Validación de los métodos microbiológicos

PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
Norma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta,

Consultora Internacional de la FAO
 Objetivos a desarrollar
Validación de métodos:
Intentamos contestar las siguientes
preguntas:

•¿Qué es validar?

•¿Por qué valido?

•¿Para qué valido?

•¿Cuándo valido?

•¿Cómo valido?
 ¿ Qué es en la práctica validar un método?

Es realizar un conjunto de pruebas de manera de:

9 Comprobar varios aspectos del comportamiento del
método.
9 Establecer que sirve para el fin previsto.

Todo esto debe ser

documentado y archivado.
9 El laboratorio acuerda con el cliente el
método a usar para realizar un ensayo.

9 El laboratorio debe usar los métodos y

procedimientos más apropiados dentro
de su alcance para todos los ensayos.
 Características que se tienen en cuenta
para seleccionar el método de ensayo:

9 Propiedades analíticas: precisión, exactitud,

especificidad, sensibilidad, el límite de
cuantificación y/o de detección, los efectos
matriciales
9 Facilidad de uso o automatización.
9 Rapidez de análisis o respuesta.
9 Costo.
9 Método normalizado
 Definición de método alternativo:
Es un método de análisis que demuestra o estima un
analito (un microorganismo, sus componentes o su
producto), para una categoría dada de productos, como lo
hace su correspondiente método de referencia.

El método alternativo exhibe atributos apropiados a las

necesidades de los usuarios, por ejemplo:
•- la velocidad de análisis y/o respuesta;
•- la facilidad de ejecución y/o automatización;
•- las propiedades analíticas (la precisión, exactitud, el
límite de detección, etc.);
•- la miniaturización;
•- el reducción de costo.
 ¿Qué métodos se validan?
•LOS MÉTODOS NO NORMALIZADOS.

•LOS MÉTODOS QUE DISEÑA O DESARROLLA EL

LABORATORIO.

•LOS MÉTODOS NORMALIZADOS EMPLEADOS FUERA

DEL ALCANCE PREVISTO.

Verifico USO MÉTODOS OFICIALES, MÉTODOS

NORMALIZADOS O MÉTODOS DE ORGANISMOS
NACIONALES O INTERNACIONALES RECONOCIDOS.
 ES RECOMENDABLE LA
UTILIZACIÓN DE MÉTODOS
NORMALIZADOS O DE
REFERENCIA,
SIEMPRE Y CUANDO ÉSTOS
ESTÉN DISPONIBLES
Y SEAN APROPIADOS.
CUANDO HAY GRAN INFORMACIÓN
SOBRE UNA METODOLOGÍA LOS
ENSAYOS PARA VALIDAR SON
RELATIVAMENTE SENCILLOS,

SI LA EXPERIENCIA ES ESCASA LA
VALIDACIÓN SERÁ EXTENSA.
 VALIDACION PRIMARIA

Validación: Confirmación, mediante el aporte de

pruebas objetivas, de que se han cumplidos los
requisitos para el uso pretendido o una
aplicación específica.
[ISO 9000: 2000]

Antes de realizar la validación

se deben especificar:

 Alcance.
 Se deben declarar los CRITERIOS DE
APTITUD PARA LOS FINES.
 MÉTODOS NO NORMALIZADOS:

9 Cuando sea necesario utilizarlos deben ser

validados adecuadamente antes del uso.

9 Búsqueda de información sobre datos de

validación previa.

9 Deben incluir una especificación clara de los

requisitos del cliente y del objeto del ensayo.
 MÉTODOS DESARROLLADOS
POR EL LABORATORIO:
• Debe ser :
9 Una actividad planificada (PROCEDIMIENTO)
9 Ser asignada a personal calificado
9 Proveer los recursos necesarios.

• Los planes deben ser actualizados a medida que

avanza el desarrollo y deben asegurar que la
comunicación sea eficaz entre todo el personal
involucrado.

