencia de tempe-
ratura igual a cero. Esto se debe a que la materia al pasar a traves de la membrana es
portadora de calor. Para evitar que se produzca un gradiente de temperatura por ese
pasaje se produce un flujo de calor en la direccion opuesta. En est ado estacionario
se encuentra

(V.83)

El valor de Q*, el cociente entre el flujo de calor y materia, depende de la naturale-


za de la membrana y esta directamente relacionado con el coeficiente de temperatura
de la permeabilidad.

La presion termo-osmotica
El segundo caso que analizaremos es aquel en el cual el flujo de materia en el
sistema es nulo. Si partimos de la primer a de las ecuaciones V.81 con J m = 0,
obtenemos

Q*
(V.84)
fiT'

La variacion de la presion con la temperatura debe mantener el flujo de materia


igual a cero. Este efecto es similar a la presion osmotica a temperatura constante,
en la cualla presion previene el pasaje entre los dos compartimientos. Sin embargo,
ahora el sistema no esta en equilibrio y existe una diferencia de temperatura que
debe ser mantenida desde el exterior suministrando calor a un compartimiento y
disipando del otro.
De la ecuacion V.84 obtenemos

Q*f:)..T
f:)..P=---. (V.85)
fiT
V. Flujos 169

Figura V.3: Dos recipientes conteniendo agua pura a diferente temperatura Tl > T 2 . Una
caja cubre ambos recipientes para evitar la perdida de agua del sistema.

Veamos un ejemplo. El sistema esta represent ado en la figura V.3. AquIla "mem-
brana" es la interface aguajaire y el flujo se produce cuando el agua es vaporizada
en el compartimiento 1 y se condensa en el 2.
Asignemos valores numericos a la ecuacion V.84 teniendo en cuenta que en este
caso Q* es el calor latente del agua (L = 582 calorias por gramo = 24.05 litros-
atmosferas por gramo). El volumen molar del agua es v = 0,001 litrojgramo y
asignamos una temperatura T = 298 K. Obtenemos

fl.p 24,05
(V.86)
fl.T 0,001 x 298
-80,6 atm. j grado. (V.87)

Vemos que para una temperatura de tan solo un grado la diferencia de presion
es considerablemente grande.
El resultado es notable, ya que normalmente suponemos, de manera implicita,
que el efecto de la temperatura sera despreciable. Incluso para seres homotermicos,
las celulas con un metabolismo activo pueden generar gradientes de temperatura
que, aparentemente, pueden ser relevantes al balance osmotico.
Es claro que el efecto depende directamente del valor de Q*. El resultado anterior
sorprende en cuanto a que produce un valor grande de la presion termoosmotica;
pero por otra parte, todo es acorde con 10 que esperamos: el agua se mueve desde el
recipiente mas caliente hacia el mas frio. Una sorpresa mayor seria que se produzca
el pasaje del recipiente frio al caliente. En la realidad eso tambien puede ocurrir.
170 Temas de Biofisicoqufmica

Membranas de espesor finito

Hemos consider ado hast a el momenta sistemas en los que la membrana tenia un
espesor infinitesimal y donde los cambios se producian abruptamente al cruzar la
superficie ideal definida por la membrana. Estos sistemas pueden representar mu-
chos casos reales pero no siempre es asi.lO Para una membrana de espesor finito
se producen dos interfaces, una en cada compartimiento, con las correspondientes
discontinuidades. En el interior de la membrana se producen cambios que deb en
ser tenidos en cuenta. En realidad podemos tratar el sistema como de tres com par-
timientos, considerando la membrana como el tercero. Las caracteristicas de los dos
compartimientos cuyas soluciones baiian la membrana, pueden ser tratadas como
hast a ahora donde las propiedades de las sustancias dentro del subsistema (poten-
ciales quimicos, temperatura, presion, etc.) se mantienen constantes dentro de cada
uno de enos. Esto no es estrictamente cierto para la membrana, donde se producen
cambios graduales en ciertas propiedades.
Es posible considerar a la membrana como un solvente de manera de tener una
nueva fase homogenea con propiedades bien definidas y diferente de los otros dos
compartimientos separados por la misma. Suponiendo que se mantiene el equilibrio
en la interfase, aceptamos que la temperatura (T) y el potencial quimico (J-l) senin
continuos en dicha interfase, en tanto que la presion (p), la concentracion (c) y el
potencial electrico (Vel ect ) , si estuviera presente, pueden ser discontiuos.
Analizando el sistema encontramos que el resultado para el cambio de presion
con la temperatura puede ser descripto por la ecuacion V.84 redefiniendo Q* como:

Q* = Qm + flhm, (V.88)

donde Qm es el flujo de calor producido por el flujo de un mol de sustancia en la


membranal1 a temperatura constante (= JQ/J:ldT/dx=O), y flh m es el cambio en
la entalpia molar para la disolucion de la sustancia en la membrana.
Vemos que el efecto de temperaura depende fuertemente de las propiedades de la
membrana.
El valor de Q* puede obtenerse para una membrana en particular midiendo el
flujo de volumen a flT = 0 bajo presion y el flujo de volumen para un gradiente de
temperatura con flp = 0 utilizando

(J v / flT)~p=o -Q*
(V.89)
(J v / flP)~T=O vT

lOEl tratamiento se aplica tambien a una discontinuidad abrupta.

11 Aqui la unica sustancia es agua, pero se puede extender a un sistema multicomponente.


v. Flujos 171

Si se cumple que Q* = Qm + flh m > 0 el efecto termoosmotico producira un flujo


desde el sector caliente al frio, el mismo resultado que obtuvimos previamente, pero
si Q* = Qm + flh m < 0, el resultado sera que el flujo de materia se producira desde
el compartimiento frio al caliente. Esto ocurre si el calor de dilucion de la sustancia
en la membrana es suficientemente negativo, 10 que es posible y aun probable.
En que casos el efecto termoosmotico es relevante para un sistema particular,
no puede establecerse a priori sino despues de analizar el sistema cuidadosamente.
Es, sin embargo, importante considerar la posibilidad y realizar los experiment os
necesarios para dilucidar el caso y no descuidar un efecto que puede llegar a ser
determinante para la interpretacion del fenomeno en su totalidad.

V.5. Analisis compartamental

En las secciones anteriores hemos consider ado el movimiento de sustancias y ener-


gia entre dos subsistemas. Cada uno de esos subsistemas, tal como est an definidos,
constituyen un compartimiento. Los limites establecidos para definir los com par-
timientos son paredes 0 membranas, es decir, elementos fisicos de separacion, por 10
que llamamos a este tipo de compartimientos un compartimiento j(sico. Veremos en
breve que no es el unico tipo de compartimiento que podemos definir.
El elemento mas basico de los seres vivos, la celula, no es en general un unico
compartimiento limit ado por su membrana celular, existen diferentes componentes
tales como el nucleo y las mitocondrias que, a su vez, se encuentran contenidos por
sus propias membranas. Podemos decir que la celula esta compartamentalizada.
Tomemos por ejemplo un compartimiento limit ado de medio circundante, que
consider amos de extension muy grande en relacion con el compartimiento a estudiar.
Un compartimiento de este tipo se denomina reservorio. Una dada sustancia puede
pasar a traves de las barreras fisicas que limit an el compartimiento. Supongamos
que la sustancia a estudiar se encuentra unicamente dentro del compartimiento (ver
figura V.4).
Si el sistema esta a temperatura y presion constante podemos considerar que el
flujo de la sustancia a se debe solamente a la diferencia de potencial quimico de la
misma y, considerando que est amos en condiciones de una solucion ideal, podemos
escribir el flujo a traves de la membrana limitante como

(V.90)

donde hemos consider ado el flujo total y no el flujo por unidad de superficie (de
alli que indicamos con L' el coeficiente fenomenologico)
172 Temas de Biofisicoqufmica

Figura V.4: Esquema de un sistema con un compartimiento inserto en un reservorio. La


sustancia a estudiar se encuentra a tiempo t = 0 en el interior del compartimiento.

Puesto que la concentracion en el reservorio es nula, tenemos que ~c = -c, de


donde:

Ja = -L'c (V.91)
= ~dn/dt = -L'c (V.92)
= dc/dt = -Lc, (V.93)

donde hemos reemplazado ~dn/dt por dc/dt.


Vemos que la ecuacion V.93 es una ecuacion diferencial de primer orden. Podemos
integrarla con las condiciones: para t = 0 ; c(O) = Co y, para t = t ; c = c(t)

dc it
f
C(t) I
- = -L dt, (V.94)
co c a
de donde

In [c~2] = -Lit, (V.95)

que podemos escribir como

c(t) = cae-LIt, (V.96)


notemos que L' se expresa en unidades de l/t.
v. Flujos 173

El coeficiente fenomenologico L se denomina frecuentemente como el coeficiente


de permeabilidad de la membrana.
En la figura V.5 represent amos la ecuacion V.96. Vemos la variacion de la concen-
tracion en el tiempo que como el medio circundante es un reservorio (matematica-
mente de dimension infinita) decae a cero con t ---t 00.

c(0)

L·= 0.2

L·=0.5

o 2 4 6 8 10
tierJllO

Figura V.5: Representaci6n gnifica de la ecuaci6n V.96 para diferentes valores de 1'.

V.5.1. Compartimientos fisicos, qUlmicos y cineticos

Supongamos ahora que tenemos un medio homogeneo conteniendo en solucion


las sustancias quimicamente activas A y B cuya reaccion podemos escribir como

A +B ---t AB (V.97)

donde el complejo AB es estable.


La cinetica de la ecuacion V.97 es una cinetica de primer orden y se represen-
tara con una ecuacion similar a V.96. Si seguimos la evolucion de la reaccion mediante
la medici on de la variacion de la concentracion de A en el tiempo, veremos que la
figura V.5 represent a tal evolucion.
Esa similitud nos pone en una situacion en la cual no es posible distinguir el
comportamiento de una reaccion quimica del de la perdida de sustancia del com par-
timiento fisico que consider amos anteriormente. Decimos que est amos en presencia
de un compartimiento quimico, que no es posible distinguir unicamente con la
observacion de la cinetica sino que es necesario poseer informacion adicional.
174 Temas de Biofisicoqufmica

Es posible, por 10 tanto, definir la existencia de un compartimiento por su com-


portamiento cinetico y 10 denominamos compartimiento cinetico, el cual puede ser
un compartimiento j(sico 0 un compartimiento quimico.
Dado que el interes principal es el estudio de compartimientos fisicos, tenemos que
estar alerta de la posible existencia de compartimientos quimicos que enmascaren la
cinetica de los primeros.

V.5.2. Trazadores

La realizacion de un experimento de anaJisis compartamental requiere que la


medici on de la concentracion no altere las condiciones del sistema en estudio. En
ocasiones es posible medir tales concentraciones, por ejemplo, mediante un sistema
optico que detecte las variaciones de concentracion en una parte del sistema sin
necesidad de extraccion de muestras. Otra alternativa puede ser la medici on de la
conductividad, cuando est amos analizando alguna especie conductora que puede
ser distinguida claramente. En general es necesario el uso de trazadores, es decir,
sustancias cuya concentracion puede ser medida con trazas de la misma. De esta
manera la extraccion de materia puede llegar a ser infima en comparacion con el
volumen total del compartimiento. Un tipo de trazadores muy utilizado son los
trazadores radioactivos. Nos referiremos a est os ultimos, aun cuando debemos tener
presente que existen otras alternativas (trazadores fiuorescentes, por ejemplo).
Un buen trazador debe cumplir ciertas condiciones tales como que no perturbe el
sistema, tanto en su introduccion como en el proceso de medicion, donde es a veces
necesario extraer muestras. Si el trazador no altera el sistema al ser incorporado y
si el metoda de medici on es 10 suficientemente sensible, estas condiciones pueden ser
cumplidas aceptablemente. Tambien se requiere que el sistema no discrimine entre
el trazador y la sustancia a estudiar. Por ejemplo, si estudiamos el pasaje de agua
podemos en general incorporar como trazador agua tritiada (que, como mencionamos
en §I.1.1, la especie marcada sera HTO) ya que solo algunos pocos sistemas est an
en condiciones de discriminar entre una y otra especie. En el caso de trazadores que
decaen, como los radioactivos, debemos considerar si el tiempo de vida del trazador
es 10 suficientemente largo como para considerar su actividad constante durante todo
el experimento, si esto no ocurre deberemos corregir el experimento por decaimiento
de la radioactividad.
El analisis compartamental se lleva a cabo en general en sistemas en est ado
estacionario. La presencia del trazador no debe, si es apropiado, modificar este est ado
general, aun cuando con respecto al trazador esta en un est ado no estacionario.
En estas condiciones el trazador se mueve siguiendo una cinetica de primer orden,
independientemente del mecanismo de pasaje de la sustancia a traves de las barreras
existentes.
v. Flujos 175

R a)

1
klO
Figura V.6: Dos modelos teoricos diferentes correspondientes a diferentes sistemas reales.

Se define la actividad especifica del trazador de la sustancia i como


p.,
p.* =Pi
- (V.98)
, Ci

donde Pi es la concentracion de trazador, Ci es la concentracion total de la sustancia


i (marcada y no marcada), Pi la cantidad de trazador y ni el total de sustancia en un
dado volumen. Una sustancia que contiene isotopos radiactivos se la llama marcada.
La actividad especifica se expresa en numero de cuentas radiactivas por unidad
de concentracion (cuentas por minuto/gramo) 0 en unidades de radiacion por mol
(ej. Curie/mol - J-lC / mmol).
Dada una sustancia marcada, si incorporamos mayor cantidad de la misma que
no contenga el isotopo radiactivo, es claro que la actividad especifica disminuye.
Este proceso es el de diluci6n isot6pica.

V.5.3. Modelos

El estudio de un sistema dado desde el punta de vista del anaJisis comparta-


mental requiere, como en todo caso, la formulacion de un modelo que represente el
sistema. En nuestro caso existen dos tipos de modelo: el modelo te6rico y el modelo
matematico
El modelo fisico es la descripcion del sistema en terminos de las posibles barreras
y los flujos participantes. En otras palabras, es la representacion del comportamiento
cinetico del sistema. La figura V.6 muestra dos esquemas de modelo teorico para dos
sistemas diferentes.
A cada modelo teorico corresponde un modelo matematico, el cual consiste en
el sistema de ecuaciones diferenciales que describen el sistema teorico para el cual
fue diseiiado. El modelo matematico correspondiente al modelo teorico de la figura
V.6-a se puede escribir como sigue.
176 Temas de Biofisicoqufmica

El modelo es muy similar al que estudiamos en la seccion V.5 con la diferencia


de que en lugar de un reservorio tenemos un compartimiento finito. Puesto que los
volumenes de los compartimientos 1 y 2 son iguales, es CI = ndv y C2 = n2/v Y pode-
mos reemplazar el numero de moles por concentraciones en ambos compartimientos,
tal como 10 hicimos anteriormente. Tendremos:

Ja = L/~c (V.99)
= dc/dt = L(C2 - CI). (V.100)

En este caso simple el modelo esta represent ado con esta ecuacion, que podemos
resolver con facilidad. 12 Dado que CI + C2 = Co, tenemos que C2 = Co - CI, por 10 que
resulta

dc/dt = -L'(2c - co) (V.101)


donde hemos hecho C = CI, ya que resolveremos la ecuacion para encontrar la con-
centracion en el compartimiento 1 en el tiempo. Obtenemos:

f co
C(t) _d_c_
2c - Co
= -L' rt
Jo
dt. (V.102)

Integrando

liln [2C _ co] [t) (V.103)

l{ In [2C(t) -co]} - {In [2CO -co]} = -L't (V.104)

~ In [2C(t) - C(t)] = -L't (V.105)


2 Co

finalmente

Co -2L't Co
c ()
t = -e
2
+-
2
(V.106)

12Muchos autores describen los modelos matematicos en terminos de constantes cineticas que
suelen homologarse a "flujos unidireccionales". Este planteo, si bien lleva a los mismos resultados
finales, genera la idea de la existencia real de esos flujos, cosa que no esta de acuerdo con el
tratamiento termodinamico donde definimos los flujos como un pasaje neto de un compartimiento
a otro.
V. Flujos 177

c(O)

L'=O,2

L'=2 L'=O,5
c(OY2

10 15
tiempo

Figura V.7: Representaci6n gnifica de la ecuaci6n V.I06 para diferentes valores de 1'.

Este caso se puede generalizar facilmente para el caso de volumenes diferentes,


para 10 cual deberemos trabajar con la cantidad de sustancia n en lugar de la con-
centracion. El (simple) ejercicio queda a cargo del lector.
A cada sistema fisico Ie corresponde un modelo teorico y un modelo matematico,
pero la reciproca no es cierta. Puede ocurrir que un modelo matematico responda
a diferentes modelos teoricos. Esto significa que el analisis cinetico que describe el
comportamiento del sistema, si bien puede corresponder a un modelo matematico
que esta de acuerdo con el modelo teorico, no nos asegura que sea unico. Deben
adoptarse diversos enfoques experiment ales para asegurar que modelo teorico elegido
corresponde a un modelo fisico aplicable al modelo.

V.5.4. EI procedimiento

En terminos generales la conduccion de un experimento para el estudio de analisis


compartamental puede resumirse en pocas palabras. Una vez definido el sistema se
deb en proyectar las medici ones cuidadosamente y eligiendo la metodologia que nos
parece mas apropiada. Hecho esto, se efectuan las medidas que, en este caso, seran
las curvas de captacion 0 perdida de actividad de un compartimiento accesible en
funcion del tiempo. Estas "curvas" son en realidad una coleccion de puntos en el
plano concentracion-tiempo. Estos puntos est an sujetos a errores experiment ales y
la calidad de la curva que podemos obtener depende de dichos errores.
Debemos plant ear un modelo teorico para 10 cual nos apoyaremos en toda la evi-
dencia disponible del sistema, y formular el modelo matematico que Ie corresponde.
La comparacion entre las curvas obtenidas del modelo matematico y los puntos ex-
178 Temas de Biofisicoqufmica

perimentales nos danin una indicacion sobre la plausibilidad del modelo planteado.
Debe tenerse en cuenta que ciertos aspectos del modelo pueden aparecer ocultos
en las curvas experiment ales debido al error introducido. Un numero de panimetros
a ajustar excesivo no permite obtener resultados concluyentes. Es esencial obtener
informacion adicional, a menos que surja un resultado muy claro.

Captacion y lavado

En la realizacion de un experimento como el que nos ocupa debemos definir


los planes de accion teniendo en cuenta tanto las condiciones del sistema como
nuestras posibilidades de medicion. Un aspecto importante es la medici on de la
variacion de concentraciones en el tiempo. Algunos sistemas nos permiten realizar
un seguimiento continuo mediante medici ones opticas, conductividad u otro metoda
apropiado. Cuando tenemos que tomar muestras, debemos ser cautelosos para que
esa toma de muestras no altere el est ado del sistema y, por esa razon, los marc adores
que permiten manejarse con pequeiiisimos volumenes son de gran valor.
Se puede (0 debe, segun las circunstancias) realizar la incorporacion de marcacion
al sistema. El caso tipico es un sistema celular (podemos, para fijar ideas, cons ide-
rar globulos rojos). Si sumergimos las celulas en un recipiente con un marcador
apropiado, la sustancia marcada penetrara en las mismas. Las variaciones de la
concentracion en el proceso de captacion tendra el aspecto que se muestra en la
figura V.8. Para el caso a, el recipiente con la sustancia marcada es un reservorio,
el cual, debido a su tamaiio, consider amos que mantiene constante la concentracion
de la sustancia marcada. La concentracion final, tanto en las celulas como en el
reservorio sera igual que la inicial del reservorio. 13 Para el caso b el volumen del
recipiente es comparable con el volumen celular y cuando se llega al equilibrio (del
marcador) la concentracion del recipiente circundante habra disminuido.
Supongamos ahora que tomamos las celulas del experimento anterior y las sumergi-
mos en un recipiente con la sustancia "fria" (es decir, sin marcador). Las celulas
perderan sustancia marcada ya sea para eliminarla totalmente (para el caso de un
reservorio) 0 como para llegar a un est ado de equilibrio con el entorno (recipiente
de tamaiio finito). Ambos casos se muestran en la figura v.g.
l.Cuando utilizaremos uno u otro experimento? Vemos que en el ejemplo anterior
la medici on de la captacion requiere la toma de muestra de celulas. La medici on
del trazador en las celulas tomadas requiere un lavado superficial para eliminar el
marcador contenido en el liquido del medio arrastrado en la toma de muestras.
Asimismo, si el numero de celulas retiradas es relativamente grande a 10 largo del

13Es evidente que esta aseveraci6n es valida dentro de la precisi6n de las medidas y ese es el
sentido de "tamano infinito" del reservorio.
v. Flujos 179

=
. .:.;:. "". . .
Co ..-............................. =....~
.. - - - I ·5
·5
'0

I !
tiemp:>
tiffilJXl

a) b)

Figura V.S: Curvas de captaci6n: a) para un sistema en un reservorio; b) para un sistema en


un recipiente de tamano finito.

