PRACTICA 2

TINCION DE GRAM
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:

Cuando haya completado este experimento, usted debe comprender:

1. La base teórica y química de los procedimientos de tinción diferencial.

2. La base química de la tinción de Gram.

3. El procedimiento para diferenciar entre dos grupos principales de bacterias: Gram-

positivas y Gram-negativas.

PRINCIPIO:

La tinción diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos químicos que se aplican en

secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado tinción primaria o colorante
primario. Su función es impartir color a todas las células. Con el objetivo de establecer un
contraste de color, el segundo reactivo usado es un agente decolorante, el cual puede decolorar
la célula completa o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las
células decoloradas un color que contrasta con el del colorante primario. El colorante de
contraste no puede ser absorbido por células que no han perdido el colorante primario. De esta
manera, tipos de células o sus estructuras se pueden distinguir unas de otras en función del
colorante que es absorbido.

El método de tinción diferencial más importante usado en bacteriología es la tinción de Gram,

llamada así en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este método divide las bacterias en dos
grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es esencial para la clasificación y
diferenciación de microorganismos. La reacción a la tinción de Gram está basada en la
diferencia en la composición química de la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram-
positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o mureína, mientras que esta capa es más
fina en las Gram-negativas y está rodeada por una bicapa lipídica externa. El Peptidoglicano es
un polisacárido formado por dos subunidades químicas, N-acetilglucosamina y acido N-
acetilmurámico.

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Figure 1 Microfotografía de una pared celular Gram Figure 3 Microfotografía de pared celular de
Positiva bacteria Gram-negativa

Figure 2 Estructura de la Pared Celular Gram- Figure 4 Estructura de la Pared Celular Gram-
positiva negativa

Tinción Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tiñe todas las células moradas.

Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del
colorante primario con la célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal
violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido.

Agente decolorante: Se utiliza alcohol etílico al 95%. El etanol tiene doble función:
deshidratante de proteínas y solvente de lípidos. El alcohol disuelve los lípidos de la parte
externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared más porosa. De esta manera, el
complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina más fina de las bacterias Gram-
negativas, mientras que la pared más gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en su interior.

Tinción de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teñir de rojo las células previamente
decoloradas, o sea, las Gram-negativas.

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EN LA MESA DE TRABAJO
MATERIALES:

Cultivos: cultivos de 24 horas en agar nutritivo en tubo inclinado de Escherichia coli, Micrococcus
luteus, Bacillus megaterium y Rhodospirillum rubrum.

Reactivos: Cristal violeta, Yodo de Gram, Alcohol Etílico 95%, Safranina.

EQUIPOS Y MATERIALES:

Mechero de alcohol, asa de siembra, cubeta de tinción, portaobjetos, papel de absorción, papel
de lentes, y microscopio.

PROCEDIMIENTO:
1. Obtenga 5 portaobjetos limpios.

2. Prepare un frotis de cada uno de los microorganismos y, en el quinto portaobjetos prepare

un frotis de una mezcla de Micrococcus luteus y Eschericha coli. Para preparar los frotis se
sigue el siguiente procedimiento:

a. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es

necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra,
ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de
agua, que es suficiente.

b. Flamear el asa de siembra y dejar enfriar. Tomar, en condiciones asépticas, una

pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota
de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión
homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Nota: Si la
muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos
primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión
bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el
portaobjetos.

c. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el

portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha

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 precaución de no calentar demasiado el portaobjetos pues las células pueden
deformarse o romperse.

d. Para preparar el frotis de la mezcla Eschericia coli-Micrococcus luteus, coloque

una gota de agua en el portaobjetos, y luego transfiriendo cada organismo
separadamente a la gota de agua usando un asa de siembra esterilizada y
enfriada. Mezcle ambos microorganismos haciendo movimientos circulares con
el asa.

3. Permita que los frotis se sequen al aire y luego fíjelos con calor.

4. Tiña con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que actúe durante 1 minuto.

5. Lave suavemente con agua.

6. Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar durante 1 minuto.

7. Lave suavemente con agua.

8. Decolore con alcohol etílico al 95%. Nota: no sobredecolore, agregue el alcohol gota a
gota hasta que este salga casi claro, solo ligeramente azul.

9. Lave suavemente con agua.

10. Agregue la safranina para la tinción de contraste.

11. Lave suavemente con agua.

12. Seque la preparación.

13. Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersión de aceite.

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Tina suavemente con cristal Aplique yodo o lugol
Lave suavemente con agua
violeta por 1 min suavemente por 1 min

Aplique alcohol o acetona

Lave suavemente con agua gota a gota hasta que salga Lave suavemente con agua
claro

Tina suavemente con Seque al aire o con papel

Lave suavemente con agua
safranina por 1 min absorbente

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 PRACTICA 2

OBSERVACIONES Y RESULTADOS

De acuerdo a sus observaciones al microscopio, registre sus resultados en el cuadro.

1. Haga un dibujo de un campo microscópico representativo.

2. Describa las células de acuerdo a su morfología y arreglo.

3. Describa el color de las células tintadas.

4. Clasifique el organismo como Gram-positivo o Gram-negativo.

E.coli M. luteus B. megaterium Mezcla

Dibujo de
campo
microscópico
representativo

Morfología
celular:

-Forma:

-Arreglo

Color

Reacción de
Gram