• En este caso, el proceso de validación es mucho

más arduo, ya que se debe demostrar que cada
paso elegido responde a lo esperado.
 a)Una identificación apropiada de
los métodos de ensayo.
b) El alcance.(intervalo de
concentración del analito)
Para los métodos de c) La descripción del tipo de Ítem
a ensayar.
ensayo nuevos es
d) Los parámetros o las
conveniente elaborar magnitudes; y los rangos a ser
procedimientos antes determinados.
de la realización de los e) Los aparatos y equipos,
incluidos los requisitos técnicos
ensayos los que deben de funcionamiento.
contener, como mínimo, f) Los patrones de referencia y los
la información siguiente: materiales de referencia
requeridos.
g) Las condiciones ambientales
requeridas y cualquier periodo de
estabilización que sea necesario
Para los
métodos de
ensayo
h) La descripción del procedimiento incluida la
nuevos es siguiente información:
conveniente -diagrama de flujo
elaborar -marcas para identificación durante la manipulación,
procedimientos el transporte, el almacenamiento y la preparación de
los ítems.
antes de la - las verificaciones a realizar antes de comenzar el
realización de trabajo
los ensayos los - la verificación del correcto funcionamiento de
que deben equipos y, cuando corresponda, su calibración y
ajuste antes de cada uso;
contener, - el método de registro de las observaciones y de los
como mínimo, resultados;
la información -las medidas de seguridad a ser observadas.
siguiente i) Los criterios o requisitos para la aprobación o
rechazo.
(cont): j) Los datos a ser registrados y el método de análisis.
k) La incertidumbre o el procedimiento para estimar la
incertidumbre.
 LOS MÉTODOS NORMALIZADOS
EMPLEADOS FUERA DEL ALCANCE PREVISTO
9Métodos normalizados aplicados a matrices que no se
especifiquen en el procedimiento normalizado.

9 Ampliaciones y modificaciones de los métodos

normalizados.

Para demostrar que una versión modificada de un método

cumple las mismas especificaciones que el método
original, deben realizarse comparaciones utilizando
replicados.
 Sistemas de ensayo comerciales (kits)

9 Los laboratorios deben conservar los datos sobre la

validación de los sistemas de ensayo comerciales (kits)
que utilicen.

9 Estos datos pueden obtenerse de ejercicios de

intercomparación o de datos sobre validación remitidos
por los fabricantes y sujetos a la evaluación de una
tercera parte (p. ej., AOAC). wwwaoac.org

9 Si no se dispone de datos sobre validación o si éstos no

son plenamente aplicables, el laboratorio será
responsable de completar la validación del método.
 VALIDACION SECUNDARIA (Verificación)

Demostración por experimento que un método

establecido funciona de acuerdo con las
especificaciones en las manos del usuario.

Verificación: Confirmación, mediante el aporte de pruebas

objetivas, de que se han cumplido los requisitos
establecidos. [ISO 9000:2000]
 MÉTODOS NORMALIZADOS:

9Antes de analizar cualquier muestra, los laboratorios

deberán verificar su capacidad para cumplir de forma
satisfactoria todos los requisitos establecidos en
dichos métodos.

El laboratorio debe confirmar que puede operar

correctamente los métodos normalizados antes de
introducir los ensayos.

9Se debe mantener actualizadas las normas.

9Si el método normalizado cambia, se debe repetir la

confirmación.
 MÉTODOS NORMALIZADOS:

9Cuando sea necesario, la norma debe ser

complementada con detalles adicionales para asegurar
una aplicación coherente.

Ejemplo: La metodología empleada para la leche UAT

incluye una incubación previa siete días a 37º C y luego se
realiza el ensayo según FIL-IDF 100B:1991.
Esto debe ser especificado cuando se hace referencia a la
metodología en el informe de ensayo.
 LA VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS
DE ENSAYO DEBE:
• REFLEJAR LAS CONDICIONES REALES DE ENSAYO.
(USANDO PREFERENTEMENTE MATRICES
NATURALMENTE CONTAMINADAS).