'",
Co

">~g

!
·5

i8 .==~---Icfrn
o~--------------~ o~----,,~_=o~----~

a) b)

Figura V.9: Curvas de lavado: a) para un sistema en un reservorio; b) para un sistema en un


recipiente de tamano finito.

experimento deberiamos efectuar las correcciones pertinentes.


Para el experimento de lavado (que requiere una captacion previa 0 que no nece-
sita la medici on) utilizando un recipiente de tamano adecuado, podremos seguir el
proceso tomando muestras de volumen pequeno con respecto al bano circundante.
El volumen extraido debe ser tal que no altere, dentro del error experimental, los
valores de concentacion en el bano. Es obvio que no podemos hacer este experimento
con un reservorio, el cual mantendra la concentracion constante.
De 10 antedicho pareceria que la opcion entre captacion 0 lavado es {mica, pero no
es as!. Si tenemos un caso donde las concentraciones interiores son mucho mas altas
(en est ado estacionario) que las del entorno, la captacion es un mecanismo idoneo
para el estudio del pasaje.
Bibliograffa

[1] T. Hill, Thermodynamics for Chemists and Biologists, Addison-Wesley, Read-


ing, 1968.

[2] Documenta Geigy. Tablas Cientificas 6. ed. J.R. Geigy S.A., Basel, Switzerland,
1965.

[3] J.R. Grigera, Life Sciences, 60, 1567, 1992.

Lecturas suplementarias

• D.C. Spanner, Introduction to Thermodynamics, Academic Press, London


1964.

• A. Katchalsky & P.F. Curran, Nonequilibrium Thermodynamics in Biophysics,


Harvard University Press, Cambridge MA, 1967.

• S.R. de Groot, Termodinamica de los procesos irreversibles Editorial Alham-


bra, Madrid 1968.

• 1. Prigogine, Thermodynamics of Irreversible Processes. Interscience.

• D. Jou & J. E. Llebot, Introduccion a la Termodinamica de Pocesos Biologicos,


Labor, Barcelona 1989.

• G.L. Atkins, Multicompartment Models for Biological Systems, Meuten Lon-


don, 1969.

181
Capitulo VI

Transporte a traves de membranas


celulares

La membrana celular limit a la celula con el medio circundante. Su funcion es


extremadamente compleja ya que es un agente de regulacion del contenido celular
que no actua solamente como un elemento pasivo sino que participa activamente
en el control del pasaje de sustancias, constituyendo uno de los organos celulares.
La primer a funcion que se Ie atribuyo fue la de mantener el contenido celular y
actuar como una membrana semipermeable. Esta funcion es real pero no es la unica.
Veremos algunos de los aspectos del pasaje de sustancias a traves de la membrana
comenzando por el mecanismo mas simple de pasaje que se denomina tmnsporte
pasivo, este mecanismo tambien ocurre en una membrana inerte.

VI.1. Transporte pasivo

Difusion simple

El mecanismo mas simple de pasaje de sustancias a traves de cualquier membrana


es el Ham ado de difusi6n simple y responde a la Ley de Fick y que escribimos a
temperatura constante como

(Vr.1)
donde hemos indicado con Pi al coeficiente fenomenologico del componente i, que
Hamaremos permeabilidad de la membrana y ~Ci = C~i) - c~i) a la diferencia de
concentracion de la componente i a ambos lados de la membrana. Claramente es-
tamos adoptando una formulacion muy simple en la que despreciamos todo posible
acoplamiento entre flujos y consider amos que la fuerza termodinamica para el pasaje
puede escribirse como la diferencia de concentracion.

183
184 Temas de Biofisicoqufmica

La ecuacion Vr.1 es una ecuacion lineal en ~Ci que, obviamente, se puede repre-
sentar en el plano ~Ci' J i con un recta de pendiente Pi que pas a por el origen (Fig.
Vr.1). Hablamos de un caso de difusi6n simple.

Difusion facilitada

Supongamos ahora que, en las mismas condiciones que en el caso anterior, la


membrana posee poros por donde puede pasar la sustancia. Aceptemos asimismo
que el numero de poros es limitado, de tal suerte que la superficie efectiva de difusion
es relativamente escasa.
Si ahora estudiamos el flujo en funcion de la diferencia de concentracion, puede
ocurrir que para valores bajos de esa diferencia el pasaje sea muy nipido ya que
la sustancia encuentra poros por donde difundir sin tener que atravesar la estruc-
tura membranosa. Sin embargo, el comportamiento lineal puede ser limitado, en
tanto que, al existir un numero finito de poros, est os pueden saturarse. El resultado
sera que la curva llega a una meseta. Se dice que est amos en presencia de una difusi6n
facilitada ya que la presencia de los poros, en este caso, ayuda al pasaje, puesto que
la difusion a traves del agua que rellena los poros es, en principio, mas facil que la
difusion a traves de la trama de la membrana. El fenomeno de saturacion es una
caracteristica de este proceso. Tengamos en cuenta que el mecanismo de pasaje no
ha cambiado y que la unica fuerza termodinamica que consider amos es diferencia de
concentracion; seguimos frente a un mecanismo pasivo. En la figura Vr.1 mostramos
dos curvas comparativas de una difusion simple y una difusion facilitada.

4~----------~---------------'

""""""""""""""""""""""~\'l~r,,,

/
J

Difusi6n facilitada

O+----+----~--~--~----+----i
o 10

Figura Vr.I: Difusi6n simple y difusi6n facilitada a traves de una membrana que separa dos
compartimientos 1 y 2.
VI. Ttansporte 185

1 membrana 2

pI
Cl = [51] ---t 5+T ~ T+5 ---t C2 [52]
kl1lk-l p
kl1lk-l
5T ~ 5T

Figura VI.2: Esquema del mecanismo cinetico de la difusi6n facilitada.

La forma de la curva de flujo versus concentracion nos recuerda una cinetica de


Michaelis-Menten.
Los poros no son ni el unico ni el mas frecuente mecanismo que da lugar a difusion
facilitada. Otra alternativa es la existencia de "transport adores" que nos sirven para
formular en terminos mas generales el problema.
Consideremos un sistema compuesto de una membrana que separa dos compar-
timientos 1 y 2. A cada lado de la membrana tenemos una sustancia 5 con concen-
traciones Cl > C2. En el interior de la membrana existen elementos T que llamaremos
transportadores que pueden formar complejos con 5, es decir

(VI.2)

Para fijar ideas supongamos adem as que la sustancia 5 no penetra en la mem-


brana (1a penetracion en la membrana requiere un cierto grado de solubilizacion),
como consecuencia, la permeabilidad sera muy baja. El complejo 5T, por otra parte,
es perfectamente soluble en la membrana.
Para analizar el sistema tomamos tres compartimientos, el de la derecha (1),
la membrana y el de la izquierda (2). Observemos el esquema de la figura VI.2.
La sustancia 5 se acerca a la membrana desde el compartimiento 1 (concentracion
Cl) y se asocia al transportador. El complejo 5T se formara con una constante de
eqUll no K m = Tl'
'l'b' k-l

Mirando la figura desde al izquierda, la sustancia 5 se encuentra sobre la mem-


brana con el transportador y se forma el complejo 5T (hacia abajo en la figura) el
complejo se encuentra entonces a mayor concentracion en la superficie 1 dentro de la
membrana y difunde (con constante P) hacia la superficie en contacto con el baiio
del compartimiento 2. Alli puede producirse disociacion y liberacion al medio y el
transportador estara en condiciones de retornar a la superficie 1 (10 que hara con
una constante P'). Es evidente que todos los procesos son reversibles, pero, dado
que la concentracion de 5 es mayor en el lado 1, la probabilidad de que se forme
186 Temas de Biofisicoqufmica

el complejo en 1 es mayor que en 2. Eso produce una diferencia de concentracion


del complejo que facilita el flujo hacia el lado 2, donde se puede disociar (debemos
recordar que 8 tiene afinidad por el medio acuoso).
Si el complejo tiene una solubilidad igual a la del transportador, la permeabilidad
sera tambien igual (P = Pi) y, suponiendo que la asociacion-disociacion es mucho
mas rapida que la permeabilidad, la etapa limitante del proceso sera precisamente
la permeabilidad.
Suponemos adem as que el transportador se asocia solamente con una molecula 8
por vez (es decir, es monovalente). A una dada concentracion tendremos una fraccion
fh de transportador ocupado en ellado 1 y otra fraccion (1- ( 1 ) como transportador
libre T. Una situacion similar ocurrira en ellado 2, donde las fracciones de T en el
complejo y libre seran O2 y (1 - ( 2 ) respectivamente. El flujo del complejo sera

J = P(02 - (1)T. (VI.3)

La cantidad de complejo en el lado 1 depende de la velocidad de formaci on del


mismo que, a su vez, es funcion de la constante de formaci on kl' de la fraccion de
transportador libre (1 - (1)T y de la concentracion de 8 1 , es decir

(VI.4)

La velocidad de disociacion, por otra parte, es funcion de la cantidad de complejo


(que expresamos con la fraccion de transportador en el complejo ( 1 ) y de la constante
de disociacion k-l

(VI.5)

En equilibrio es VI = V-I de donde, resolviendo VI.4 y VI.5 para 0, recordando


que Km = k~l , resulta

o_ 81 (VI.6)
1 - 8 1 +Km
Exactamente el mismo razonamiento nos lleva a que en la cara 2 tendremos

o_ 82 (VI.7)
2 - 8 2 +Km
Utilizando est os valores en la ecuacion VI.3 obtenemos

(VI.8)
VI. Ttansporte 187

Pero la concentracion del transportador, dado que se distribuye libremente dentro


de la membrana, tiene igual concentracion a ambos lados, es decir T1 = T2 = T, Y
obtenemos

(VI.9)

El maximo valor del flujo segun la ecuacion VI.9 se obtiene cuando 82 = 0 Y


81 » K m , resultando J max = PT, por 10 tanto

(VI.10)

El proceso de difusion facilitada se caracteriza por tener un flujo maximo, debido


a la saturacion de los transport adores , poros, etc.
Vemos que si el compartimiento 2 es un reservorio con 82 = 0 la ecuacion VI.10
se reduce ala clasica ecuacion de Michaelis-Menten. Es posible obtener informacion
tanto sobre el flujo maximo J max como de la constante Km a partir de datos a tiem-
pos bajos (donde se puede considerar 82 = 0) mediante los metodos para analizar
las constantes cineticas en una ecuacion de ese tipo.

Contra-tra nsporte

Una consecuencia interesante del proceso de difusion facilitada ocurre cuando


existen dos sustancias que el transportador no puede distinguir. En ese caso la fuerza
termodinamica que produce el flujo sera la diferencia de concentracion total (es decir
de la suma de ambas sustancias). Puede ocurrir, por 10 tanto, que se produzca un
pasaje para una de ellas desde el compartimiento de menor concentracion (para esa
sustancia y no el total) al de mayor concentracion. Este proceso se 10 denomina
contra-transporte y es un caso interesante de transporte pasivo.

V1.2. Transporte activo

Una celula viva no se encuentra en equilibrio con el medio circundante. Sin em-
bargo, la composicion de la misma es considerablemente estable, 10 que se evidencia
claramente en el contenido ionco en su interior. Esto se debe a que se mantiene un
est ado estacionario, el que, como hemos visto, es un est ado en el cualla produccion
de entropia es minima para las restricciones externas del sistema. El mantenimiento
de este est ado estacionario no puede sino hacerse mediante el consumo de energia,
cuya fuente, en la celula, es el propio metabolismo.
188 Temas de Biofisicoqufmica

Para mantener constante la composicion, por ejemplo, de iones K+ y Na+, cuyas


concentraciones en el medio circundante y en el interior celular son considerable-
mente diferentes, es necesaria la existencia de un mecanismo que "bombee" potasio
para el interior de la misma y expulse sodio hacia el exterior. Este mecanismo se
puede mantener mediante el consumo de energia metabolica. A dicho mecanismo se
10 denomina tmnsporte activo.
El mecanismo de transporte activo esta basado en la existencia de enzimas que,
mediante el uso de la energia suministrada por el ATP, son capaces de traslocar el
o los iones correspondientes. Estas enzimas, que corresponden a ATPasas, se las de-
nomina generalmente como bombas, debido a su funcion. Se trata de proteinas trans-
membrana que poseen dos extremos hidrofilicos expuestos ala solucion, y un cuerpo
con superficie exterior predominantemente hidrofobico que se encuentra en contacto
con los lipidos de la membrana. Su estructura de varias helices forman canales que
atraviesan las membranas. Existen proteinas que tambien forman canales pero que
no poseen mecanismos activos, como por ejemplo las llamadas porinas. El trans-
porte activo nos pone frente a diversas situaciones en las cuales debemos explicar
claramente sus caracteristicas; de 10 contrario, pareceria que est amos introduciendo
elementos vitalist as dentro del razonamiento. Una de las preguntas que nos surgen
es como es posible el acoplamiento de la energia metabolica, producto de la com-
bustion y la acumulacion de energia quimica en las moleculas de almacenamiento y
distribucion (ATP). Dado que las reacciones quimicas son en principio de caracter
escalar (no existen direcciones preferenciales) estariamos violando el princi pio de
Curie cuando acoplamos las reacciones escalares con fiujos vectoriales. 1 La expli-
cacion de esto proviene de la asimetria de las membranas, las que establecen una
direccion y sentido para las reacciones quimicas involucradas. Un ejemplo facil de
visualizar es la cadena respiratoria, donde las moleculas de citocromos est an insert as
en la membrana de tal manera que el pasaje de los electrones se realiza siguiendo
un orden establecido por la estructura.

VI.2.1. Termodinamica del transporte activo

El transporte activo opera en un sistema fuera del equilibrio pero contribuye a


est ablecer , dentro del no equilibrio, un est ado estacionario. Es en ese contexto que
10 consideraremos aun cuando existen breves periodos en los que el sistema celular
sale del est ado estacionario.
Tomemos un sistema que, para simplificar, posee solamente dos fiujos, uno de ellos
es nulo por efecto del transporte activo. La fuente de energia para poder mantener

1 El principia de Curie establece que no se pueden acoplar fen6menos tensiorales de orden dife-

rente, como, par ejemplo, un escalar y un vector.


VI. Ttansporte 189

el transporte proviene de alguna manera del acoplamiento con el otro flujo. Esto
no debe sorprendernos, ya que la energia metabolica depende, entre otras cosas, de
la disponibilidad de oxigeno. El flujo de oxigeno esta ciertamente acoplado al flujo
de sustancias que son sujeto del transporte activo. En nuestro sistema simplificado
no analizamos los detalles de ese acoplamiento desde el punta de vista mecanistico.
Expresamos los dos flujos como

JI = LnXI + L l2 X 2 = 0, (VI. 11)


J2 = L l2 X I + L 22 X 2 # 0, (VI.12)

donde hemos consider ado al flujo 1 como el que se hace cero por efecto del transporte
activo. Sin transporte activo el flujo 1 para valores no nulos de la fuerza Xl no seria
nulo. Ese es el caso de, por ejemplo, los iones K+ en la celula, donde para mantener
su concentracion constante ingresan iones en contra del gradiente de concentracion
mediante el transporte activo.
La velocidad de disi pacion local de energia por el sistema se puede expresar como
el producto de la temperatura local por la velocidad de produccion de entropia, es
decir, la funcion de disi pacion

(VI.13)
Dado que J I = °solamente contribuye el producto J 2 X 2 , tenemos

(VI. 14)
De la ecuacion VI. 11 podemos despejar el valor de la fuerza conjugada del flujo 2

(VI.15)

Utilizando este resultado en la ecuacion VI.12 y reemplazando en la expresion de


la velocidad de disipacion de energia VI.14 resulta

Ta ~ TLllXi [L~t22 ~ 1] :> O. (VI.16)

Este resultado nos brinda una informacion interesante. Vemos que la disipacion
de energia es mas rapida cuanto mayor es la fuerza conjugada del flujo 1, en par-
ticular con el cuadrado de esa fuerza. El resultado es facil de interpretar. Cuanto
mayor fuerza termodinamica existe para el pasaje de la sustancia 1, el sistema se
movera mas facilmente hacia el equilibrio, 10 que debe contrarrestarse mediante el
transporte activo insumiendo mas energia.
190 Temas de Biofisicoqufmica

Otra consecuencia que podemos extraer es que la disipacion disminuye con Lr2'
el coeficiente de acoplamiento. Esto nos indica que gastaremos menos energia si los
flujos est an bien acoplados.
Veamos otro aspecto del problema. De la ecuacion VI.ll podemos obtener Xl
como

L12
Xl = --X2 (VI. 17)
L11
y, reemplazando en VI.12, obtener el flujo de la sustancia 2

(VI.18)

Podemos escribir esta expresion del flujo de la sustancia 2 a traves de la membrana


como

(VI.19)
con

(VI.20)

Vista de esta forma se nos muestra con una expresion simple donde el flujo es
proporcional a la fuerza impulsora. La caracteristica interesante es que la constante
de proporcionalidad (el coeficiente fenomenologico "efectivo" LeJec) no es la que
esperamos para el flujo 2 en condiciones norm ales sino que esta reducida por efecto
del acoplamiento con el termino ~LL22.
11
Resulta claro entonces que el hecho de mantener
el flujo 1 nulo Ie "cuesta" al flujo 2 cierto valor, resultando que ese flujo es menor
que el que corresponderia si no hubiera acoplamiento. Tanto menor cuanto mas facil
resulte el pasaje del flujo 1 (al que hay que contrarrestar), ya que a mayor valor de
L11 menor sera el coeficiente fenomenologico efectivo.

VI.2.2. EI mecanismo del transporte activo

En las secciones anteriores hemos definido el transporte activo y vimos algunos


aspectos termodinamicos. Aun nos queda por considerar cual es el mecanismo y las
estructuras correspondentes mediante las cuales se produce el proceso de transporte
activo.
Debemos tener presente que el problema del transporte activo es, en terminos del
desarrollo de la biologia, relativamente reciente. El reconocimiento de la existencia
VI. Ttansporte 191

de permeabilidad en la membrana solo se logro con la disponibilidad de isotopos


radiactivos con los que se pudo mostrar que los iones atravesaban la membrana,
cosa que ocurrio a principos del siglo xx. La demostracion de la existencia de un
macanismo por el cual, haciendo uso de energia metabolica, se fuerza el paso de
iones aun en contra de un gradiente de concentracion es aun mas reciente.
Un mecanismo de transporte activo donde podemos observar claramente muchas
de sus caracteristicas es la cadena respiratoria. El transporte de electrones en las
mitocondrias se realiza mediante un conjunto de proteinas que se encuentran fijas
ordenadamente en la membrana (la simetria necesaria que introduce el caracter
vectorial). Con esta estructura se produce el pasaje de electrones de una region a
otra con consumo de oxigeno. Este pasaje genera asimetrias de carga que se utilizan
en otros procesos. 2
Otro ejemplo paradigmatico es el transporte de sodio y potasio. Este transporte
se realiza mediante la llamada "bomba de sodio y potasio", una enzima que utiliza
la energia de la reaccion ATP ---+ ADP + Pi para transportar Na+ y K+ a traves
de la membrana celular en direcciones opuestas. La ATPasa Na+ /K+ es una de las
enzimas que realizan transporte activo a las que se suman, por ejemplo, la ATPasa
H+ /K+, para el tranporte de potasio y prot ones , la ATPasa Ca 2 +, en el transporte
de iones calcio y otras.
El transporte realizado por las citadas enzimas forma parte del mecanismo de
tmnsporte activo primario. Cuando en una preparacion donde se esta realizando
el transporte de sustancias adicionamos un inibidor del metabolismo, por ejemplo,
ciertas sustancias dejan de pasar a traves de las membranas. Ya que hemos eliminado
la fuente de energia metabolica podriamos suponer que todas aquellas sustancias
que han dejado de pasar dependen de un mecanismo de transporte activo. Debemos
distinguir entre aquellas para las que existe un transporte directo mediante una
"bomba" especifica de aquellas cuyo transporte esta acoplado a otras que poseen un
mecanismo directo. Podemos entonces decir que existe un transporte activo primario,
para las primeras, y un transporte activo secundario, para las segundas. Un ejemplo
de transporte activo secundario es el transporte de glucosa en el intestino, el cual
esta acoplado al transporte activo primario de sodio.

2La cadena respiratoria se encuentra descripta en detalle en muchos buenos libros de Bioquimica.
Bibliograffa

Lecturas suplementarias

• M.Cereijido & C.A. Rotunno, Introducci6n al estudio de las membranas


biol6gicas, EUDEBA, Buenos Aires, 1966.

• M.Cereijido & C.A. Rotunno, Introduction to the Study of Biological


Membranes, Gordon and Breach, New York, 1970.

• P.J.Garrahan & A.F. Rega, ransporte a traves de la membrana celular,


Organizaci6n de los Estados Americanos, Washington, 1977.

• K.D. Neame & T.G. Richards, Cinetica del transporte a traves de mem-
branas, Blume Ediciones, Madrid, 1976.

193
Capitulo VII

Potenciales de membrana

Existen diversos mecanismos mediante los cuales se genera una diferencia


de potencial a traves de una membrana. En este capitulo veremos un caso en
don de el sistema esta fuera del equilibrio, denominado potencial de difusion.

VII.1. EI potencial de difusi6n

Supongamos que tenemos una solucion salina confinada en una region de


recipiente. Si en un cierto momento eliminamos la barrera que separa ambas
regiones, la sal difundira dentro del solvente. Si pudieramos observar el frente
de avance veriamos que en algunos casos una clase de los iones presentes marcha
delante de los otros. Eso ocurre cuando hay diferencia de movilidad entre los
iones positivos y negativos. 1 Los iones no se separan, ya que debe mantenerse la
neutralidad. Los iones mas moviles toman la delantera pero el campo generado
por los iones "lent os" hacen que no puedan separarse, ambos viajan a la misma
velocidad liderados en su avance por los mas moviles. Si pudieramos medir el
potencial electrico entre el frente de avance y la linea inmediatamente anterior,
encontrariamos un potencial generado por la difusion.
La situacion planteada puede observarse facilmente cuando existe alguna
barrera flsica que mantiene estacionaria la superficie de difusion, tal como
ocurre cuando existe una membrana dentro de la cual los iones tienen dife-
rente movilidad. La existencia del potencial de difusion genera diferencias de
potencial, por ejemplo, cuando se utiliza un puente salino. Para evitar esa

1 Recordemos que movilidad se define como velocidad por unidad de campo. En nuestro caso

por unidad de campo electrico, para un fen6meno de sedimentaci6n, sera velocidad por unidad de
campo gravitatorio, etc.

195
196 Temas de Biofisicoqufmica

situacion se utilizan frecuentemente puentes de KC1, ya que el K+ y el Cl-


poseen la misma movilidad.
La movilidad ionica a traves de la membrana celular no es uniforme para
todas las especies ionicas y produce entonces un potencial de difusion que
result a de suma importancia.
Consideremos el fiujo ionico a traves de la membrana. La expresion mas
simple del fiujo, sin considerar acoplamientos, nos dice que es igual al produc-
to del coeficiente fenomenologico por la fuerza conjugada. Describiendo con un
poco mas de detalle el coeficiente fenomenologico podemos escribir

Flujo = movilidad x concentracion x fuerza.

La fuerza sera el gradiente de potencial qUlmic0 2 el cual, dado que se trata


de una especie cargada, 10 explicit amos como el potencial electroquimico

0
J1i = J1 + Pv + RT In e + zF1/J, (VII. 1)
don de hemos considerado la concentracion en lugar de la actividad. Dado que
consideramos una unica direccion de variacion, perpendicular a la membrana,
escribimos el gradiente como la derivada respecto de la direccion x

cIfIi = -RT [~de + v dP + zF d1/J]. (VII.2)


dx edx RT dx RT dx
Con esta expresion para la fuerza podemos entonces escribir la llamada
ecuaci6n de Nerst-Planck para el fiujo

1 de v dP zF d1/J]
J = -weRT [ ~ dx + RT dx + RT dx (VII.3)

don de w es la movilidad del ion estudiado.


Observemos que para una sustancia no cargada (z = 0) y en ausencia de
diferencias de presion (dP / dx = 0) la ecuacion VII.3 se reduce a:

de
J= -wRT- (VIl.4)
dx'

2Como vimos en el capitulo V, el flujo es resultado del efecto de las diferentes fuerzas presentes.
Este tratamiento, que podriamos Hamar clasico, no considera explicitamente los flujos asociados.
Adicionalmente ya que se supone temperatura constante la fuerza termodinamica del transporte de
materia, definida como el gradiente de fLIT, resulta ser simplemente el gradiente de fL.
VII. Potenciales 197

que con wRT = D reconocemos como la ecuacion de Fick.

VII.LL La ecuacion de Goldman

La ecuacion VII.3 es una ecuacion diferencial que debemos integrar con las
condiciones de contorno apropiadas. Esto requiere de algunas suposiciones. Las
aproximaciones efectuadas por Goldman permit en integrar la ecuacion. Una de
las aproximaciones consiste en considerar que el campo eh§ctrico en el interior
de la membrana es constante, 10 que trae como consecuencia que podemos
reemplazar d7jJ / dx por b.7jJ / b.x, y la otra es considerar que no hay variaciones
de presion (dP/dx = 0). La ecuacionVII.3 se reduce a:

J = -wcRT [~ dc + zF b.7jJ] (VII.5)


cdx RT b.x

que multiplicando por c y reordenando puede escribirse

J dc zF b.7jJ
---=-+c--. (VII.6)
wRT dx RT b.x
Esta es una ecuacion diferencial de primer orden en c lineal no-homogenea
que puede resolverse facilmente considerando que para x = 0 la concentracion
c = Cl Y para x = b.x, el otro lado de la membrana, c = C2

J ZFb.7jJ]_ZFt:,.,p J zFb.7jJ
C2 = wRT RTb.x e RT + wRT RTb.x' (VII. 7)
[ Cl -

que resolviendo para J result a

(VII.8)

Dado que se trata de fiujo de iones, el mismo es proporcional a la corriente


que produce tal fiujo. En est ado estacionario la electroneutralidad nos exige
que no exist a pasaje neto de corriente. Para dos iones univalentes (z+ = 1,
z- = -1) podemos escribir para los fiujos de ambos iones

(VII.9)
198 Temas de Biofisicoqufmica

(VILIO)

Si utilizamos en la ecuacion VILIO la relacion

(VILl1)

podemos escribirla como

(VILI2)

Los fiujos de los dos iones deben ser de igual valor absoluto pero de signos
opuestos de tal suerte que su suma no arroje corriente neta, 10 que se observa en
las ecuaciones VII. 9 Y VILI2. Igualando entonces esas ecuaciones obtenemos
F6,p
(W+Cl + w_c2)e- RT = W+C2 - W-Cl (VILI3)

De don de podemos despejar la diferencia de potencial a traves de la mem-


brana

(VILI4)

Esta ecuacion se puede generalizar a muchos iones monovalentes

/).1jJ = _ RT In [~t W~Cl - ~~ W~C2l ' (VILI5)


F ~j W~C2 + ~ f' W=-Cl
denominada ecuacion de Goldman. Vemos que la diferencia de potencial a
traves de la membrana es fun cion de la concentracion y la movilidad de los
iones involucrados.
Es importante notar que las concentraciones Cl Y C2 se refieren a concen-
traciones sobre la superficie de la membrana Y la movilidad a movilidad en el
interior de la membrana. Las concentraciones en el bano no son necesariamente
iguales y dependen de la afinidad de los iones con la misma. Es posible rela-
cionar ambas concentraciones con el coeficiente de particion 13 por la relacion
c' = pc, con c' igual ala concentracion en el bano en contacto con la membrana.
VII. Potenciales 199

VII.l.2. La ecuacion de Hodking-Katz

Dado que regularmente la concentracion accesible es la del bano, es conve-


niente utilizar otra forma de la ecuacion VII.15. Hodking y Katz adaptaron
tal ecuacion definiendo la permeabilidad P como

P =wRTf3 (VII. 16)


.6.x '
don de f3 es el coeficiente de particion del ion entre la solucion y la membrana
y .6.x el espesor de la membrana.
Incorporando esta definicion en las ecuaciones de los fiujos y, dado que los
iones relevantes para fijar el potencial de la membrana celular son los iones
N a +, K+ y Cl-, podemos escribir la ecuacion de Hodking y Katz como

(VII. 17)

don de las concentraciones ionicas se refieren a las correspondientes al bano y los


subindices 1 y 2 corresponden al exterior e interior de la celula respectivamente.
Esta ecuacion da cuenta del comportamiento tanto de las celulas regulares
como de las excitables y juega un papel fundamental en el estudio de los im-
pulsos nerviosos. El modelo experimental mas estudiado es el axon de calamar
y los trabajos realizados en ese sistema han brindado importantlsima informa-
cion sobre el comportamiento electrico de las membranas.

VII.2. Los potenciales en las o§lulas excitables

VI1.2.1. EI potencial de reposo

Las ecuaciones que hemos visto nos dan cuenta del potencial a traves de la
membrana en terminos de las concentraciones y permeabilidades de los iones
de mayor aporte al potencial.
Las celulas llamadas excitables (nervios y musculos) tienen la propiedad
de cambiar el potencial de membrana abruptamente ante la recepcion de un
estlmulo apropiado. La respuesta debe ser correct a no solamente en cuanto a
los niveles de potencial sino tambien con respecto al tiempo de reaccion.
Si observamos la ecuacion VII.17 vemos que el potencial no depende unica-
mente de las concentraciones relativas sino tambien de la permeabilidad. Los
tiempos requeridos para la produccion del impulso no pueden ser logrados por
200 Temas de Biofisicoqufmica

el cambio de las concentraciones ionicas celulares. Aun con la panilisis comple-


ta del transporte activo, que mantiene el desbalance entre las concentraciones
interiores y exteriores de sodio y potasio, la difusion result a extremadamente
lenta en relacion con la velocidad de respuesta necesaria. Sin embargo, esta
panilisis de las bombas cambia casi instantaneamente la permeabilidad pro-
duciendo una avalancha de iones sodio que intentan entrar a la celula y de
potasio que tratan de salir de la misma, 10 que produce un potencial de di-
fusion que, como veremos, invierte la polaridad del potencial.
Para analizar semicuantitativamente el problema reescribiremos la ecuacion
VII.17 en terminos de las permeabilidades relativas de sodio, potasio y cloro.

(VII. 18)

don de ademas de reemplazar por las permeabilidades relativas hemos indicado


con los subindices i y e las concentraciones del interior y exterior de la celula.
Utilizando los valores de concentraciones celulares tlpicas de los iones dadas
por la tabla VII.2.1 y los valores aproximados de las permeabilidades relativas:

pr - PK
=1 (VII. 19)
K PK
_ P Na
PNa PK
= 0,04 (VII.20)
_ PCI
P!;z PK
= 0,45 (VII.21)

obtenemos el potencial de reposo

/).1jJ = -72mV (VII.22)


Es dado que la permeabilidad relativa del sodio es muy baja, la contribucion
de dicho ion al potencial debe ser tambien baja. Si calculamos solamente con
la contribucion del potasio y cloro, el result ado es /).1jJ(K,CZ) = -90mV, que no
difiere demasiado del potencial calculado con la contribucion de los tres iones.
Si avanzamos aun mas y consideramos unicamente la contribucion del potasio,
es decir, con la ecuacion

/).1jJ(K) = RT
-- I n [[Kli]
- (VII.23)
F [Kle'
el valor del potencial de reposo es
VII. Potenciales 201

Cuadra VII.I: Concentraci6n tipica de iones en el interior y exterior celular (de ref.[I]).

Conc. /mmoll- 1
Ion Exterior Interior
Na+ 145 12
K+ 4 139
Ca++ 1.8 <0,002
Mg++ 1.5 0.8
Cl- 116 4

/).1jJ(K) = -glmV (VII.24)


El potencial debido al potasio es el determinante del potencial total. La
razon es que la permeabilidad al sodio es, para la celula en reposo, extremada-
mente baja y que el cloruro difunde libremente, por 10 que su concentracion se
adapta escencialmente al valor del potencial dictado por el resto de los iones
(con los valores que manejamos el potencial debido unicamente al cloruro es
/).1jJ(Cl) = -87m V). Obviamente que de una u otra forma todos los iones ejercen
cierta infiuencia, pero no se comente un error demasiado grande considerando
para el potencial de reposo solamente el ion potasio.

EI potencial de accion

Las celulas excitables pueden cambiar su potencial de membrana mediante


la recepcion del estlmulo apropiado. La senal que recibe la celula dispara un
mecanismo que modifica las permeabilidades de los iones presentes, las que
cambian casi instantaneamente. No existen diversos grados en la modificacion
de esas propiedades, cuando el estlmulo supera el umbral se produce el cambio
total. La amplitud del pi co de potencial que se produce no depende del valor
del estlmulo. El proceso se desarrolla en alrededor de 0,5 ms en los cuales se
invierte el potencial (despolarizaci6n) y luego se recupera mas lentamente el
est ado de reposo (repolarizaci6n).
Es evidente que la accion es tan rapida que los cambios posibles en la con-
centracion son Infimos, por 10 que para los calculos utilizamos los valores de
concentracion del est ado estacionario. Los cambios en la permeabilidad son
notables. Los valores son, en este caso,
202 Temas de Biofisicoqufmica

pr =EK =1 (VII.25)
K P K
_ P Na
Piva PK
= 20 (VII.26)
_ PCI
P!;z PK
= 0,45. (VII.27)

Podemos ver que la permeabilidad relativa del sodio aumenta 500 veces.
Este cambio invierte las condiciones y la contribucion que podemos despreciar
debido ala permeabilidad baja es la del potasio. El potencial debido solamente
al sodio durante la excitacion es

fj.'ljJ(Na) = 64mV. (VII.28)


El potencial de membrana sufre un aumento del orden de 140 m V en un
brevlsimo lapso.
Bibliograffa

[1] H. Lodish, A. Berk, L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore & J.Darnell,


Molecular Cell Biology, cuarta edici6n. Freeman, New York, 2000.

Lecturas suplementarias

• M. Cereijido & C.A. Rotunno, Introduction to the Study of Biological


Membranes, Gordon and Breach, New York, 1970.

• P.J. Garrahan & A.F. Rega, Thansporte a traves de la membrana celular,


Organizaci6n de los Estados Americanos, Washington 1977.

• K.D. Neame & T.G. Richards, Cinetic del transporte a a traves de mem-
branas, Blume Ediciones, Madrid, 1976.

203
Capitulo VIII

EI agua en las celulas

L' eau! ... Tu n' est pas 1lI3cessaire it la vie: tu est la vie. 1
ANTOINE DE SAINT-EXUPERY, Terre des hommes

El estudio de fiujos, que se tratO en el capitulo anterior en forma general,


result a particularmente importante para el fiujo de agua. Su estudio previo nos
permite un analisis mas cuidadoso del problema. Sin embargo, todo 10 discutido
respecto de fiujos se refiere al pasaje de agua a traves de una membrana, mas
o menos ideal seglin el caso, pero no nos dice mucho del comportamiento de
las celulas respecto del agua.
Queremos examinar ahora el comportamiento de las celulas como un todo
frente al agua. Analizaremos solamente algunos aspectos del problema comen-
zando con el comportamiento de las celulas frente al fenomeno osmotico.

VI II. I. EI comportamiento osm6tico de las o§lulas

Las celulas animales difieren de las de las plantas. Su anatomia es diferente


y, en relacion con ello, su funcion tambien 10 es.
Como hemos mencionado previamente, cuando dos soluciones diferentes se
separan por una membrana semipermeable se produce un fiujo de solvente.
Una celula puede, en principio, describirse como un sistema similar don de
la membrana celular (0 membrana plasmatica) separa la solucion interior del
medio externo. Por 10 tanto, esperamos un comportamiento osmotico al menos
parcial, en la celula. Este hecho llevo al descubrimiento del fenomeno osmotico
por el botanico Pfeffer en 1877 [1].

1 Agua! ... tu no eres necesaria para la vida: tu eres la vida

205
206 Temas de Biofisicoqufmica

Es claro que el protoplasma no es una solucion ideal ya que la mayor parte de


los constituyentes del interior celular -proteinas, acidos nucleicos, electrolitos,
etc.- interactuan fuertemente con el agua. Esta solucion no ideal y concen-
trada habita el interior celular que esta altamente organizado alojando otros
componentes pequenos tambien organizados (organelas) que realizan funciones
especializadas.
La membrana celular -compuesta basicamente por una bicapa lipidica con
proteinas, no distribuidas al azar sino en una organizacion altamente eficiente-
tiene caracter semi-permeable pero con selectividad para el pasaje de solutos
altamente espedfica. Su permeabilidad no esta definida por el tamano del poro
sino que esta determinada de forma diferente, tanto esta sea por mecanismos
pasivos como activos. Para el caso de mecanismos activos hemos visto que
implica el uso de energia metabolica para ese proposito.
Por el momento dejaremos de lado el problema de la membrana para analizar
su comportamiento osmotico.

VIII.l.1. 6smosis en celulas animales

Si sumergimos un globulo roj02(eritrocito) en una solucion acuosa de 0,15


mol/l de NaCl, la cual es isot6nica con el globlo rojo, mantendra su forma
normal. Si 10 sumergimos en una solucion hipot6nica -es decir con una con-
centracion tal que se produce una presion osmotica que produzca un fiujo de
volumen entrante-, el gobulo rojo perdera su forma de disco biconcavo con sus
bordes mas gruesos que el centro y tomara, en el est ado turgente, una forma
esferica, manteniendo el area total de la membrana. Si continua el ingreso de
agua, puesto que la elasticidad de la membrana es escasa, se generan grandes
poros por don de escapa gran cantidad del contenido celular y se produce la
lisis (hem6lisis).
Es posible producir la lisis mediante un shock osm6tico, es decir, transfirien-
do las celulas abruptamente a un medio hipotonico, pero si el proceso se realiza
lentamente la lisis se efectua sin producir danos severos a la membrana. Una
vez que se han perdido las particulas de alto peso molecular, si se transfieren
cuidadosamente las celulas a una solucion isotonica, la membrana recupera su
est ado normal y se comport a nuevamente como un membrana semipermeable.
A los elementos asi formados se los denomina fantasm as de globulos rojos y
resultan muy utiles para el estudio de membranas, ya que en el proceso es

2El interior de un gl6bulo rajo madura es esencialmente una vesicula llena de una soluci6n salina
de hemoglobina.
VIII. El agua en las celulas 207

posible insertar en el interior diferentes soluciones que permit en estudiar el


comportamiento de la membrana frente a diferentes situaciones.
El comportamiento de los globulos rojos en una solucion hipertonica es muy
simple. El agua escapa del interior de las celulas y se encoge.
No todas las ceulas se comportan como los eritrocitos. Los huevos de erizo de
mar (arbacia) son interesantes para los estudios osmoticos. Por supuesto, dado
que el agua de mar es el medio natural de la arbacia, una solucion isotonica con
esas celulas es mucho mas concentrada que en el caso anterior. Una solucion
de "-' 0,5 mol/l de N aCl es isosmotica con el agua de mar e isotonica con los
huevos de arbacia. En una solucion mas concentrada los huevos se contraeran,
pero el comportamiento ante soluciones hipertonicas es bien diferente del de
los eritrocitos.
Cuando los huevos de arbacia se sumergen en una solucion hipotonica, los
mismos se hinchan hast a que la solucion interior se torna isotonica con el
medio. Obviamente si la diferencia es demasiado grande y se supera el limite
de elasticidad de la membrana, la misma se rompe y se produce la lisis. Vemos
que el comportamiento responde a la situacion fisiologica. La posibilidad de
grandes cambios osmoticos en el torrente sangulneo es baja, en tanto que los
huevos de arbacia pueden estar sujetos a variaciones de concentracion del medio
relativamente grandes.
El comportamiento de los huevos de arbacia no es el mismo si la solucion
del bano cambia de solutos. Si se reemplaza parte del N aCl con glicerol, por
ejemplo, aun manteniendo la presion osmotica igual a la anterior, esta puede no
ser isotonica con las celulas 3 . Cuando se sumergen los huevos de arbacia en una
solucion de glicerol isoosmotica con el agua de mar, no se produce la entrada de
agua en un primer momento sino que el glicerol penetra en las celulas. Cuando
esto ocurre comienza el pasaje del agua hacia el interior, hast a que se produce
la lisis. Estamos en presencia de un caso de dos soluciones isoosmoticas (agua
de mar y una solucion de aproximadamente 1 mol/l de glicerol) que no son
isotonicas con el interior celular.