• LA EXTENSIÓN DE LA VALIDACIÓN NECESARIA

DEPENDERÁ DEL MÉTODO Y SU APLICACIÓN.

• LA DEBE REALIZAR PERSONAL CALIFICADO PARA

ESA ACTIVIDAD.

• EN TODOS LOS CASOS UN PARÁMETRO PARA LA

VALIDACIÓN DE ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS ES
LA DESCRIPCIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO.
Uso de muestras naturalmente contaminadas y
preparación de muestras artificialmente contaminadas
en estudios de validación
Anexo C prEN ISO 16140:1999

• 1ra opción: Muestras naturalmente contaminadas

• 2da opción: Contaminación por mezcla.
• 3ra opción: Muestras inoculadas (el nivel de microflora debe
representar la contaminación de las muestras naturalmente
contaminadas).
• 4ta opción: Materiales de referencia
 Validar métodos
microbiológicos requiere:
9Comparar con un MÉTODO DE REFERENCIA.
REFERENCIA

9Usar cepas de referencia y cepas de referencia

certificadas.(Material de referencia).

9LA EVALUACIÓN SISTEMÁTICA DE FACTORES.

9Ensayos Interlaboratorios.
Interlaboratorios

9La estimación de la incertidumbre.

El PROTOCOLO INCLUYE:

FASE: Estudios precolaborativos o

)Primera FASE:
validación interna (estudios comparativos):
) Defino la aplicabilidad (concierne al analito de interés y a las
categorías de alimentos a las que se aplica el método).
(TABLA: Clasificación de categorías de alimentos para
estudios de validación Anexo A AOAC).
FASE: Estudios o ensayos colaborativos
)Segunda FASE:
) Cuando la exigencia es de disponer de métodos validados
plenamente, se considera habitualmente que la validación
plena de un método de análisis comprende un examen de
las características del método en un estudio del
funcionamiento del método entre laboratorios .
 Clasificación de
tipos de muestras
para estudios de
validación
Anexo B prEN ISO
16140:1999
 Primera etapa de la validación
Ensayos selectivos
se usan cepas en estudios de
( VALIDACION INTERNA):
INCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos
pertenecientes al grupo deben ser detectados por
el método.
SENSIBILIDAD

EXCLUSIVIDAD: diferentes microorganismos que

no pertenecen al grupo no deben ser detectados
por el método.
ESPECIFIDAD
 Cepas para ensayos de selectividad:
prEN ISO 16140:1999 ANEXO G
Categorías de Grupos “Target”: Elección de microorganismos
¿qué cepas uso?
a) Un grupo Ejemplo Coliformes, Aquellas que dan reacción típica
levaduras, bacterias acido-lácticas en el método de referencia.

b) De la Familia Ejemplo Incluir miembros representativos

Enterobacteriaceae de todos los género
pertenecientes a la familia
c) Género Ejemplo Salmonella spp Incluir miembros representativos si
es posible de todas las especies
pertenecientes al género.
d) Especie Ejemplo Listeria Rango de cepas pertenecientes a
monocytogenes la especie
e) Cepa Ejemplo Listeria Rango de fuentes de esta cepa
monocytogenes 1a
 Cepas para ensayos de selectividad:
prEN ISO 16140:1999 ANEXO G
Categorías de Grupos Elección de microorganismos
“no Target”
Target” :

a) Un grupo no target Aquellas que dan reacción

negativa (según microorganismo
target)
b) De la Familia Incluir cepas no pertenecientes a
la familia.
c) Género Incluir cepas no pertenecientes al
género similar a la cepa target
d) Especie Incluir cepas no pertenecientes a
la especie, incluidas en el género
e) Cepa Incluir cepas no target, incluidas
en la especie.
Cepas para
ensayos de
selectividad:
prEN ISO
16140:1999
ANEXO G
Validación método cualitativo

 Descripción detallada del

método de ensayo.