VIII.2. EI Efecto Donnan y el equilibrio osm6tico

Hasta aqul hemos examinado el comportamiento osmotico de las celulas ha-


ciendo abstraccion de la posible estructura del interior celular. Es un camino

3Recordemos que la condici6n de isotonicidad depende de las caracteristicas de la membrana


(§V.3.1).
208 Temas de Biofisicoqufmica

Fase Libre Fase Donnan


ion concentracion ion concentracion
Na+ mi! Na+ D
mNa
Cl- mi! Cl- D
mel
x- mfi (cargas)
Figura VIlLI: Esquema de un sistema Donnan; se indica la concentraci6n de cargas.

apropiado para comprender los principios del fenomeno osmotico, pero no es


realmente litil para obtener informacion sobre el mecanismo celular. La es-
tructura interna incluye no solamente pequenos solutos sino ademas macro-
moh§culas de diferente tipo que poseen distintos grupos, tanto cargados como
hidrofobicos, que contribuyen al comportamiento no-ideal de la solucion inte-
nor.
Ya vimos la importancia de la concentracion de las diferentes sales en la
actividad ionica (§IL1.I), ahora nos ocuparemos de la infiuencia de los grupos
cargados de las macromoh§culas confinadas en el interior celular.
Cuando en un sistema ciertas cargas se encuentran confinadas a una parte
del mismo, 10 que se designa como la existencia de cargas no diJusibles, se pone
de manifiesto un fenomeno llamado el EJecto Donnan.
Un sistema Donnan se define como dos fases acuosas en contacto, en la
que una de las fases contiene cargas no difusibles. La caracteristica de car-
gas no difusibles puede deberse a cargas existentes en macromoh§culas que no
atraviesan una membrana, cargas de la propia membrana 0, como en el caso
de geles, cargas fijas a una matriz que no puede difundir -incluso en ausencia
de membrana-. A esta fase la llamaremos Jase Donnan y a la otra Jase libre.
Supongamos, por ejemplo, que la fase libre esta formada por una solucion
de NaCl con una concentracion mi!, que la fase Donnan contiene m;: molesj.e
de cargas no difusibles y que la concentracion de iones Na+ y Cl- son mf1a y
mg respecti vamente (figura VIlLI).
El sistema debe tener electroneutralidad, de tal manera que la suma de las
cargas positivas y negativas debe ser igual, por 10 tanto

(VIlLI)
Si suponemos equilibrio, el potencial electroqulmico deb era tener igual valor
para cada componente, 10 que se expresa como

D = J.lNa
i! esto es D
J.lNa -
i!
J.lNa =
0 (VIlL2)
J.lNa
VIII. El agua en las celulas 209

D
MCI -
£
MCI =
0. (VIII. 3)
Para N a + tenemos

(VIIl.4)

don de 'ljJ es el potencial eh§ctrico en cada fase y a la actividad del ion, F la


constante de Faraday, R la constante universal de los gases y T la temperatura
absoluta. La ecuacion VIIl.4 se puede reescribir como

(VIII. 5)

En forma similar obtenemos para el ion Cl-

RTln (a~l) liz = -F('ljJ£ _ 'ljJD). (VIII. 6)


a Cl
La condicion se debe satisfacer para todos los iones libres presentes en el
sistema. Puesto que el potencial 'ljJ es, en equilibrio, el mismo para cada fase,
tenemos

£ ) liz ( £ ) liz
RTln a~a = RTln a~l , (VIII. 7)
(
aNa a Cl
10 que significa que

(VIII. 8)

Puesto que z = +1 para el Na+ y z = -1 para el Cl+, tenemos

(VIII. 9)

de don de podemos obtener la relaci6n de Donnan

(VIII. 10)
210 Temas de Biofisicoqufmica

El producto de la actividad de los iones libres en la fase libre es igual al


de la fase Donnan. Esta relacion se cumple para las actividades, pero no nece-
sariamente para las concentraciones, ya que los coeficientes de actividad de los
mismos iones pueden ser (yen general 10 son) diferentes en la fase libre y en
la fase Donnan.
Si suponemos que los coeficientes de actividad son iguales en ambas fases
(no necesitan ser iguales a la unidad), 10 que es en general falso, es posible
expresar la ecuacion VIII.10 en terminos de concentraciones. Esta forma es
la que generalmente se da en la mayor{a de los textos, pero debe tenerse en
cuenta que se trata de una aproximacion importante.

I! I!c-v DD
mClmNa - mClmNa· (VIII. 11)
En nuestro caso, m~a = m~l = ml!, entonces

(ml!)2 c-v mgm~a, (VIII. 12)


y, utilizando la condicion de electroneutralidad (ec. VIII. 12) , podemos reem-
plazar mg con m~a - mx, y de all{

(VIII. 13)
Esta es la relacion clave en el equilibrio Donnan. Antes de ir ala discusion del
problema veamos algunas definiciones. Primero, definiremos la Juerza Donnan
relativa4 que es la relacion entre la concentracion de las cargas no difusibles
y la concentracion de las cargas libres en la fase libre. Debe tenerse presente
que la concentracion de las cargas no difusibles excede largamente el numero
de particulas no difusibles.

D = mx (VIII. 14)
mI!·

La segunda cantidad que definiremos es el coeficiente de acumulaci6n p, que


es la relacion entre la concentracion de los iones libres entre ambas fases
D D
mNa mCl
PNa+ = -I!-; PCl- = - I ! . (VIII. 15)
mNa mCl
Dividiendo la ec.VIII.13 en ambos miembros dos veces por ml!, se obtiene,
usando las recientes definiciones

4El nombre tiene reminiscencia a la Hamada juerza i6nica donde tampoco tiene conexi6n con
ningun tipo de fuerza pero cuyo nombre ha consagrado la costumbre.
VIII. El agua en las celulas 211

(VIII. 16)

Esta es una ecuacion de segundo orden en p, que resuelta con la eleccion


apropiada de signos (recordando que PNa+ = _1_) da
Pc]-

(VIII. 17)

y para Cl-

PC]- ~ - G) - JG)' H (VIII. 18)

La figura VIII.2 muestra el cambio en el coeficiente de acumulacion en


funcion de la fuerza Donnan relativa.

12'-~--~--------=71

-4

-8+····.···········.··········.······--........,·.········

Figura VIII. 2: Coeficiente de acumulaci6n en funci6n de la fuerza Donnan rei at iva para un
sistema Donnan con una fase libre formada por una soluci6n de N aCl.

Podemos obtener de la ec. VIII.5 la diferencia de potencial eh§ctrico entre


la fase Donnan y la fase libre en terminos del coeficiente de acumulacion como

(VIII. 19)

don de If Y If son los coeficientes de actividad del ion i en la fase Donnan y


la fase libre respectivamente.
212 Temas de Biofisicoqufmica

Fase Libre Fase Donnan


ion concentracion ion concentracion
Na+ mi! Na+ D
mNa
Cl- mi! Cl- D
mel
x- x- despreciable (part.)
Figura VIII.3: El mismo sistema Donnan de la figura VIlLI. En este caso se indica el mimero
de particulas (en lugar del mimero de cargas).

VII1.2.1. EI efecto osm6tico en un sistema Donnan

Comparemos las figuras VIlLI y VIlL3. La concentracion de particulas en


la fase libre es

y en la fase Donnan

Puesto que de las ecuaciones VIlLll y VIlL15 es

y (p + 1/ p) es siempre mayor que dos (p ~ 1), el numero de particulas en la


fase libre sera siempre menor que en la fase Donnan.
Sabemos que el equilibrio osmotico depende de la actividad del agua. A
mayor concentracion de solutos, menor sera la actividad del agua, de manera
que en la fase Donnan tendremos una menor actividad y un aumento de la
presion osmotica. Vemos que la necesidad de generar la electroneutralidad no
solamente nos lleva, en el equilibrio, a producir una diferencia de potencial
eh§ctrico entre ambas fases sino a producir tambien una diferencia de presion
osmotica.

Hinchamiento y encogimiento de geles

Un problema interesante y tecnologicamente de importancia es el hinchamien-


to y encogimiento de geles producidos por el efecto Donnan. Cuando los geles
estan cargados, sus cargas no difusibles y el propio gel en solucion son parte
de la fase Donnan de un sistema Donnan. En un sistema como este, no hay
presente una membrana pero ambas fases estan bien definidas. La fase libre
VIII. El agua en las celulas 213

la forma el bano, y todo cambio del contenido salino de esa fase infiuini no
solamente en la diferencia de potencial entre el gel y el entomo sino tambien
en la diferencia de presion osmotica entre ambas. Cuando la salinidad del bano
disminuye, la fuerza Donnan relativa aumenta y, consecuentemente, cambia el
coeficiente de acumulacion produciendo una captura de agua por parte del gel
debido a la presion osmotica. Este efecto de hinchamiento se revierte aumen-
tando la salinidad del bano.

VII1.2.2. EI efecto Donnan en las celulas

Toda celula tiene una gran proporcion de macromoleculas que no pueden


atravesar la membrana celular. Las cargas asociadas con estas macromoleculas
se toman no difusibles y producen un efecto Donnan. Se genera, por este
efecto, una presion osmotica de tal manera que ingresa agua hacia la celula.
El ingreso de agua cesani cuando las fuerzas osmoticas sean compensadas.
Obviamente la membrana puede contribuir con cierta presion mecanica. Si
la resistencia mecanica de la membrana es suficiente como para compensar
el efecto de la presion producida por el efecto Donnan, es una pregunta sin
respuesta. No obstante sabemos que en una celula muerta el agua penetra
hast a la lisis celular; en un organismo vivo esto no ocurre.
Iones tales como Na+ y K+ pueden pasar a traves de la membrana, pero
sus concentraciones permanecen estables a un lado y otro de la misma. El
sistema no esta en equilibrio, un "bombeo" activo hacia uno y otro lado del
interior celular es controlado por los mecanismos metabolicos. Las "bombas"
que transportan iones a expensas de energ{a metabolica permit en mantener
estable las concentraciones en un est ado estacionario esencial para la vida5 .
En estos casos es imposible considerar un equilibrio Donnan (equilibrio que
esta ausente), aunque el efecto, fuera del equilibrio, contribuira al est ado del
sistema.
Ademas de 10 recientemente mencionado deberiamos incluir en el balance
osmotico total alglin posible efecto de la temperatura, ya que podria existir
un gradiente termico entre los compartimientos separados por la membrana
(§V.4.1). Un estudio detallado del balance osmotico que incluya todos los
mecanismos esta fuera del enfoque de este libro.

5Esto nos lleva al interesante t6pico del tmnsporte activo que ya tratamos en otro capitulo.
Sin embargo, es de hacer notar que gran parte del des balance aparente en concentraci6n i6nica
es compensado por la gran diferencia en la actividad entre el interior y exterior. Actividad que
esta controlada por la fijaci6n selectiva de los diferentes iones.
214 Temas de Biofisicoqufmica

VIII.3. EI comportamiento osm6tico: otra consideraci6n

Hemos visto el comportamiento osmotico de las celulas en una mirada nipi-


da de algunas situaciones experimentales. Si queremos utilizar las propiedades
osmoticas de las celulas para obtener informacion sobre el est ado del agua en las
mismas, debemos utilizar los datos experimentales junto con las propiedades
de los componentes celulares, tales como las proteinas, acidos nucleicos, carbo-
hidratos e iones. Es importante notar que la distancia media entre las macro-
moleculas en la celula es tan pequena que algunas moleculas de agua pueden
interactuar simultaneamente con diferentes macromoleculas al mismo tiempo.
Puesto que el fenomeno osmotico esta directamente conectado con los cam-
bios en la actividad del agua, debemos saber como la presencia de las macro-
moleculas e iones afectan tal actividad cuando se encuentran empaquetados
dentm de las celulas. Las concentraciones en el protoplasma son 10 suficiente-
mente grandes como para avizorar que las propiedades de cualquiera de sus
componentes seran muy diferentes que cuando se encuentran en una solucion
libre. Para tener una idea de 10 que ocurre dentro de la celula, utilizamos la
informacion que recogemos de otras situaciones.
El contenido de agua dentro de una celula tlpica puede considerarse de
menos de 200 g de agua por gramo de proteina seca y, como hemos visto
en el capitulo dedicado a la hidratacion de macromoleculas (Capitulo IV), el
agua de hidratacion posee un comportamiento diferente, tanto en su estructura
como su dinamica, cuando se la compara con una solucion libre. Para las
propiedades osmoticas todo esto es importante. El agua que esta ligada a
sitios de adsorcion primaria es "osmoticamente inactiva", es decir que tiene
un coeficiente de actividad extremadamente bajo. Tambien parte del agua
ligada a sitios no espedficos puede tener un coeficiente de actividad que, si
bien no es tan bajo como en el caso anterior, es suficientemente bajo como
para contribuir muy poco a la presion osmotica. Cuando las moleculas de agua
interactuan mas fuertemente con las macromoleculas que entre sf son incapaces
de solubilizar otros co-solutos 6 forman parte de la llamada agua no-solvente.
Este es un factor que disminuye notablemente la actividad y, por 10 tanto,
afecta el comportamiento osmotico.
Todas estas consideraciones llevan a insistir en que la celula es un sistema
complejo altamente organizado y la vision de una "bolsa" llena con una solu-
cion diluida es realmente imposible de considerar ni siquiera como una apro-
ximacion grosera.

6Pequefios solutos que son parte de la soluci6n.


Bibliograffa

[1] W. Pfeffer, Osmotische Untersuchungen, Engelmann, Liepzig, 1877.

[2] J.J. Katz, American Scientist, 48, 544, (1960).

215
Apendices

217
218 Temas de Biofisicoqufmica
Apendice A

Mecanica estadfstica

En todo 10 que hemos planteado subyace un criterio reduccionista a traves


del cual consideramos que las propiedades del mundo macroscopico pueden
expresarse a partir del comportamiento de sus componentes a nivel atomico.
Un criterio reduccionista absoluto supone que es posible partir de las particulas
elementales. Razones de indole pnictica 0 de fundament os impiden, al menos
por ahora, llegar tan lejos, pero un reduccionismo restringido es ciertamente
posible.
En tren de describir el comportamiento macroscopico a partir de los com-
ponentes atomicos es evidente que queremos expresar las propiedades ter-
modinamicas de un sistema basados en las caracteristicas de los atomos y
sus interacciones mutuas. De all{ surge la disciplina que llamamos Mecanica
estadistica que en ocasiones tambien se denomina Termodinamica estadistica.
El camino que va desde el comportamiento mecanico a las propiedades ter-
modinamicas requiere el manejo de un gran numero de particulas, cos a que
en forma direct a es posible solamente para ciertos casos mediante el uso de
simulacion computacional. Para numeros realmente grandes apelamos al com-
portamiento estadistico de las componentes.
El siguente resumen no pretende desarrollar demostraciones, ya que un
tratamiento medianamente riguroso de 10 que nos hemos planteado requeriria
una larga extension. Se trata simplemente de una serie de resultados con al-
gunas ideas de su significado.
El est ado de un sistema cerrado formado por N particulas clasicas pun-
tuales esta determinado si conocemos las coordenadas generalizadas qa (t) 1 Y
los impulsos Pa(t) = mva(t) a tiempo t. Alternativamente podemos consid-

1 El uso de coordenadas generalizadas en lugar de cartesianas no debe Hamar la atenci6n a

quienes, por ejemplo, describen una molecula por sus coordenadas internas.

219
220 Temas de Biofisicoqufmica

erar el vector R(t) = [qa(t), Pa(t)] en el espacio llamado espacio de las de


Jases 2 de dimension N d - k don de N es el numero de partlculas, d depende del
numero de coordenadas generalizadas requeridas y k son los vlnculos presentes.
Seguir la evolucion de un sistema tal en forma detallada para un numero de
partlculas del orden del numero de Avogadro y volumen grande (N 10 23 , Y C"V

V/N = v 23
10 ) es impensable, de tal manera que se requiere, como men-
C"V

cionamos, un metodo estadlstico.


Los valores de coordenadas y cantidad de movimiento de cada partlcula
determinan su estado, que sera compatible con las propiedades macroscopicas
del sistema. Para las condiciones que est amos considerando (un sistema muy
grande) el numero de est ados posibles que puede tomar el sistema es enorme.
Por ejemplo un gas contenido en un recipiente de un centlmetro cubico puede
adoptar un numero extremadamente grande de formas de distribuir sus molecu-
las en el espacio sin variar sus propiedades macroscopicas. En consecuencia,
sera imposible mediante mediciones externas (macroscopicas) distinguir en-
tre gases que satisfacen las mismas condiciones macroscopicas pero que poseen
diferentes estados. En definitiva, existe una coleccion de sistemas que satisfacen
las mismas condiciones. A esa coleccion de sistema se la denomina conjunto
termodinamico ({ensemble ') y se represent a por una distribucion de puntos
en el espacio p, q, denominado espacio-f. Dado que la distribucion es usual-
mente continua result a conveniente designar una Juncian densidad p(p, q, t)
que describa la densidad en cada punta del espacio de la fases y para cada
tiempo.

A.!, EI conjunto microcan6nico

El conjunto termodinamico en el cual el sistema esta caracterizado por la


energla interna E y su volumen V se denomina conjunto microcananico. En un
sistema cuya energla interna es E y su volumen V en equilibrio no podemos
suponer que existen est ados privilegiados. El postulado de igual probabilidad a
priori establece que, cuando un sistema macroscopico esta en equilibrio ter-
modinamico, cualquier est ado que satisfaga las condiciones macroscopicas del
sistema es igualmente probable. Este postulado implica que en un conjunto
microcanonico la fun cion densidad es igual a 1 para un intervalo de energla
muy cercano a la energla establecida y cero en caso contrario.

2En un sistema cuantico, R es un operador y el estado del sistema se especifica con las funciones
de onda de las N particulas
A. Mecanica Estadfstica 221

En este conjunto, la relacion entre la mecanica estadistica y la termodinami-


ca se encuentra en la definicion de entropia

S(E, V) = k lnw(E) (A.I)

don de k es una constante (la constante de Boltzmann) y w(E) es la densidad


de estados del sistema.
Para realizar la conexi on entre propiedades microscopicas (moleculares) y
las propiedades termodinamicas, deberemos calcular la densidad de est ados
w(E) del sistema para luego calcular la entropia de acuerdo a la formula A.I.
Ai resto de las funciones termodinamicas las podremos obtener de las relaciones
que ya conocemos.

A.2. EI conjunto can6nico

El conjunto microcanonico no es el mas simple de utilizar ya que debemos


calcular la suma de est ados para la energia establecida a efectos de obtener
de all{ su densidad. Por otra parte, no es simple conocer la energia total del
sistema, es mucho mas simple en terminos experimentales controlar la tempe-
ratura. Otro conjunto posible es el conjunto canonico. El conjunto canonico nos
permite considerar un sistema en equilibrio termico con un sistema de mayor
tamaiio. El mecanismo deductivo de las propiedades de tal sistema consiste
en tomar un subconjunto de un sistema cerrado que se puede tratar con el
formalismo microcanonico.
Es posible demostrar que la funcion densidad de un sistema con V y T
constantes esta dada por

p(p, q) = e- H / kT , (A.2)

don de 1i es el H amiltoniano del sistema, que en mecanica clasica es la suma


de las energias cinetica y potencial y que posee su equivalente cuantico.
222 Temas de Biofisicoqufmica

Algunas relaciones termodimimicas


CON JUNTO MICROCANONICO
La diferencial total de la entropia:

dS(E, V) = (~~) v dE + (~~) E dV, (A.3)

con:

U =E (A.4)
1
T
= (Zi)v (A.5)
P
T = (Zt)E' (A.6)

Consecuentemente:

T= (~~)v (Temperatura absoluta) (A.7)


p= (Zt)E (Presion) (A.S)
A= U-TS (Energia libre de Helmholtz) (A.9)
G= U +PV -TS (Energia libre de Gibbs) (A.lO)
Cv = (~~)v (Capacidad calorific a-volumen constante)( A.11)

La fun cion clave para la conexi on con la termodinamica es la Junci6n de


partici6n del sistema definida por

(A.12)

don de h es la constante de Planck.


La relacion con la termodinamica se obtiene a partir de la relacion:

(A.13)

don de A es la energ{a libre de Helmholtz, de don de

A = -kTlnQN(V, T) (A.14)
A. Mecanica Estadfstica 223

Algunas relaciones termodimimicas

CON JUNTO CAN6NICO

U= (H) (A.15)
(U) = _(BlnQN)
BkT N,v (Energia media) (A.16)
p= -(~C)T (Presion) (A.17)
s= -(~¢ )v (Entropia) (A.18)
(A.19)

A.3. EI conjunto macrocan6nico

Si bien los resultados obtenidos con el conjunto microcanonico y canonico


son equivalentes, el enfoque del conjunto canonico es mas realista en terminos
practicos ya que experimentalmente es posible controlar la temperatura de un
sistema en tanto que mantener la energla total constante no es un proceso
facilmente realizable. Progresando un poco mas vemos que el requerimiento de
conocer el numero total de particulas exacto es poco realista, su valor medio
es accesible y deberiamos considerar tal situacion. El conjunto macrocan6nico
considera la posibilidad de fiuctuaciones en el numero de particulas, siendo las
constantes del sistema la temperatura T, el volumen V y el potencial qUlmico J.l.
ASl como el conjunto canonico surge de considerar un sub-espacio (en el espacio
r) de un sistema cerrado al cual podemos tratar con el conjunto microcanonico,
el conjunto macrocanonico se obtiene de considera un sub-espacio r de volumen
V de un conjunto con Vc, Ne y T (canonico). El resto del sistema ejerce sobre
el sub-espacio una presion P. Ya que el potencial qUlmico puede obtenerse de:

J.l = [OA(Ne , Vc, T)] . (A.20)


oNe N

La funcion densidad para un conjunto tal se expresa como

eP,N/kT
p(p q N) = e PV/ kT -7-l(p,q)/kT (A.21)
, ' N ! h dN - k '
224 Temas de Biofisicoqufmica

de all{ es posible obtener la funcion de particion para el conjunto macro-


canonico como:

00

3(T, /1, V) = L el"N/kT QN(V, T), (A.22)


N=O

de don de se obtienen las propiedades termodinamicas.

Algunas relaciones termodimimicas

CON JUNTO MACRO CANONICO

u= (E) (A.23)
(E) = -
( 33 )
3kT J.L/kT,v
(Energia media) (A.24)
p= - kJ in 3(T, /1, V) (Presion) (A.25)
~T
s= o dT~
T (Entropia) (A.26)
A= U-TS (Energia libre de Helmholtz) (A.27)

Este pasaje nipido por los diferentes conjuntos mecanico-estadisticos y su


conexi on con la termodinamica no pretende mas que mostrar las Hneas genera-
es; sin embargo, hay varios aspectos que hemos mencionado que es interesante
reconsiderar. Uno de ellos es el referido a la conexi on entre la densidad de
est ados y la entropia (ecuacion A.I).
La densidad de est ados de un sistema nos esta indicando las diferentes
alternativas de acceso que tienen los componentes del sistema. Si tenemos un
solo est ado accesible, la entropia es igual a cero. En un cristal perfecto est amos
en esa condicion, y all{ se cumple entonces la tercera ley de la termodinamica. 3
Este hecho es el que lleva a una muy difundida, y tal vez poco comprendida,
conexi on entre la entropia y desorden.
El otro aspecto importante es el relativo a la condicion de igual probabilidad
de acceso de las particulas a los diferentes estados. Esta condicion, que es valida
en el equilibrio, es la base de la distribuci6n de Boltzmann.

3 A mayor densidad de estados, mayor numero de estados accesibles, mayor sera la entropia.
A. Mecanica Estadfstica 225

A.3.1. EI factor de Boltzmann

La ecuacion A.2 nos describe la funcion densidad en el conjunto canonico.


La version cwintica difiere poco de esta, ya que consiste en reemplazar la
integral por una suma y generar aSl en lugar de una funcion continua la matriz
densidad

o o
Pnm =

Los elementos de la matriz son proporcionales a la probabilidad de en-


contrar un valor de energla dado. La expresion e En / kT se denomina factor de
Boltzmann.
Para un sistema en el cual existen diferentes est ados de igual energla, el
numero de esos est ados se denomina degeneraci6n. Contemplando esos casos
se puede decir que la probabilidad Pi de encontrar una particula con energla
Ei es proporcional al factor de Boltzmann

(A.28)

don de gi es la degeneracion.
Necesitamos encontrar el factor de proporcionalidad. La relacion entre el
numero de moleculas en dos niveles de energla dados es, de acuerdo a Boltz-
mann,

p., gieEi/kT

p.] (A.29)
n·] gje Ej / kT ·

En el cociente hemos eliminado el factor de proporcionalidad (que no cono-


cemos).
La probabilidad debe ser un valor siempre :s: 1 y la suma de las probabil-
idades del conjunto debe ser igual a la unidad. En el est ado de equilibrio la
distribucion de energla es

(A.30)
226 Temas de Biofisicoqufmica

don de N es el numero total de moh§culas. La expresi6n A.30 cumple con la


condici6n de que la probabilidad de encontrar una particula con un cierto valor
de energ{a es menor que la unidad y la suma es igual a uno.
Apendice B

Espectroscopfa

... muchos son los llamados, mas pocos los escogidos.


MATEO 20:16.

B.l. Introducci6n

B.l.l. La radiacion electromagnetica

La radiacion electromagnetica que result a de interes para el estudio de los


sistemas biologicos comprende un amplisimo rango, particularmente si quere-
mos incluir las frecuencias que no solamente actuan regularmente con dichos
sistemas sino tambien las que se utilizan para su estudio. De esta manera cu-
brimos un rango que va desde los rayos X hasta las muy bajas frecuencias,
del orden de unos pocos Hertz, pasando por las ondas de radio (corta y larga)
microondas, infrarrojo (IR), visible (VIS) y ultravioleta (UV). La figura B.1
muestra un esquema con una parte importante del espectro.
Podemos caracterizar la frecuencia con diferentes unidades; en cada tipo
de espectroscopia es habitual el uso con de alguna de ellas. Describiremos las
alternativas.
Podemos escribir al frecuencia como:
C
l/ = :\"' (B.1)

don de c es a velocidad de la luz en el vado (3 x 108 m S-l) Y A la longitud


de onda en el vado que, para ser consistente con las unidades utilizadas la
debemos expresar en metros, los que nos da la frecuencia l/ en Hz (ciclos/s).
En espectroscopia infrarroja se indica habitualmente la "frecuencia" en
numero de onda, es decir, la inversa de la longitud de onda:

227
228 Temas de Biofisicoqufmica

RMN Miccro- Raman, UV, Rayos X Rayos


ESR
ondas infrarrojc visible gamma

-4 4
10 10-2 102 10 10
6
10
8
10
10
v/em-1
I I
4 -4
10 102 10-2 10 10-6 10-8 10- 10
A/em

6 8 10 14 16 18 20
3 X 10 3 X 10 3 X 10- 3 x 101~/Hz3 X 10 3 X 10 3X10 3 X 10

I
-8 -6 -4 -2 2 4 6
1,2 x 10 1,2 x 10 1,2 x 10 1,2 x 10 1,2 1,2 x 10 1,2 x 10 1,2 x10
E leV

Figura B.l: Esquema del espectro electromagnetico.

1
V = - (B.2)
A
don de el numero de ondas posee unidades de cm- 1 con A en cm. El numero de
ondas es el numero de picos de maxima amplitud por centlmetro a 10 largo de
la onda y la longitud de onda es la distancia entre dos maximos (0 m{nimos)
sucesivos. Es frecuente en espectros del ultraviolet a lejano, rayos X y la region
de rayos I referirse a la energ{a mas que a la frecuencia. La conversion, que
se realiza a traves de la ecuacion de Planck 6.E = hv, nos da por ejemplo
para una longitud de onda de 200 nm una energ{a de aproximadamente 589 kJ
mol- 1 0 6 eV (electron-volt). Estas unidades se utilizan regularmente en los
estudios de altas energ{as.

B.1.2. Absorcion yemision

La accion de una radiacion electromagnetica sobre una sustancia puede dar


lugar a que la misma absorba energ{a. Sabemos por la mecanica cuantica que
para que un sistema pueda absorber energ{a debe recibir una radiacion con la
energ{a exact a para que el sistema pueda pasar de un nivel de energ{a a otro.
En el rango de energ{as que est amos interesados ahora, las transiciones de
energ{a corresponden a niveles de energ{a electronicas. Es decir que la energ{a
B. Espectroscopfa 229

de los fotones incidentes debenin tener el valor apropiado para producir un


reordenamiento de los electrones produciendo un nuevo est ado electronico del
sistema.
La liberacion de energla se produce por diferentes mecanismos, no necesari-
amente mediante un proceso radiativo. La figura B.2 muestra un esquema de
absorcion y emision. En la parte a) vemos dos niveles de energla, el est ado
fundamental F y el est ado excitado E. Fotones de energla E = hv, don de esa
energla corresponde a la diferencia entre el est ado fundamental y el est ado
excitado, senin absorbidos llevando el sistema al est ado de mayor energla. En
la parte b) de la misma figura estan indicados tres mecanismos de relajacion
de energla. Uno es la emision con una energla igual a la de absorcion, el otro
corresponde a una transferencia termica hacia el medio (la red) y el tercero
mediante alglin proceso qUlmico (reaccion fotoquimica).

Estado excitado
----,,....--

o
·ut::
G1
U
til
~
o:::I
u:::

Estado fundamental

Absorcion Emision

Figura B.2: Esquema del proceso absorci6n-emisi6n

El proceso de absorcion se realiza generalmente muy rapidamente (del orden


de 1O- 15 S). La emision puede ser radiaci6n espontanea, cuando se produce sin
ninguna accion externa, 0 radiaci6n estimulada, cuando una radiacion estimula
el pasaje al est ado fundamental.
El sistema indicado es muy simplista ya que no siempre existen solamente
dos niveles de energla accesibles. La figura B.3 muestra un esquema de niveles
de energla para una molecula diatomica don de se esquematizan algunos niveles
de energla electronicos para energlas rotacionales y vibracionales. Diferentes
procesos de relajacion pueden participar en la transicion al est ado fundamental.
Dado que la mayorla de las substancias de interes biologico se estudian
en solucion, los espectros relacionados con efectos rotacionales puros no son
230 Temas de Biofisicoqufmica

,2
!!'
<II
r::
w
'--
-- Eslado excilado

Eslado lundamenlal


\
\. ./
~
0
I- XAB-I
0 XAB

Figura B.3: Esquema del proceso absorci6n-emisi6n en una molecula diat6mica.

estudiados habitualmente ya que, contrariamente a 10 que ocurre en el gas,


en solucion el medio denso reduce el efecto de rotacion a tal punta que las
energ{as puestas en juego son muy bajas para ser observadas opticamente.
Las rotaciones de macromoh§culas pueden estudiarse mediante espectroscopia
dieh§ctrica 0 electro-optica. S{ se observan mediante espectroscopia optica efec-
tos libracionales, es decir, la oscilacion rotacional alrededor de una posicion de
equilibrio.
Para soluciones diluidas, los procesos de absorcion se describen mediante la
ley de Lambert y Beer don de la intensidad luminosa transmitida a traves de
una muestra de concentracion e mol/l en una celda de longitud l cm esta dada
por:

(B.3)
don de 10 es la intensidad luminosa de la fuente y E el coeficiente de extinci6n
expresado en 1 mol- I cm-I. Los datos se suelen informar en terminos del por-
centaje de absorcion (I / 10 x 100) 0 absorbancia [A = In(Io/1)], que result a una
expresion muy practica ya que:

A = E le. (B.4)
Cuando la molaridad de la solucion es desconocida 0 con gran error es mas
conveniente utilizar la concentracion en gramos por 100 ml de solucion (C) ,
para 10 que se requiere el coeficiente de extincion con las unidades adecuadas.
Tenemos entonces la absorbancia como:

(B.5)
B. Espectroscopfa 231

Debemos tener en cuenta que el coeficiente de extincion, en cualquier unidad


en que se exprese, es dependiente de la frecuencia.
La medicion de un espectro requiere un equipo en el cual se pueda selec-
cionar la frecuencia y cuya sensibilidad sea adecuada. Los espectrofot6metros,
como se Haman los equipos, pueden ser de diversas caracterlsticas, inlcuyendo
simple 0 doble haz, distintos tipos de monocromador y detector, aSl como sa-
lidas a graficador, senal digitalizada, y numerosas variantes en la electronica.
Los espectrofotometros tienen un rango limit ado de frecuencias y tenemos, por
10 tanto, diferentes equipos para las distintas regiones del espectro electromag-
netico.

B.2. Espectroscopfa vibracional

B.2.1. Espectroscopfa infrarroja

El rango en el infrarrojo (IR) se divide en dos regiones denominadas infrar-


rojo lejano e infrarrojo cercano. En el infrarrojo cercano cualquier molecula de
interes biologico, aun cuando sea tan pequena como un aminoacido, tendra un
espectro enormemente complejo. Dado que los niveles excitados en esta region
corresponden a grados de libertad vibracionales no es diflcil de imaginar que
sea as!.l Afortunadamente, de esta menera pueden identificarse ciertos gru-
pos brindando informacion valiosa. La figura B.4 muestra un esquema con las
bandas del infrarrojo correspondiente a grupos de relevancia biologica. Se ha
destacado la region don de aparecen bandas del agua, ya que esa es una difi-
cultad siempre presente que enmascara otras senales localizadas en esa zona.
En la figura B.4 se muestran algunos grupos que poseen transiciones vi-
bracionales que permit en describir algunas caracterlsticas de interes. Vemos
que en ciertos grupos se observa un corrimiento de frecuencias en los picos
de absorsion cuando el grupo esta comprometido en un puente de hidrogeno.
Sabemos que la existencia de puentes de hidrogeno es un indicativo de ciertas
conformaciones caracterlsticas en macromoleculas.
Como dijimos, los sistemas no tienen en general solamente dos niveles de
energla. La figura B.5 nos muestra el esquema de un sistema hipotetico con
varios niveles de energla. Para que una vibracion sea capaz de absorber luz en
ese rango debe producir un cambio en el momento dipolar de la molecula. Es
aSl que el N2 y el O 2 no absorben en el infrarrojo ya que no tienen momento
dipolar. El agua (H 2 0) tiene momento dipolar y las vibraciones producen

lUna molecula no lineal de n atomos tendra 3n - 6 modos fundamentales de vibraci6n.


232 Temas de Biofisicoqufmica

·1 Sobretonos
Anml v\cm Bandas
combinadas
2500 4000 4000
- - - - - Absorcion
_____ del agua
3333 CH 3000
SH

§om :lOOO - - Absorcion


del agua

10 000 1000 -1000


Vibraciones del
'esqueleto'

0 - 0
Sin puente H Con puente H

Figura B.4: Bandas de absorcion en la region del infrarrojo de algunos grupos de importancia
biologica.

cambios en el mismo que absorben energ{a en la region infrarroja. El caso del


dioxido de carbono (el CO 2 ) es interesante; si bien el CO 2 no tiene momento
dipolar, los estiramientos asimetricos del enlace C=O 0 las fiexiones en el
angulo O=C=O rompen la simetria y genera un momento dipolar dando como
result ado absorcion en la region del infrarrojo. Esta situacion no ocurre en
las moleculas diatomicas mencionadas (N 2 y O 2 ); debido a la simetria las
vibraciones no producen momentos dipolares.
Hemos mencionado la fuerte absorcion que tiene el agua en el infrarrojo que
enmascara informacion importante en las moleculas biologicas en solucion. La
alternativa del secado 0 el reemplazo de H 2 0 para eliminar la absorcion 0 por
D 2 0 para producir un corrimiento de la misma no son alternativas adecuadas
ya que esos cambios pueden producir, yen realidad producen, alteraciones en
la conformacion que queremos estudiar.

B.2.2. Dispersion Raman

La dispersion es la desviacion de luz de su direccion original de inciden-


cia. El fenomeno ocurre cuando un foton interactua con una molecula sin que
haya absorcion y se produce una dispersion elastica, aun cuando se perturbe
momentaneamente el sistema. El vector de campo electrico de una onda elec-
tromagnetica intractua con los electrones del sistema e induce oscilaciones
periodicas en los electrones del compuesto; por 10 tanto, produce momentos
electricos oscilantes. Esto lleva a tener nuevas fuentes emisoras de radiacion,
es decir, fuentes que reemiten radiacion en todas direcciones (luz dispersada).
La molecula retorna inmediatamente al est ado fundamental y el foton inci-
B. Espectroscopfa 233

Estado
-------------------- ----------
virtual

Figura B.5: Esquema de los niveles de energia para un sistema con absorcion en el infrarrojo
y dispersion Rayleigh-Gans.

dente es dispersado ebisticamente (sin perdida de energia). Este proceso recibe


el nombre de dispersion de Rayleigh-Cans.
El caso que se esquematiza en la figura B.6 se refiere ala llamada dispersion
Raman. Aqui tambien tenemos una energia insuficiente como para llevar el
sistema a alglin est ado excitado, sin embargo, y dado que hay varios niveles
vibracionales en el est ado fundamental, el sistema no retorna exactamente al
nivel de partida sino que se produce una dispersion inelastica (con transferencia
de energia) y el foton dispersado tiene una energia diferente de la luz incidente.
Esta diferencia puede ser hacia longitudes de onda mayores 0 menores seglin
sea el origen y destino de la perturbacion. Estas Hneas se denominan Stokes 0
anti-Stokes.
La regla de seleccion para que exist a dispersion Raman es que la polariza-
bilidad de la molecula cambie con la vibracion para que tenga una transicion a
un nivel diferente de energia. Tenemos en este caso que tanto el N2 como el O 2
muestran espectro vibracional Raman, ya que la vibracion produce un cambio
en la polarizabilidad. En el caso del CO 2 el estiramiento asimetrico no produce
cambios en la polarizabilidad, pero el simetrico S1. Vemos entonces que algunas
vibraciones pueden observarse en IR, otras en Raman y otras mediante las dos
tecnicas.
Lo notable de la espectroscopia Raman es que la longitud de onda de la luz
incidente es bien diferente de la de la dispersada que nos interesa. Es decir que,
234 Temas de Biofisicoqufmica

- - - - - - - - - - - - - Estados electr6nicos
excitados

Estados
virtuales

hv -------n-----'
JV\/"+

Estados cuanticos
vibracionales

Linea Stokes Linea anti-Stokes

Figura B.6: Diagrama energetico de una molecula mostrando el origen de la dispersion Raman
(efecto Raman no resonante). N otense los diferentes mecanismos de los efectos Stokes y
anti-Stokes. La molecula alcanza, momentaneamente, un nivel de energia mas alto (estado
virtual), pero nunca llega a un est ado electronico excitado.

en tanto que la mayor dipersion es del tipo Rayleigh elastica, con longitud de
onda igual a la luz incidente, la luz dispersada por efecto Raman (inelastica)
estara muy bien diferenciada en frecuencia. Esto nos permite irradiar a la
muestra con luz ultraviolet a 0 visible y observar frecuencias en el infrarrojo,
don de se producen las transiciones vibracionales, 10 que hace posible acceder a
regiones don de el solvente posee bandas de absorcion. En el caso de las muestras
biologicas represent a una gran ventaja, particularmente por la absorcion del
agua.
Cuando la frecuencia de radiacion posee una longitud de onda que puede
excitar niveles electronicos, es decir que irradia en una frecuencia de absor-
cion, si existe dispersion inelastica se puede producir el efecto de resonancia
Raman. La diferencia radica en que la sensibilidad es mayor que en la disper-
sion Raman no resonante. Ademas de la ventaja obvia de mayor sensibilidad,
es posible estudiar alglin grupo en particular que, encontrandose en la banda
de resonancia, se destacara sobre los otros debido a la mayor senal obtenida.
B. Espectroscopfa 235

B.3. Resonancia magnetica muclear

La resonancia magnetica nuclear ha sido desde su aparicion un elemento


importante en la investigacion biologica. Con el subsecuente avance de dicha
tecnica se ha convertido cada vez mas en un elemento fundamental, particu-
larmente en el estudio de biomacromoleculas. Esta situacion ha llegado a tal
punta que es casi imposible encontrar una revista en la que no hagan referencia
a tal tecnologia. La aparicion de la resonancia magnetica nuclear bidimensional
(2DNMR) ha acentuado aun mas la situacion, ya que es posible, bajo ciertas
circunstancias, determinar estructuras en solucion. La lectura de los trabajos
que hacen referencia a cualquier tecnica solo result a provechosa si se posee
un minimo de conocimientos como para poder efectuar un analisis crltico del
texto. El proposito de estas notas es precisamente brindar una serie de in-
formacion minima como para poder interpretar trabajos en los que se utiliza
2DNMR. Asimismo puede ser un punta de partida para un estudio mas de-
tallado. La resonancia magnetica bidimensional se menciona cualitativamente.
Un estudio mas detallado requiere la comprension de los metodos pulsados.
Los fundament os necesarios se presentan en el Apendice C, cuya lectura se
recomienda a quienes pretenden avanzar en el tema.