 LÍMITE DE DETECCIÓN
 SENSIBILIDAD
 ESPECIFICIDAD
 DESVIACIÓN POSITIVA Y
DESVIACIÓN NEGATIVA
 EFECTO MATRICIAL

 Exactitud relativa
 repetibilidad y
reproducibilidad
 Diseño de un estudio de validación
método cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validación interna

(estudios comparativos).
Compara el método a validar con el método de referencia.
Los realiza sólo el laboratorio organizador.
1.AMPLITUD MATRICES:
)Número de matrices a ensayar: teniendo en cuenta
Categorías de alimentos a validar, analizar 20 o más
alimentos de cada categoría.
)Obtención de muestras artificialmente contaminadas:
Inoculo una sola cepa (de interés) por matriz.
Según proceso al que se somete al alimento uso:
-microoganismo estressado Alimentos procesados-
-microoganismo sin estress Alimentos no procesados-
-microoganismo liofilizado-productos en polvo.
 Diseño de un estudio de validación
método cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validación interna

(estudio comparativos).
)NIVEL DE INOCULO:
Nivel bajo (límite de detección) 1-5ufc/25g de muestra
Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra

) CONTROL: Para muestras artificialmente contaminadas.

Cada tipo de alimento se divide en dos, uno para control negativo y otro
para obtener distintos niveles inóculo.

)CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE CONTAMINACIÓN

POR NMP: el mismo día que se analizan las muestras.

)Número de ensayos por nivel de analito: 20

 Diseño de un estudio de validación
método cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validación interna

(cont).

2. ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo

sólo la cepa.(cultivo puro)
Pruebo 50 o más cepa target y 30 no target (método a validar
y método de referencia).
 Diseño de un estudio de validación
método cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios o ensayos colaborativos:

¡IMPORTANTE! Los laboratorios participantes acuerdan y

estudian minuciosamente el protocolo de ensayo.

Número de laboratorios:10 laboratorios (con datos válidos)

por tipo de alimento.

Los laboratorios participantes no conocen los valores de

las muestras.(Muestras a ciegas)

Número de matrices a ensayar: teniendo en cuenta

Categorías de alimentos a validar.
 Diseño de un estudio de validación
método cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios o ensayos colaborativos:

PREPARACIÓN DE MUESTRAS:
a) Cepas inoculadas: Uso un cultivo puro cepa target.

b) Nivel bajo (límite de detección) 1-5ufc/25g de muestra

Nivel alto 10-50ufc/25g de muestra
CONTROL. (Para muestras artificialmente
contaminadas)

EL LABORATORIO QUE ORGANIZA DEBE ASEGURAR

LA HOMOGENEIDAD DE LAS MUESTRAS.
 Diseño de un estudio de validación
método cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios o ensayos colaborativos:

)CUANTIFICACIÓN DE LOS NIVELES DE

CONTAMINACIÓN POR NMP: el mismo día que se
analizan las muestras.(el laboratorio organizador)

)Número de ensayos por nivel de analito por cada tipo de

alimento: 6
)Número de ensayos por CONTROL NEGATIVO por
cada tipo de alimento: 6
 Diseño de un estudio de validación
método cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ANALISIS DE LOS RESULTADOS:

Aplicable a
)Estudios precolaborativos y
)ensayos colaborativos.

A)ENSAYO PARA DETERMINAR DIFERENCIA

SIGNIFICATIVA:
La proporción de positivos confirmados del método
evaluado no debe ser estadísticamente diferente a la
proporción positiva confirmada por el método de referencia
para cada tipo de alimento y cada nivel de inoculación

TEST de Chi cuadrado.( para datos nominales)

 Diseño de un estudio de validación
método cualitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ANALISIS DE LOS RESULTADOS (cont):

Aplicable a:
) Estudios precolaborativos
) ensayos colaborativos.