B.4. Conceptos basicos de resonancia magnetica nuclear

B.4.1. Niveles de energfa nucleares

El tratamiento apropiado para un nucleo, debido a su tamano, corresponde a


la mecanica cuantica. En este formalismo, el movimiento de rotacion alrededor
de su eje, el espin, esta asociado a su momento mecanico, el cual se expresa
como:

Ih
(B.6)
27r'
don de h es la constante de Planck( = 6,626 x 10- 34 J s) e I el numero cuantico
de espin, el cual tiene valores multiplos enteros de 1/2.
Toda carga en movimiento genera un campo magnetico y en consecuencia
una particula cargada en rotacion posee un momento magnetico J..L que en
nuestro caso esta dado por:

,Ih
J..L = 27r' (B.7)
236 Temas de Biofisicoqufmica

don de , es la relaci6n giromagnetica (caracteristica de cada nucleo) que indica


la contribucion del movimiento mecanico al momento magnetico (esquemati-
zado en la figura B. 7) .

Figura E. 7: Esquema de la relaci6n entre el momento mecanico y el momento magnetico.

Para el caso de los protones, los cuales representan nucleos altamente rele-
vantes para la resonancia magnetica nuclear (rmn), tenemos 2 que 1= 1/2 , 10
que nos da un momento magnetico J.l = ,h/27r = 1,41 X 10- 26 J /T =1,41 x 10- 23
erg/gauss.

Energia

-
Figura E.8: Un conjunto de espines orentadoa la azar con lamisma energia.

La figura B.8 muestra un sistema de espines y su correspondiente energ{a.


Si aplicamos un campo magnetico Ha, para el caso de protones, aparecen
dos orientaciones preferentes del momento magnetico: paralelo y antiparalelo
al campo magnetico. Esto, en terminos de mecanica cwintica, implica que
el nivel de energ{a del sistema se ha desdoblado en dos, 10 que se denomina
desdoblamiento Zeeman.
La diferencia entre los niveles de energ{a depende del valor del campo

2Los operadores J.L e I tiene caracter vectorial y sus componentes, en x, por ejemplo, seran /Lx e
Ix respectivamente. En ocasiones cuando se trata de componentes en una direci6n arbitraria no la
indicaremos.
B. Espectroscopfa 237

magnetico externo. En terminos generales un nucleo de esp{n I tiene 21 + 1


niveles de energ{a equiespaciados con una separacion:

/).E = J1Ho/ I, (B.8)


don de Ho es el campo magnetico aplicado.
En el esquema mostrado en la figura B.g no debemos considerar que la 0-
rientacion nuclear sera rigidamente paralela 0 anti-paralela respecto del campo
externo. Cuando se aplica un campo magnetico los nucleos tienden a alinearse a
10 largo del mismo, pero al mismo tiempo se produce un movimiento de rotacion
(precesi6n) alrededor de un eje aline ado con el campo magnetico. A menos
que queramos estudiar espedficamente este movimiento, representaremos los
nucleos como fiechas alineadas paralelas 0 antiparalelas con el campo externo.

i
H

Campo externo
Nuc!eo _
bajo precesion
1 RepiBsentaci6n

Figura E.g: Diagrama del efecto de precesion nuclear y la representacion con vectores aline a-
dos paralela y anti-paralelamente al campo externo.

Si incide una radiacion sobre el sistema, se podran producir transiciones


de un nivel a otro de energ{a en tanto la frecuencia de la radiacion, Hamada
frecuencia de Larmor, corresponda a:

Vo =/).E/h =,Ho/27r [Hz], (B.g)


Wo = 27rvo = , Ho [rad- 1 ]. (B.I0)

Esta frecuencia es ademas la frecuencia de precesion. Hemos indicado con Ho


a la componente del campo en la direccion de aplicacion del mismo.
Si hay una absorcion neta de energ{a, mas nucleos se moveran desde el
est ado de energ{a mas bajo al mas alto. La poblacion relativa de los est ados
depende del factor de Boltzmann exp /).E / kT.
Los nucleos que tienen un numero par de protones y neutrones tienen esp{n
cero, por ejemplo 12C, 16 0 Y 37S, los que no daran senal en nmr. Algunos
nucleos con esp{n diferente de cero se muestran en la tabla B.1.
238 Temas de Biofisicoqufmica

m
3 mlLH

~-{];
2
T
E ~H
2
Figura B.I0: Desdoblamiento de los niveles de energia para un micleo de espin ~ en un campo
H.

Cuadra B.I: Algunos nucleos con espin diferente de cero. Se indica la frecuencia correspon-
diente a un campo de 10 kGauss.

Nlicleo I J-l/(l0-23 erg/gauss) v/Hz


IH 1/2 1.410 42.600
2H 1 0.433 6.536
13C 1/2 0.335 10.705
14N 1 0.205 3.076
19F 1/2 1.327 40.060
23Na 3/2 1.119 11.262
27 Al 5/2 1.837 11.094
29Si 1/2 0.570 8.458
31p 1/2 0.570 17.236
17
0 5/2 0.956 5.772
34CI 3/2 0.415 4.172

En el caso de esp{n 1/2 se produce un desdoblamiento en dos niveles de


energ{a, pero para otros valores aparecen mas de dos. Hay 21 + 1 niveles,
valor que surge del numero cuantico magnetico m = 1,1- 1,1- 2, ... , -1.
Por ejemplo, para un nucleo con 1 = 3/2 como el 23Na hay cuatro niveles de
energ{a. Las transiciones permitidas son 6.m = ±1, 10 que nos da que todas
tienen la misma diferencia de energ{a 6.E = ,h/17rH. (fig. B.I0).
B. Espectroscopfa 239

~E=lH
2rc

Niveles de energia

~E=hu no = n .. +n.
u=lH ~1 ~E
2rc n.. -n. = 2 n O kT

Figura B.ll: Representaci6n de la distribuci6n de la poblaci6n de espines entre dos niveles


de energia. La orientaci6n de los espines sigue la distribuci6n de Boltzmann.

Relajaci6n

En equilibrio, los nucleos se distribuyen entre los niveles de energ{a de acuer-


do con la distribuci6n de Boltzmann (fig. B.ll). Cuando se 10 aparta del est ado
de equilibrio, por ejemplo, por la aplicaci6n de una radiofrecuencia apropiada,
el sistema de esp{n vuelve a su est ado de equilibrio con el medio mediante
un proceso de primer orden cuyo tiempo caracteristico es el llamado tiempo
de relajaci6n esp{n-red (Tl). Este tiempo depende del sistema en particular y
puede variar dentro un rango enorme (aproximadamente entre 10- 4 a 104 s).
Dado que esa relajaci6n no es instantanea sino que, como mencionamos, de-
pendera del tiempo de relajaci6n caracteristico de cada material, la aplicaci6n
de una radiaci6n de muy alta potencia puede llegar a saturar el sistema, es
decir a mantener la mayor{a del los espines en el est ado excitado. En esas
condiciones la senal dejara de observarse. Un metodo para medir el tiempo de
relajaci6n es precisamente la medici6n de la intensidad de la senal en funci6n
de la potencia entregada al sistema por la radiaci6n.
El proceso de relajaci6n en el cual el sistema de espines transfiere energ{a
al medio y que se caracteriza con el tiempo Tl no es el unico. Cuando el
sistema de esp{n se aparta del equilibrio, requiere que se produzca ademas una
redistribuci6n de la misma entre los espines. Este proceso involucra intercambio
de energ{a entre espines y posee un tiempo caracteristico denominado tiempo
240 Temas de Biofisicoqufmica

de relajacion espln-espln (T2).


El ancho de linea esta gobernado fundamentalmente por el proceso de rela-
jacion espln-espln, resultando

1
1/1/2 = T2 (B.ll)

don de 1/1/2 es el ancho de la linea a mitad de altura.


Este ancho de linea, que podriamos Hamar "natural", se ve incrementado
por la inhomogeneidad del campo aplicado. El proceso es muy facil de entender
considerando los diferentes micleos al estar sometidos a campos ligeramente
diferentes, ya que el campo no es perfectamente homogeneo, tendran frecuen-
cias de resonancia ligeramente diferentes tambien. El tiempo de relajacion
observado se indica como T*. Por 10 tanto, si indicamos con c5 Ho a la inho-
mogeneidad del campo, podemos escribir la inversa del tiempo de relajacion
observado como:

1 1
-*
T2
= -+
T2
bc5 H o) 1/2 (B.12)

don de el ultimo termino es la contribucion al ancho de linea debido ala inho-


mogeneidad del campo.

B.4.2. Precesion nuclear

El fenomeno de resonancia magnetica se entiende mas claramente desde


el punta de vista de la mecanica cuantica. Sin embargo, ciertos fenomenos
pueden visualizarse mejor considerando el tratamiento clasico. Tal es el caso de
los experimentos de pulsados, en los que est amos particularmente interesados.
Por medio de la mecanica clasica es facilmente demostrable que el momento
(torque) ejercido por un campo magnetico (Ho) sobre un momento magnetico
e
que forman un angulo entre Sl, produce un movimiento de precesion del mo-
mento magnetico alrededor del campo. La frecuencia de rotacion corresponde
ala frecuencia de Larmor, dada por las ecuaciones:

(B.13)
(B.14)

don de indicamos el caracer vectorial de la rotacion. El signo negativo se refiere


a la direccion de rotacion (ver figura B.12).
B. Espectroscopfa 241

Si se aplica un campo de radiofrecuencia se produce absorcion de energia


unicamente cuando se satisface la condicion de resonancia, es decir cuando

(B.15)
El campo de radiofrecuencia Hi puede considerarse como rotando (a su
propia frecuencia) en un plano perpendicular a H a , que llamaremos xy. El mo-
mento magnetico J1 se encuentra rotando a la frecuencia de Larmor, por efecto
del campo magnetico Ha formando un angulo e. Si el campo de radiofrecuen-
cia Hi posee la frecuencia apropiada se producira absorcion de energia y el
angulo entre el momento magnetico y el campo se modificara. Sin embargo la
frecuencia de rotacion permanecera constante.
En la practica nunca estudiamos un momento magnetico nuclear aislado
sino un conjunto de nucleos identicos. Todos preceden a la misma frecuencia
pero no hay razon para que exist a coherencia en su movimiento en el plano
xy. Por otra parte, no existe forma de distinguir los ejes x e y. Si existe una
direccion preferencial a 10 largo del eje z, producida por el hecho de haber
designado como z al eje aline ado con el campo magnetico.
Pese a que la alineacion de los espines no es completa, parte de los momentos
magneticos se encuentran en una direccion paralela al campo externo y parte
en direccion contraria (antiparalela). Puesto que la distribucion de Boltzmann
favorece ligeramente la direccion de minima energia, existira mayor cantidad de
nucleos orient ados a favor que en contra del campo. En consecuencia estaremos
frente a una magnetizacion macroscopica M. El proceso puede verse en forma
esquematica en la figura B.12.
l,Como se mide el fenomeno de resonancia magnetica nuclear? Un esquema
simplificado de un aparato de rmn se muestra en la figura B.13.
Como dijimos, la frecuencia de resonancia es la que satisface la condicion
del proceso de emision-absorcion, es decir 6.E = ,h/27rIHI = Hv. Para obser-
var el fenomeno podemos 0 bien cambiar la frecuencia y mantener el campo
externo constante 0 cambiar el campo externo a frecuencia constante. Ambos
metodos son utilizados en los equipos y los resultados se expresan en funcion
de la frecuencia 0 el campo, independientemente del metodo utilizado para la
deteccion.

Desdoblamiento dipolar
En el caso de sustancias en est ado solido 10 protones tienen posiciones bien
definidas, por ejemplo, en los hidratos cristalinos (10 que no ocurre en los
Hquidos). En esta situacion los protones vecinos modifican el campo magnetico
242 Temas de Biofisicoqufmica

r
z

y y.

a)
b)

Figura B.12: Precesi6n de un momento magnetico alrededor de un campo magnetico estatico


Ho. El campo de radiofrecuencia Hi rota en el plano xy. a) Un momento aislado. b) Un sistema
de moment os identicos. Ho es el campo externo y M es el momento magnetico neto producido
por la alineaci6n de los espines nucleares. Por razones de simplicidad se ha eliminado la
precesi6n producida por el campo Hi; el detalle se muestra en el Apendice C (§C.2, fig.C.l).

local. La resonancia no se lleva a cabo entonces a la frecuencia determinada


por el campo externo sino que sufre ciertas modificaciones.
Vemos en la figura B.14 que el campo magnetico dipolar depende de como
el vector proton-proton esta orientado respecto del campo magnetico externo,
de tal manera que el campo magnetico que realmente actua sobre el nucleo
esta dado por:

H = Ho ± (3/2) ~ (3 cos 2 e - 1), (B.16)


r
que produce un desdoblamiento de la linea. En la figura B.15 podemos ver una
senal resultante del desdoblamiento dipolar.
Si existen diferentes orientaciones para los pares protonicos (por ejemplo,
muchas moleculas de agua en un cristal), el desdoblamiento estara dado por
el promedio espacial y temporal.
En el caso de polvos cristalinos la orientacion es tan dispersa que las difer-
entes lineas se encuentran muy proximas, de tal manera que en lugar de ob-
servar desdoblamientos vemos un ensanchamiento de la linea, similar a la que
muestra la figura B.16.
Si se trata de un liquido, agua por ejemplo, los protones se mueven muy
rapido, haciendo que todas las orientaciones sean igualmente probables. La
B. Espectroscopfa 243

Frecuencia de
resonancia

Figura B.13: Esquema de las ideas basicas de un equipo de rmn.

Figura B.14: Para un par de prot ones 1 y 2, el momento magnetico dipolar brinda una
contribucion extra al campo de los micleos vecinos. Puesto que el proton tiene dos est ados
("arriba" 0 "abajo") este campo puede sumarse 0 restarse al externo.

contribucion de los protones vecinos al campo magnetico (campo local) se


expresa como:

(B.17)

don de la barra indica el promedio sobre todas los angulos e posibles. El resul-
tado es cero puesto que:

(3cos 2 e -1) = -
1 17r/2 (3cos
e -1)27rsinede
2
= o. (B.18)
47r 0
El result ado es que observaremos una unica linea.
244 Temas de Biofisicoqufmica

I I

Figura B.15: Desdoblamiento de linea por interacci6n dipolar.

---+

Figura B.16: Linea producida por un polvo cristalino.

B.4.3. Corrimiento qufmico

El corrimiento quimico se produce porque los electrones involucrados en


los enlaces qUlmicos generan por infiuencia del campo magnetico externo co-
rrientes electronicas. Estas corrientes producen campo magneticos locales. El
efecto neto es un apantallamiento del campo externos (en general las corrientes
electronicas producen campos opuestos al externo) y, para compensar este
apantallamiento, la resonancia se ad qui ere con un campo externo mayor al
que corresponderia al nucleo aislado.
Existen casos, como el sistema de electrones 7r (por ejemplo en el benceno),
en el cual las corrientes electronicas se producen en la direccion del campo
(anti-apantallamiento) y el corrimiento qUlmico es hacia campos (externos)
menores (ver figura B.18).
Existen otros efectos importantes, como el acoplamiento espln-espln que
pueden ser utilizados como herramientas anaHticas.

B.4.4. Tiempos de relajaci6n en Ifquidos

Los tiempos de relajacion son importantes para el estudio de la hidratacion.


Tanto Tl como T2 estan determinados por el est ado dinamico del material
estudiado, en particular son afectados por la temperatura del sistema. En un
sistema de dos espines 1/2, como en el agua, las interacciones estan moduladas
B. Espectroscopfa 245

Movimiento de los Campo


Corriente electr6nica magnetico inducido
electront· .. ,,"

. ':.:.~;:> :0?;";:'~~,.: .: . •• I: ;:~,;~.:~·~.,; .


, .... :.>::.~.~ ····/;·~:·~(~U~~:;::~~·:·: .

~'~~~~~'
El campo extemo Se produce una La corriente electr6nica
actua sobre los electrones corriente electr6nica genera un campo
magnetico.

Figura B.17: Esquema del efecto del campo extemo sobre el movimiento de los electrones.
N6tese que la direcci6n convencional de la corriente electric a tiene direcci6n opuesta a la
direcci6n de movimiento de los electrones.

por los choques con otras moh§culas de la muestra. Los tiempos de relajacion
en este caso se pueden escribir como:

(B.19)

(B.20)

B.4.5. Efecto Nuclear Overhauser


Dados dos nucleos acoplados, la senal de uno de ellos puede ser alterada
mediante la irradiacion intensa sobre el otro. Esta alteracion consiste en un
cambio en la intensidad a su frecuencia regular y la aparicion de otra senal
a una frecuencia diferente. Esta situacion puede ocurrir cuando los nucleos se
encuentran Hsicamente cerca, de tal manera que se produce un acoplamiento
entre ambos. Este efecto es llamado "Efecto Nuclear Overhauser" (Nuclear
Overhauser Effect, NOE) y ha sido utilizado para obtener informacion deta-
llada de ciertos espectros. El fenomeno ocurre puesto que la irradiacion extra
recibida por el nucleo cercano hace que cambie la relacion de poblacion de los
espines nucleares, y debido ala cercan{a, se produce un cambio en la poblacion
246 Temas de Biofisicoqufmica

Corriente en los El campo magnetico producido


electrones it del anillo por la corriente electronica
tiene la direccion de H

Figura B.18: Efecto del campo externo en las corrientes producidas en orbit ales 7r.

del nucleo vecino. El acoplamiento puede deberse ala interaccion escalar espln-
espln (J) producida por la conectividad a traves de los enlaces qUlmicos 0 por
el acoplamiento a distancia. La interaccion entre los momentos nucleares que
produce el efecto es proporcional al cuadrado de la interaccion dipolar (ver
§B.4.2), es decir que depende de r- 6 . En la pnictica, esto significa que obser-
varemos el efecto si los nucleos se encuentran a una distancia d :::; 0, 5nm. Esta
circunstancia se explota en el caso de la resonancia magnetica bidimensional
para determinar la estructura de poHmeros en solucion.
La figura B.19 muestra un ejemplo don de muestra la senal de 19F en N a2P03F
cuando se irradia la resonancia del 23Na en Na2P03F. En este caso se trata de
un acoplamiento escalar heteronuclear.

____A_-----JI\'-----~~
Figura B.19: Senal de FIg en Na2P03F bajo irradiaci6n de la resonancia del Na2P03F, la
linea central no aparece sin doble irradiaci6n

B.4.6. La resolucion de estructuras por nmr

La tecnica de aplicacion de pulsos diferentes (doble irradiacion) recibio un


gran impulso con el advenimiento de la Hamada resonancia magnetica bidi-
mensional, 10 que consiste en observar el espectro no solamente en funcion
B. Espectroscopfa 247

de una frecuencia sino de dos. 3 Desde el punta de vista tecnico no se aplican


frecuencias variables sino secuencias de pulsos. La tecnica posee cierta com-
plejidad y el desarrollo de los detalles esta fuera del proposito de este libro;
sin embargo, haremos una descripcion cualitativa en vistas a su aplicacion a
la determinacion de estructuras tridimensionales en solucion.
Conceptualmente no es de extraiiar que la irradiacion con una frecuencia
variable sea reemplazada por la aplicacion de un pulso, ya que si analizamos
una funcion escalon mediante una transformada de Fourier encontraremos in-
finitas frecuencias a 10 largo del espectro. La idea basica de la resonancia
magnetica pulsada (que se describe con mas detalle en el Apendice C) es que
si perturbamos el sistema de espines con un pulso, este comenzara un pro-
ceso de decaimiento libre hacia el equilibrio, 10 que nos describe un proceso
de relajacion. Diferentes esquemas de pulso nos permite lograr una descrip-
cion detallada de las propiedades de la muestra desde el puno de vista de la
resonancia magnetica.
En un experimento bidimensional (2D-NMR) la dependencia del tiempo de
la magnetizacion se mide en terminos de dos tiempos diferentes (que dependen
de la secuencia de los pulsos aplicados) y, luego de procesar los datos medi-
ante transformada de Fourier, se representan las amplitudes en funcion de dos
frecuencias.
La utilizacion de esta metodologia a la resolucion de estructuras tridi-
mensionales de proteinas en solucion fue impulsada especialmente por Kurt
Wiitricht, quien recibiera el premio Nobel en 2002 por esos trabajos.
El plegamiento de una proteina pone en proximidad aminoacidos que se
pueden encontrar muy alejados en la secuencia. Si podemos contar con un
mapa de proximidades, es posible encarar con probabilidades de exito la reso-
lucion de la estructura tridimensional. Dado que el efecto nuclear Overhauser
puede indicarnos la proximidad de ciertos nucleos, podriamos aprovechar esa
circunstancia para intentar encarar con exito el problema de la resolucion de
la estructura.
El proceso no es simple, cada aminoacido posee cuatro 0 cinco protones,
por 10 que en una proteina de 100 aminoacidos tendriamos alrededor de 500
protones, con la consiguiente complejidad del espectro. En primer termino es
necesario asignar la senal de cada proton al aminoacido correspondiente, para
10 cual se hace uso de diferentes metodos. A este efecto se utiliza un tipo
de experimento denominado COSY (correlated spectroscopy) que hace uso del

3S e han desarrollado tecnicas donde se consideran incluso mas de dos frecuencias, a 10 que se
suele referir, por generalidad, como resonancia magnetica multidimensional.
248 Temas de Biofisicoqufmica

efecto Overhauser a traves de la conectividad de los enlaces.

l\
!\

B)
A


• 0
x
o •
x
Figura B.20: A) Esquema de un experimento COSY homonuclear con dos pulsos de 90° no
selectivos. tl es el tiempo de evoluci6n y t2 el tiempo de obervaci6n. Se realiza la observaci6n
para diversos tiempos de evoluci6n B) representaci6n bidimensional esquematica (frecuencias
WI y W2) de los resultados para un sistema de espin AX.

La figura B.20 muestra un esquema del experimento de COSY homonuclear.


Vemos que es posible identificar protones que poseen conectividad a traves del
enlace. En la parte a) de la figura se puede ver un esquema de los pulsos
aplicados; se efectuan numerosos experimentos con el tiempo tl (el intervalo
entre pulsos) variable y se recoge la evolucion de la magnetizacion hast a su
relajacion total a 10 largo de h La transformada de Fourier bidimensional
(en tl y t2) produce la respuesta en dos frecuencias. La parte b) de la figura
muestra un result ado hipotetico expresado como curvas de nivel en el plano
WI, W2. Se puede ver que en cada par de senales (correspondiente a nucleos
correlacionados) se observan picos fuera de la diagonal. Los picos a 10 largo de
la diagonal representan el espectro bidimensional del compuesto.
Del estudio de los picos fuera de la diagonal del espectro y el conocimiento
B. Espectroscopfa 249

Gly Ala
AX

Figura B.21: Diagrama esquematico de la posicion bidimensional de los picos de los prot ones
para alanina y glicina en un experimento COSY homonuclear.

de la estructura de los aminoacidos es posible identificar a que aminoacidos


corresponde cada pico. Un ejemplo de la 'impresion digital' que poseen los
aminoacidos en un espectro COSY se muestra en la figura B.21 para Gly y
Ala. La realizacion de este tipo de experimentos en segmentos cortos y la poste-
rior integracion de los resultados permite asignar completamente los protones
a cada aminoacido a 10 largo de la secuencia. Existe otra variante de COSY
denominada espectroscopia espin-eco bidimensional (SECSY) cuyos detalles
no discutiremos aqul. Las figuras B.22, B.23 y B.24 muestran el espectro del
inhibidor K, un analogo del inhibidor de la tripsina pancreatica bovina (bovine
pancreatic trypsine inhibitor - BPTI), en su representacion clasica, tridimen-
sional y bidimensional respectivamente.
Una vez asignados los picos a cada aminoacido a 10 largo de la proteina
debemos conocer la cercania espacial de cada residuo. Tambien aqui es posible
utilizar el efecto nuclear Overhauser pero con una secuencia de pulsos que
ponga en evidencia el acoplamiento a distancia, el cual se denomina NOESY
(de: Nuclear Overhauser Spectroscopy).
La figura B.25 muestra la secuencia de pulsos y un espectro NOESY de
BPTI. No es posible a simple vista distinguir entre un espectro COSY de
uno NOESY. Los picos de fuera de la diagonal indican aqui que los protones
involucrados en la conexi on se encuentran a menos de 0,5 nm de distancia.
Dado que se ha asignado a cada pi co su pertenencia a un aminoacido particular
de la secuencia es posible conocer la proximidad de los mismos.
250 Temas de Biofisicoqufmica

DHO
a)

10 8 6 4 2 9 8ppm

Figura B.22: Espectro de rmn del inhibidor K; representacion mono dimensional (de la refer-
encia [1]).

La determinacion de la estructura a partir de la informacion que hemos


mencionado no es simple, pero sin embargo se llegan a obtener resultados de
muy buena calidad. A efectos de mostrar la racionalidad del enfoque veamos
un caso hipotetico. La parte a de la figura B.26 muestra una supuesta cade-
na polipeptldica don de se han marcado la conectividad espacial de algunos
aminoacidos. La busqueda de una estructura compatible con las proximidades
senaladas nos llevan a la estructura que se muestra en la parte b). 0 bvia-
mente en este proceso se deben considerar las restricciones que imponen las
propiedades de las proteinas.
La movilidad de las proteinas en solucion no permite encontrar una unica es-
tructura, tal como se logran estructuras mediante cristalografia. Por 10 tanto es
de esperar que ciertas regiones posean un movimiento que producira una ima-
gen "borrosa" de la macromolecula. Las determinaciones de estructura por rmn
producen no una sino varias posibles que tienen muchas regiones en comun.
La figura B.27 muestra las estructuras tridimensionales del BPTI obtenidas
por rmn [2]. En la figura se superponen nueve estructuras compatibles con los
resultados experimentales.
B. Espectroscopfa 251

b)

COl (ppm)
o
2
4
6
8
10

10 8 6 4 2 o
CO 2 (ppm)

Figura B.23: Espectro de rmn del inhibidor K; COSY en su representacion tridimensional (de
la referencia [1]).

En un espacio tan breve ciertamente no es posible describir una tecnica


complicada en sus detalles. Lo antedicho solamente pretende ser informativo
de sus caracteristicas mas salientes. La resonancia magnetica nuclear bidimen-
sional para la determinacion de estructuras en solucion es de fundamental
importancia. Mediante esta tecnica ha sido posible establecer que en Hneas
generales el esqueleto de una proteina en solucion coincide con el determinado
en los cristales, una pregunta importante y hasta hace poco sin respuesta. En
el Apendice C damos una sombera descripcion de los metodos de uso y su
extension a rmn multidimensional.
252 Temas de Biofisicoqufmica

CD j ! ppm
o

10

10 4

Figura B.24: Espectro de rmn del inhibidor K; COSY en su representacion bidimensional.


Las line as de punta seiialan prot ones correlacionados (de la referencia [1]).

,.
, .. ..?.__........~ . . +... ~.'"'.......~. G;'
. : ;: ·:·~~=::::~:7;:~3:~;~ 2

.~~j~:~.:~ .{~~::~.~~:.,- .' . 4

;' "'j'" ·t~.:·-:·· . .


6

8 6 4

Figura B.25: Representacion bidimensional de un spectro NOESY correspondiente a BPTI


(de la referncia [1]).
B. Espectroscopfa 253

a) [- - i- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - f: : : : : : ::::::::::::::::::::~~~~~~~~~t----!
J .:
!________________________________________ ~=::::::::~ ___________________lL______________

Figura B.26: Esquema de una protein a hipotetica a) Estructura primaria; se han seiialado
ciertos residuos que se encuentran pr6ximos en el est ado plegado. b) Estructura tridimen-
sional.

Figura B.27: Estructura de BPTI obtenida mediante rmn (de la ref. [2]).
Bibliograffa

[1] K. Wiithricht, NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley, New York,
1986.

[2] K.D. Berndt, P. Guntert, L.P.M. Orbons & K.Wiithricht: J.Mol.Biol.,


227, 757, 1992.

Lecturas suplementarias

Espectroscop(a optica

• KE. van Holde, Physical Biochemistry, Capitulo 8, Prentice-Hall, Englewood


Cliff, New Jersey, 1871.

• Jr.!. Tinoco, K Sauer, J.C. Wang & J.D. Uglisi, Physical Chemistry 4ta. Ed.,
Capitulo 10, Prentice Hall, Upper Saddle River, New Jersey ,2002.

Resonancia Magnetica Nuclear

• Carrington A. & McLachlan A.D.: Introduction to Magnetic Resonance, Harp-


er International Edition, New York, 1967.

• Slichter C. P.: Principles of Magnetic Resonance, Harper International Student


Reprint, New York, 1963.

• Poeple J. A., Schneider W. G. & Bernstein H. J.: High-resolution Nuclear


Magnetic Resonance, McGraw-Hill, New York, 1959.

• Farrar T.C. & Becker E.D.: Pulse and Fourier Transform NMR, Academic
Press, 1971.

• Wuthricht K: NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley, New York, 1986.

255
Apendice C

Resonancia magnetica nuclear pulsada

Para desarrollar las ideas de los metodos de pulso es conveniente trabajar con la
magnetizacion macroscopic a y estudiar el comportamiento de esta y los efectos de
relajacion. El comportamiento de la magnetizacion macroscopic a en presencia de un
campo magnetico fue estudiado por Bloch. En la siguiente seccion estudiaremos las
ecuaciones que rigen tal comportamiento.

c.1. Las ecuaciones de Bloch

Las ecuaciones de Bloch se obtienen a partir de considerar el movimiento de la


magnetizacion macroscopic a en presencia de un campo magnetico. Dicho movimien-
to se puede estudiar considerando las ecuaciones diferenciales fenomenologicas. La
ecuacion clasica del movimiento de un momenta magnetico JL en un campo magnetico
H puede escribirse como

dp/dt = JL 1\ H. (C.l)

La ecuacion C.l indica que el cambio en el momenta angular p del nucleo depende
del momenta ejercido por el campo externo, igual al producto vectorial JL 1\ H. De
este cambio se produce la precesion mencionada en la seccion anterior. Multiplicando
ambos miembros de la ecuacion C.l por I y recordando que JL = IP se obtiene

dJL/dt = Idp/dt = IJL 1\ H. (C.2)

Si M es el vector suma de todos los moment os individuales JL, obtendremos la


ecuacion del movimiento de la magnetizacion macroscopica como

dM/dt = 1M 1\ H. (C.3)

257
258 Temas de Biofisicoqufmica

Puesto que nos resulta conveniente trabajar con las tres componentes cartesianas
de los vectores tendremos

1 J k
M/\H= Mx My M z = (MyHz-MzHy)i+
Hx Hy Hz

(C.4)

Tanto en la ecuacion C.3, como en la C.4 el campo magnetico H se refiere al campo


total, es decir incluye tanto Ho como el campo de radiofrecuencia HI. Consideremos
que el campo aplicado posee la frecuencia w y rota en el plano xy. En este caso las
componentes x, y, z del campo magnetico senin

HI coswt, (C.5)
HI sinwt, (C.6)
Ho. (C.7)

De las ecuaciones C.3, C.4 y C.5-C.7 podemos obtener las ecuaciones de las
variaciones del momenta magnetico macros co pi co en las tres direcciones cartesianas

dMx/dt ,(MyIHol + MzlHll sinwt) (C.8)


dMy/dt ,(MyIHll coswt + MxlHo)1 (C.g)
dMz/dt -,(MzIH11 sinwt + MylHll coswt). (C.lO)

En las ecuaciones C.8-C.lO no se ha tenido en cuenta la relajacion. La variacion


del momenta magnetico total se ha escrito en terminos de los campos actuantes, sin
embargo nosotros sabemos que existe transferencia de energia entre los componentes
del sistema y del sistema al medio externo (que designamos como la red). Bloch
supuso que ambos procesos de relajacion, a los que nos referimos anteriormente, se
pueden tratar como procesos de primer orden con tiempos caracteristicos Tl y T 2 .
Las componentes Mx y My decaen a cero, en tanto que M z decae a su valor de
equilibrio Mo. Con estas suposiciones obtenemos a partir de las ecuaciones C.8-C.lO
las llamadas ecuaciones de Bloch
C. RMN pulsada 259

dMx/dt ,(MyIHol + MzlHII sinwt) - Hx/T2 (C.lI)


dMy/dt ,(MyIHII coswt + MxlHo) IH y/T2 (C.12)
dMz/dt -,(MzIHII sinwt + MylHII coswt)
-(Hx - Ho)/TI (C.13)

Vemos que T2 es el tiempo caracteristico de relajacion de las componentes x e y


del momenta magnetico. Estas componentes son las que llamamos transversales (con
respecto al campo magnetico externo) y en consecuencia se denomina a T2 tiempo
de relajacion transversal. Puesto que represent a el equilibrio dentro del sistema de
moment os magneticos nucleares, se 10 denomina tambien tiempo de relajacion espin-
espin. El tiempo T I , por el contrario, se refiere al tiempo caracteristico a 10 largo
del campo externo z, se 10 denomina tiempo de relajacion longitudinal. Es el tiempo
caracteristico de la transferencia de energia al entorno (la red), por 10 que reci be
tambien el nombre de tiempo de relajacion espin-red.

C.2. Sistema de referencia rotante

Los experiment os de pulso pueden interpretarse mas facilmente utilizando como


referencia no el sistema de laboratorio sino un sistema que rota alrededor del campo
externo y en la misma direccion que el movimiento de precesion de la magnetizacion.
La conveniencia de tal sistema se comprendera claramente y la podemos asimilar
a nuestra costumbre de utilizar el sistema de referencia rot ante fijo a la tierra.
Imaginense 10 complejo que seria calcular la trayectoria de un proyectil disparado
en la tierra con respecto a un sistema fijo a Alfa Centauro.
Para obtener las ecuaciones en el sistema de referencia rotante debemos saber
como transformar la ecuacion C.3. Aun dentro del nivel de detalle de estas notas es
interesante efectuar la transformacion detalladamente, con 10 que se vera su simpli-
cidad. Recordemos previamente como obtener la derivada temporal de un vector M
en termino de sus componentes. Supongamos

(C.14)

Si aplicamos las reglas regulares para obtener la derivada de un producto, ten-


dremos
260 Temas de Biofisicoqufmica

dM
dt

(C.15)
El movimiento de la magnetizacion con respecto al laboratorio es sumamente
complejo, ya que se adiciona al movimiento de presesion alrededor de Ho la precesion
alrededor de HI -que rota en el plano xy- como se muestra en la figura C.l.

x
Figura C.1: Representaci6n del movimiento de la magnetizaci6n M con la aplicaci6n de un
campo estatico Ho y un campo oscilatorio HI.

Puesto que i, j y k son vectores unitarios, la derivada temporal no cambia su


magnitud sino que resulta en una rotacion del vector. Esto se describe como el
producto vectorial entre la velocidad angular (de rotacion) y cada uno de los vectores
unitarios.

ai
- w /\ i, (C.16)
at
oj
- w /\j, (C.17)
at
ok
w/\k. (C.18)
at
Vemos que los tres vectores unitarios rotan a la misma frecuencia angular. De
esta manera podemos considerar como sistema de referencia al definido por est os
C. RMN pulsada 261

vectores unitarios, que rotan a frecuencia w respecto del sistema de laboratorio.


De las ecuaciones C.15 y C.16-C.18, la derivada de M respecto del tiempo puede
escribirse entonces

dM
(C.19)
dt
El primer termino del segundo miembro represent a la derivada temporal del vec-
tor M en el sistema referido a los vectores unitarios, que rotan a la velocidad angular
w, y 10 referiremos como la derivada temporal en el campo rotante. El segundo termi-
no no es mas que el producto vectorial de w y M, de esta forma tenemos

(dH)
dt Jijo
(OH)
=
at rot
+ w /\ M. (C.20)

La derivada total, a la que hemos adicionado el subindice fijo, represent a el


movimiento total del vector M respecto del sistema fijo. La ecuacion C.20 nos mues-
tra que este movimiento puede descomponerse en dos partes; por una, la derivada
parcial respecto del tiempo, que represent a la variacion de M con el tiempo respecto
a un cierto sistema de referencia rot ante y, por otra, la rotacion a una cierta ve-
locidad angular. Esto simplifica las expresiones toda vez que estemos interesados en
la descripcion del movimiento del vector, puesto que podemos pensar en terminos
mucho mas simples en el sistema de referencia rotante y luego, si es que queremos,
adicionarle la componente de rotacion para obtener el movimiento en el sistema del
laboratorio. Si M represent a la magnetizacion, podemos escribir (ecuacion C.3)

M
( ddt ) = ,M /\ H, (C.21)
JO'JO
°

y la ecuacion C.20

M
( ddtrot
) =wM/\H-w/\M. (C.22)

donde hemos indicado la derivada como derivada total en lugar de parcial. El


subindice rot elimina toda ambiguedad.
Reordenando la ecuacion C.22, recordando que para dos vectores A y B es A /\
B = -B /\ A obtenemos

(d~) rot ,M/\H+,M/\wl, (C.23)

,M /\ (H + wi,), (C.24)
262 Temas de Biofisicoqufmica

El termino wi, tiene dimensiones de campo magnetico y puede considerarse como


un campo "aparente" creado por la rotacion del sistema. En forma alternativa es
posible escribir la variacion de la magnetizacion en el campo rotante en terminos de
un campo efectivo

M
( ddt r)o t = ,M /\ Hejee, (C.25)

donde

Hejee = H + wi,· (C.26)


Las ecuaciones C.22 y C.23 nos indican que es posible utilizar las ecuaciones del
movimiento ordinarias para expresar el movimiento de la magnetizacion en el sistema
de referencia rotante, a condicion de reemplazar el campo H por el campo efectivo
Hejee, dado por la ec. C.25. Podemos ver que en este sistema la magnetizacion
precede alrededor del campo efectivo.

C.3. Respuesta a pulsos de radiofrecuencia

C.3.1. La magnetizaci6n en el sistema de referencia rotante


El tratamiento de la magnetizacion en el sistema de referencia nos permitira tratar
mas facilmente ciertas situaciones interesantes para considerar el metoda de pulsos.
Supongamos en primer termino el caso en el que tenemos un campo magnetico
externo de magnitud H o, que consider amos aplicado a 10 largo del eje z. Considere-
mos un sistema de referencia que rota a una velocidad angular w = - , H, el valor
de la frecuencia de Larmor. Vemos de la ecuacion C.25 que, puesto que el campo
magnetico es H = Ho sera Hej = O. En estas condiciones, de acuerdo con la ecuacion
C.23, la magnetizacion M en el sistema de referencia rotatorio sera invariante en el
tiempo (su derivada temporal es nula).
Consideremos ahora la incorporacion de un campo oscilante HI perpendicular
a Ho (en el plano xy). El campo de radiofrecuencia w rotara, en el sistema del
laboratorio, a tal frecuencia. En el sistema rotante a velocidad w el campo efectivo
sera

(C.27)
Ala frecuencia de resonancia el campo ficticio wi, cancela exactamente el campo
Ho. En este sistema de referencia solo tenemos que considerar la interaccion entre
M y HI. Segun la ecuacion C.23 el vector magnetizacion M precede alrededor del
campo HI.
C. RMN pulsada 263

Puesto que HI se mueve, visto desde ellaboratorio, a la misma velocidad que el


sistema de referencia, podemos asignar la direccion de HI a 10 largo del eje rotante
x, que llamaremos x'. En consecuencia, y de acuerdo a la ecuacion de Larmor,
la magnetizacion rotara alrededor del eje x' (alrededor del campo HI) con una
frecuencia ,HI. Si el campo de radiofrecuencia HI se aplica durante un tiempo t p ,
la magnetizacion alcanzara en su precesion un angulo

(C.28)
Esta formula es fundamental para considerar los experiment os de pulso.
En el sistema rotante todo se simplifica enormemente. En la figura C.2 se pueden
observar dos casos en los cuales se aplican pulsos de diferente duracion.

a) z b) z

,
0
90 '-
180
0

______~(-n-/2-)-\~-y
'-

(n) ~ y

x "

Figura C.2: Precesi6n de M alrededor de HI en el sistema rot ante durante tiempos tp =


e/bHI ), correspondientes a pulsos de: a) 7r/2 (90 0 ) Y b) 7r (180 0 ).

C.3.2. Relajaci6n en el sistema de referencia rotante


Cuando se aplica un pulso de una dada duracion, la magnetizacion se apart a del
eje z rotando un cierto angulo. Inmediatamente despues de aplicado el pulso (repre-
sent ado en la figura C.3c), el vector magnetizacion, que tenia solamente componente
a 10 largo de z, adquiere una componente y (ver figura C.3a). El proceso de inter-
cambio de energia entre los diferentes nucleos, al que nos referimos previamente (ver
seccion §B.3), hace que el vector magnetizacion se distribuya en el plano xy (figura
C.3b). La componente M~ decae a cero con una constante de tiempo igual a T*. Ob-
servemos que este decaimiento se debe ala "distribucion" del vector magnetizacion
en el plano xy. Al mismo tiempo, la transferencia de energia hacia el medio hace que
la magnetizacion vuelva hacia el eje z, con un tiempo caracteristico TI (figura C.3d).
Finalmente transfiere totalmente su energia y recupera su valor inicial M z = Mo.
Vemos que el tiempo que caracteriza la desaparicion de la componente My, T2 (0
T*, en caso que la inhomogeneidad sea importante) no puede nunca ser mayor que
T I , el tiempo para recuperar el valor de equilibrio. En general tenemos que
264 Temas de Biofisicoqufmica

(C.29)
Relacion que nos indica el orden relativo de los tiempos de relajacion. La situacion
en la cualla frecuencia del campo aplicado HI Y la rotacion del sistema de referencia
difieren de la frecuencia de resonancia es comun e importante. En este caso el campo
"ficticio" w/, no cancela exactamente el campo Ho y queda un campo remanente
en la direccion z. Por 10 tanto,

I(Ho - w/,)2 + H211/2 (C.30)


(l/,)I(,H o - w)2 + (,H I )21 1/ 2 (C.31)
(l/,)I(wo - w)2 + (fHI)211/2. (C.32)
En este caso M precede alrededor de Hef en el sistema rot ante a una frecuencia
dada por

(C.33)
Cuando Wo - w # 0 est amos fuera de la condicion de resonancia. Esta situacion
puede ocurrir frecuentemente, por ejemplo: varios nucleos con diferente corrimiento
quimico; inhomogeneidad en el campo magnetico; campos dipolares estaticos en
solidos, donde cada nucleo experiment a no solamente el campo externo sino adem as
la accion de sus vecinos (caso de sumo interes en la determinacion de estructuras de
macromoleculas) .