B) INDICADORES DE APTITUD:
Sensibilidad
Especificidad
FALSOS POSITIVOS para cada tipo de alimento y
FALSOS NEGATIVOS cada nivel.
 Validación método cuantitativo

 Descripción detallada del

método de ensayo.

 LÍMITE DE
CUANTIFICACIÓN.
 REPETIBILIDAD Y
REPRODUCIBILIDAD
 EXACTITUD

 Desviación positiva y
desviación negativa
 sensibilidad
 especificidad
 Diseño de un estudio de validación
método cuantitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validación interna (estudios

comparativos).
)Comparación del método a validar con el método de
referencia.
)Aplica lo visto anteriormente para métodos cualitativos.
(tener en cuenta los estudios de inclusividad y exclusividad
sólo para ensayos selectivos)
)NIVEL DE INOCULO de las matrices:
se evalúan 3 niveles de concentración de microorganismo
(bajo, medio y alto) que abarquen todo el intervalo a validar.
Y un control sin inocular.
Uso fundamentalmente muestras naturalmente contaminados
para ensayos no selectivo (no realizo el control)
 Diseño de un estudio de validación
método cuantitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

Estudios precolaborativos o validación interna

(estudios comparativos).
ESTUDIOS DE INCLUSIVIDAD Y EXCLUSIVIDAD: pruebo
sólo la cepa.(cultivo puro)
Pruebo 30 o más cepa target y 20 no target.(método a
validar y método de referencia)

ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS

Estimación de desviación aleatorias y sistemáticas del
método.
Número de laboratorios: 8 laboratorios (con datos válidos)
por tipo de alimento.
 Diseño de un estudio de validación
método cuantitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS:

a)Recuento de microorganismos específicos: inoculación
del microorganismo específico. SOLO PARA ENSAYOS
SELECTIVOS

b) NIVEL DE INOCULO de las matrices:

se evalúan 3 niveles de concentración de microorganismo
(bajo, alto que abarquen todo el intervalo a
bajo, medio y alto)
validar.
Y un control sin inocular.
Uso fundamentalmente muestras naturalmente
contaminados para ensayos no selectivo (no realizo el
control)
Para cada tipo de alimento se analizan por duplicado (dos
porciones) el método a validar y el método de referencia.
 Diseño de un estudio de validación
método cuantitativo :
AOAC International methods committee guidelines for validation of qualitative and
quantitative food microbiological official methods of analysis (Revised 5/2002)

ESTUDIOS O ENSAYOS COLABORATIVOS

)Se realizan test para eliminar los outliers.

INDICADORES DE APTITUD:
)Análisis de varianza y t por tipo de alimento y nivel de
inóculo.
)Sr, r, SR, R, RSDr y RSDR por tipo de alimento y nivel
de inóculo.

“RSD es la desviación estándar relativa.

Es independiente del valor del analito”
 INFORME DE VALIDACION
El laboratorio debe registrar:

)RESULTADOS OBTENIDOS.
Establecer el rango de validación (es la parte del intervalo
de concentración de un método de análisis que ha sido
validado).

)PROCEDIMIENTOS USADOS.

)Declaración que el método es apropiado para el fin

previsto.

)Toda la información referida a la validación debe

documentarse y archivarse.
 Extensión de la validación

)La extensión de la validación necesaria

dependerá del método y su aplicación.

)“La validación es siempre un equilibrio entre

costos, riesgos y posibilidades técnicas.”

)Cada laboratorio establecerá los requisitos

que debe cumplir el método, con objeto de
demostrar que son adecuados para la finalidad
establecida.
 Incluso cuando se haya realizado la
validación, el laboratorio tendrá que :

Verificar periódicamente que se cumplen

los parámetros documentados,
utilizando,
por ejemplo:
muestras inoculadas o materiales de
referencia incorporados a las matrices más
representativas.
¡GRACIAS POR SU ATENCION!