C.4. Decaimiento libre de la magnetizaci6n

Trataremos de explicar en esta seccion el decaimiento libre (free induction decay),


para 10 cual supondremos que el campo de radiofrecuencia puede ser conectado 0
desconectado instantaneamente, de tal manera que el pulso puede considerarse como
rectangular. Asimismo consideraremos que la longitud de los pulsos (t,) es corta en
relacion con los tiempos de relajacion TI y T 2 , de tal manera que no se produce re-
lajacion alguna durante el tiempo tp. La ultima condicion se satisface con facilidad.
La ecuacion C.28 nos permite calcular el angulo de rotacion de M en el tiempo tp.
Generalmente los pulsos se refieren a ese angulo en lugar de a su duracion. Asi es
frecuente referirse a pulsos de 180° (1f) Y de 90° (1f /2). Consideraremos el compor-
tamiento del sistema inmediatamente despues de cortar el pulso. Supongamos un
pulso de 90° aplicado a 10 largo del eje x' en el sistema de referencia que rota a la
frecuencia del campo alterno aplicado. Tal como 10 indica la figura C.3a la aplicacion
del pulso alineara el vector Malo largo de y I. Inmediatamente despues de inter-
rumpido el pulso, la magnetizacion pierde coherencia (relaja) , como se observa en la
C. RMN pulsada 265

figura C.3b. El sistema esta preparado para detectar magnetizacion en el plano xy,
consecuentemente detectara la serral, la que, en cuanto el sistema comienza a relajar,
disminuira el tiempo. Esta es la serral del decaimiento libre, ya que los nucleos se
mueven "libremente", es decir que no est an movidos por el campo de radiofrecuencia
(figura C.3c). En un campo perfectamente homogeneo, la constante de decaimiento
sera T 2 ; en realidad, tal como 10 mencionamos previamente, la constante real de
decaimiento es T*. La figura C.3c muestra el pulso aplicado y la figura C.3d la serral
obtenida.
z z

,,
,
______~~M~~-+Y y

x
a) b)

C)CI~d)
Figura C.3: (a) Un pulso de 90 0 aline a M con el eje y'. (b) M decrece perdiendo coherencia.
(c) Pulso incidente. (d) Senal detectada.

La serral obtenida mide directamente el decrecimiento de la componente Mxy de


la magnetizacion, puesto que el sistema de deteccion esta preparado de modo tal de
utilizar como referencia de fase la radiofrecuencia. A pesar de que el pulso es de corta
duracion, la radiofrecuencia se aplica continuamente al detector como referencia. El
detector responde a la magnetizacion que tiene una relacion fija de fase respecto
de HI, luego, la que se produce a 10 largo de un eje fijo en el sistema de referencia
rotante, en este caso el eje y/. Supongamos ahora que la radiofrecuencia aplicada
difiere ligeramente de la frecuencia de Larmor del nucleo estudiado. Consideremos
nuevamente el sistema de referencia rotando a la frecuencia aplicada. Despues de
la aplicacion de un pulso de 90 0 , M se aline a a 10 largo del eje y/. La rotacion de
M con respecto al sistema de laboratorio no sera exactamente igual a la frecuencia
aplicada, ya que esta esta ligeramente desplazada respecto de la resonancia. En el
sistema rotante se observara, por 10 tanto, un movimiento relativo de M. El sistema
de deteccion, que utiliza como referencia la radiofrecuencia aplicada, registrara el
decaimiento de M zy , as! como el efecto de interferencia que ocurre, puesto que la
diferencia de velocidades entre Myel sistema rotante producira un continuo entrar
266 Temas de Biofisicoqufmica

y salir de fase. El resultado sera una serral repidamente alternante de amplitud


decreciente, cuya envolvente corresponde al decaimiento libre (figura C.4).

Senal Senal

'-

tiempo tiempo

a) b)

Figura C.4: Decaimiento libre (a). Para un pulso de radiofrecuencia igual a la frecuencia
de Larmor. (b) Para un pulso de frecuencia ligeramente diferente de la resonancia; en este
caso la envolvente de la curva oscilatoria es igual al decaimiento que se obtiene cuando la
frecuenca es exactamente la de resonanacia.

Si tenemos un sistema, digamos de prot ones , e intentamos irradiarlo con la fre-


cuencia de Larmor correspondiente, diferentes efectos, como corrimiento quimico 0
acoplamiento de espin, produciran un desplazamiento de la condicion de resonancia.
La situacion descripta en el parrafo anterior sera, en la practica, la mas frecuente. Si
el sistema posee varios nucleos del mismo tipo pero no equivalentes, es decir, con des-
plazamientos relativos de la condicion de resonancia, la serral detect ada sera mucho
mas compleja. La misma estara compuesta por la suma de las serrales provenientes
de cada uno de ellos. Esta informacion puede utilizarse para el analisis mediante
transformadas de Fourier. La medici on de tiempos de relajacion se efectua mediante
la aplicacion de una cierta secuencia de pulsos.

C.5. Medici6n de T1
Si bien nuestro objetivo no es detallar aqui los metodos de medici on de tiempos
de relajacion, daremos como ejemplo la metodologia para determinar el tiempo de
relajacion espin-red. De las diferentes posibilidades, un metoda muy comun es el que
emplea una secuencia 180° - 90°. El procedimiento se muestra en la figura C.3. En
primer termino un pulso de 180° invierte la magnetizacion a 10 largo del eje z'. Se
produce relajacion longitudinal, 10 que hace que M~ que comienza con un valor -Mo
se mueva hacia el equilibrio (Mo), pasando por cero. A un cierto tiempo t despues
de la aplicacion del pulso inicial se aplica un nuevo pulso, ahora de 90°, siempre a 10
largo de x', 10 que hacer rotar hacia el eje y I la componente de M z en ese instante.
Como resultado comienza un decaimiento libre cuyo valor inicial es proporcional a
la magnitud de M, es decir al valor de M~, a tiempo p. Esto proporciona un punta
C. RMN pulsada 267

de la curva mostrada en la figura C.3c. Despues de esperar un tiempo no menor de


cinco veces TI (10 que asegura el equilibrio, ya que a 5 T I , M~ = 0,993Mo), se repite
el procedimiento para un intervalo P diferente. De acuerdo a las ecuaciones de Bloch
C.ll-C.13, con Mx = My = 0, tenemos

(C.34)

Integrando esta ecuacion con M z = - Mo a t = 0

(C.35)

Esta es la funcion represent ada en la curva C.3d, curva que se obtiene experimen-
talmente mediante el procedimiento descripto en el paxrafo anterior. Para obtener
TI es necesario ajustar la curva experimental con la expresion teorica. En la pnictica
se reescribe la ecuacion C.35 como

In(AXl - Ao) = In(2A(p) - pITI' (C.36)

donde Ao es la amplitud inicial de la serral inmediatamente despues de aplicar un


pulso de 90° a tiempo p y Aoo es el valor de la serral, A(p), para un largo intervalo
entre los dos pulsos. La forma mencionada no es la {mica disponible para calcular
T I , una descripcion de las diferentes alternativas esta fuera de los alcances de este
libro.

e.6. Medici6n de T2 mediante espfn-eco


Salvo en el caso en que T2 « (2/,/:)..Ho) la contribucion de la inhomogeneidad
del campo externo al decaimiento hace que no sea posible utilizar T* como medida
de T 2 . Un metoda que permite eliminar este inconveniente es elllamado de espin-eco.
El mismo consiste en la aplicacion de una secuencia de 90°, T, 180° Y la observacion
del decaimiento libre despues de un tiempo 2T (figura C.5). El proceso que ocurre es
el siguiente. El primer pulso produce una rotacion de la magnetizacion alineandola
con el eje y/. Por efecto de la inhomogeneidad del campo Ho se produce una perdida
de coherencia. Con respecto al sistema de referencia rotante se observara que los
distintos espines se mueven en sentido horario 0 antihorario segun precedan mas
o menos rapidamente que la frecuencia de Larmor. Despues de cierto tiempo T se
aplica el pulso de 180°. La magnetizacion estara aun en el plano x', y/ pero en el
semiplano opuesto y las componentes que rotaban en sentido horario 10 haran en el
antihorario y viceversa. Es facil ver que despues de un tiempo 2T habran adquiri-
do coherencia nuevamente (compondran un unico vector) pero de signo opuesto al
inicial. En este momenta se comienza la deteccion y se observara el decaimiento
268 Temas de Biofisicoqufmica

libre (la amplitud inicial sera negativa, de alli la designacion de eco) Tal como se
0

hace para T1 , es necesario realizar diversas experiencias con diferentes valores de


T, esperando intervalos de por 10 menos cinco veces T10 La figura Co5 muestra un
esquema del metoda descriptoo Esta tecnica tiene en realidad poca aplicacion debido
ala difusion molecular pero resulta instructiva para entender el procesoo El efecto de
la difusion depende de los gradientes de campo magnetico, efectos que son utilizados
ventajosamente para estudios de propiedades difusivaso Existen otros metodos que
hacen uso de secuencias de pulso diferentes y que permiten eliminar est os problemas
para la medici on de T 2 0

z z
y

x
a) b) c)

z z

y y

x
d)

Figura C.5: Esquema de un experimento de espin-eco. (a) Se aplica un pulso de 90° a tiempo
O. (b) La magnetizaci6n macrosc6pica pierde coherencia. c) Se aplica un pulso de 180°,
observese el sentido de rotaci6n. d) Transcurrido un tiempo 27 se recupera la coherencia. f)
la coherencia se pierde nuevamente.
Apendice D

Un idades y consta ntes ffsicas

0.1. Sistema internacional de unidades


El Sistema internacional de unidades (SI) ha sido adopt ado internacionalmente
en el ambito cientifico y numerosos paises 10 han instituido como el sitema legal,
tal es el caso de la Argentina, donde el Sistema Metrico Legal Argentino (SIMELA)
se identifica con el S1. Debe tenerse en cuenta que en el SIMELA la separacion de
los decimales se realiza con una coma (,) y no con un punto, como es habitual en
los paises angloparlantes. El SI acepta ambos pero conseja no poner ningun simbolo
como separacion para las decenas de mil sino, si se qui ere separar, dejar un espacio
en blanco (ej. 1 000, 0 10 000). El valor de una cantidad fisica se define como el
producto entre un valor numerico y una dada unidad. En el SI las cantidades y
unidades de base son:

Cuadra D.l: Cantidades fisicas basic as y sus unidades en el 81.

Cantidad fisica Simbolo de la cantidad Unidad Simbolo


longitud 1 metro m
mas a m kilogramo kg
tiempo t segundo s
corriente electrica I ampere A
temperatura termodinamica T kelvin K
intensidad luminosa Iv candela cd
cantidad de sustancias n mol mol

A estas unidades se Ie agregan las unidades suplementarias que se muestran en


la tabla D.l.Las definiciones de las unidades basicas se dan en la tabla D.3.

269
270 Temas de Biofisicoqufmica

Cuadra D.2: Unidades suplementarias en el 81.

Cantidad fisica Simbolo de la cantidad Unidad Simbolo


angulo plano (sin preferencia) radian rad
agulo solido (sin preferencia) esterorradian sr

Cuadra D.3: Definiciones de las unidades basicas en el 8I.

Unidad Definicion
metro (m) 1 650 763,73 longitudes de onda en el vacio de la radiacion
correspondiente a la transicion entre los niveles 2p10 y 5d5
del atomo del kripton-86.
kilogramo (kg) Masa del prototipo internacional, que se encuentra en Sevres,
cerca de Paris a cargo del Comite Internacional de Pesas y
Medidas
segundo (s) La duracion de 9 192 631 770 periodos de la radiacion
correspondiente a la transicion entre los dos niveles
hiperfinos del est ado natural del atomo de cesio-133.
ampere (A) La magnitud de la corriente que fluye en dos conduct ores
distanciados un metro entre si, en el vacio, que produce
una fuerza entre ambos conduct ores (a causa de sus campos
magneticos) de 2 x 10- 7 N/m.
kelvin (K) La fraccion 1/273,16 de la temperatura termodinamica del
punta triple del agua.
candela (cd) La intensidad luminosa, en direccion perpendicular, de una
superficie de 1/600.000 m 2 de un cuerpo negro a la temperatura
de congelamiento del platino (2,042 K), bajo una presion
de 101,325 N/ m 2
mol (mol) La cantidad de substancia de un sistema que contiene un numero
de entidades element ales igual al numero de atomos que hay en
0,012 kg de carbono-12.
D. Unidades y constantes 271

Cuadra D.4: Nombres, simbolo y definici6n de unidades derivadas del Sistema 1nternacional (S1).

Cantidad fisica Nombre 8imbolo Definicion Expresion equiv.


energia joule J m 2 kg S-2 Nm
fuerza newton N m kg S-2 J m- l
presion pascal Pa m- l kg S-2 N m -2 , J m -3
potencia watt W m 2 kg S-3 J8- 1
carga electrica coulomb C sA As
diferencia de potencial volt V m 2 kgs- 3A-l JA -IS-I, Jc- l
resistenca electrica ohm 0 m 2 kg s-3A- 2 VA- l
conductancia electrica siemens 8 m- 2 kg- l S3 A2 0- 1, A V-I
capacidad electrica farad F m- 2 kg- l s4A2 AsV-l, CV- l
flujo magnetico weber Wb m 2 kg S-2 A-I Vs
inductancia henry H m 2 kg S-2 A-2 VA-l s
densidad de flujo tesla T kg S-2 A-I V s m 2, Wb m- 2
magnetico
flujo luminoso lumen l 1m cd s
iluminacion luxa Ix m 2cd sr Imm 2
frecuencia hertz Hz S-1

Cuadra D.5: Equivalencias entre algunas unidades del Sistema 1nternacional (S1) y otras de uso
frecuente.

Cantidad Fisica Unidad 8imbolo Equivalencia en el 81


fuerza kilogramo fuerza kgf 9,80665 N
presion atmosfera atm 101 325 Pa
torr Torr 133,322 263 Pa
milimetros de mercurio mmHg 133,322 387 Pa
energia caloria cal 4,184 J
272 Temas de Biofisicoqufmica

Cuadra D.6: Valores aceptados de ciertas constantes fisicas.

Simbolo valor
Velocidad de la luz en el vacio c 2,997925 x 108 ms- 1
Permitividad del vacio E 8,8541853 x 1O- 12 Fm- 1
Carga del electron e 1,602177 x 1O- 19 C
Masa del electron en reposo me 9,109290 x 1O- 31 kg
Constante de Planck h 6,626196 x 1O- 34 Js
n= h/27r 1,0545919 x 1O- 34 Js
N umero de Avogadro NA 6,022169 x 10 23 mol- 1
Constante de Faraday F 9,648670 x 104 Cmol- 1
Constante de los gases R 8,31434 JK-1mol- 1
Constante de Boltzmann k = R/NA 1,380622 x 10 23 JK- 1
,
Indice alfabetico

Absorbancia, 228 estequiometrico, 161


Actividad, 55, 56, 57, 58, 59, 63, 65, 68 fenomenologico, 156, 171, 173, 183
coeficiente de, 56, 57, 58 osmotico, 162
del solvente, 160 Colageno, 136
enzimatica, 65 Conduccion por prot ones , 129
ionica, 210 Conductividad, 33
individual, 57, 58, 62, 63, 65
media, 63 Debye-Huckel, 59, 61, 62
Agua Diametro equivalente, 73,
tritiada, 174 Dielectricas, 133, 45
de mar, 207 Dielectrico, 33,34,45
ligada, 112, espectro, 135
pesada, 14,47 Difusion, 24,45, 46, 48, 74
Aldosas, 95 coeficiente de, 74
Alosterico, 125 Dipolo, 34,
Anhidrasa carbonica, 129, hidrofobico, 100,
Aproximacion Esferica Media, 61,62 Disipacion de energia, 189
Area Dispersion, 232
accesible, 98 elastica, 234
expuesta, 96 Raman, 234
Donnan
Celulas efecto, 208, 213
exitables, 199 fase, 208
animales, 206
Carbohidratos, 117 Efectos termoelectricos, 152
Catalisis, 128 Einstein, formula de, 74
Clatratos, 91 Einstein, teoria de viscosidad de, 74
Coeficiente Energia
de acumulacion, 210 niveles, 231, 235
de difusion, 74 libre
de extincion, 231 de solubilidad, 85
de particion, 102, 103 de transferencia, 102, 97

273
Enlace de hidrogeno, 21, 48, 84, 89, hidrofobica, 88, 89, 95
115 modelo, 142, 67
Entropia numero de, 67, 68, 73, 77, 78
de mezcla, 84 Hielo, 32, 33, 35, 36, 44, 46
de solubilidad, 84 Histeresis, 122
Estado estacionario, 157, Hodking-Katz, ecuacion de, 199
Estructura Hofmeister, 75
cristalografica, 117, 286
de proteinas, 247 Interaccion
por nmr, 246 hidrofobica, 90, 102, 105
alcance, 91
Fick, Ley de, 183 solvofobica, 90
Flujo Isotopos, 13, 14, 175
de calor, 170,
de energia, 154 Jones-Dole, ecuacion, 69
de energia,166
Lambert y Beer, ley de, 230
de iones, 197
de materia, 154, Michaelis-Menten, cinetica de, 185
de oxigeno, 189 Mioglobina, 129
Flujos unidireccionales., 176 Modelo
Fuerzas fisico, 175
conjugadas, 154, 189 matematico, 175
generalizadas, 152, Momento
termodinamicas, 183, cuadrupolar, 20
Funcion de disipacion, 154, 155, 156, dipolar, 20, 24, 33, 34
157, 158, 163, 166 hidrofobico, 98
octupolar, 20
Globulos rojos, 207
Movilidad
fantasmas de, 207
de proteinas, 250
Glucosa,95
ionica, 195
Goldman, ecuacion de, 197
Gurney, 66 Numero de ondas, 228
Nerst-Planck, ecuacion de, 196
Hemoglobina, 124, 125
NMR, 244
Hidratacion
co-esfera de, 66, 75 Onsager, relaciones reciprocas, 156
critica, 134
de hemoglobina, 125 Parametro de orden, 144
de proteinas, 117 Permeabilidad relativa, 200
especifica, 114 Permitividad, 24, 31, 33, 34,45, 59, 61
general, 114 Planck, ecuacion de, 228

274
Polarizabilidad, 16 Tiempo
Potencial de correlacion rotacional, 87
electrico, 152 de relajacion, 88,138, 239, 244
electroquimico, 196 de residencia, 69, 71, 145
medio, 56 de resolucion, 116
quimico, 55, 56, 58, 84, 152, 160, de vida, 89
163 escala de, 115
Presion osmotica, 158, 160, 162, 165, Transportador, 186
168 Trazadores, 174
aparente, 165
Prigogine, principio de, 158 Ultrafiltracion, 165
Proteinas, desnaturalizacion de, 95 Urea, 94
Prot ones , conduccion por, 129
van't Hoff, ecuacion de, 161
Puente de hidrogeno, 21, 89, 122
Viscosidad, 48, 69, 70, 71, 72
Radiacion, 228, 237 especifica, 70
espontanea, 229 intrinseca, 70
Radio relativa, 69, 70, 71, 74
efectivo, 68 teoria de Einstein, 74
equivalente, 73 Volumen
Rayos efectivo, 74
/,228 equivalente, 74
X,228
2D-NMR, 247
Relacion giromagnetica, 236
Relajacion, 45
dielectrica, 90,116, 135
dipolar, 136
magnetica, 239
RMN, 90, 117, 138

Serie liotropica, 75
Sitios
polares, 122,
primarios, 122, 123
Superficie
de Conolly, 96
expuesta, 97
molecular, 119
Surfactantes, 96

Temperatura estructural, 71

275