Rev Med Exp 2000; 17 (1-4)

ESTUDIO DE VALIDACIN DE LA METODOLOGA PARA LA DETERMI-

NACIN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS INFANTILES INSTANTNEOS
POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

Ruth Prez Caldern.

*
Divisin de Qumica, Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin, Instituto Nacional de Salud.

RESUMEN

Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantneos se efectu la validacin de la metodologa
para la determinacin de la vitamina A por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC). Para la precisin del
sistema se evaluaron tres parmetros: tiempo de retencin, rea y altura, hallndose una desviacin estndar relativa
(RSD) mxima de 1,78%. En la linealidad se obtuvo un coeficiente de correlacin r=0,99 y una precisin con un RSD de
2,70%. La exactitud del mtodo se evalu en trminos de recuperacin mediante la adicin de vitamina A al alimento
obtenindose un porcentaje de recuperacin de 97,98%; y para la sensibilidad del mtodo se obtuvo un lmite de
deteccin (LOD) de 0,06 mg/g y un lmite de cuantificacin (LOQ) de 0,58 mg/g. Con los resultados obtenidos se
demuestra que el mtodo en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en el control de
calidad de alimentos infantiles instantneos para la determinacin de vitamina A.

Palabras claves: Vitamina A; Cromatografa lquida; Alimentos infantiles (fuente: BIREME).

ABSTRACT

Validation of the methodology used to determine Vitamin A through High Performance Liquid Cromatography (HPLC)
was performed to assess instant food for children.Three parameters were assessed in order to determine the systems
accuracy: retention time, area and height and a maximum variation (RSD) of 1.78% was found. A correlative coefficient of
r=0.99 was obtained for the lineal parameter, and an accuracy with 2.70% for RSD. The accuracy of the method was
evaluated in terms of recovery through the addition of Vitamin A to the food, the recovery percentage obtained was
97.98%, and for the sensitivity a limit of detection (LOD) 0,06ug/g was obtained, as well as a limit of quantification (LOQ)
0,58%. The findings demonstrate that the method assessed is accurate, exact, lineal and highly sensitive to be used in
quality control of instant food for children for the determination of Vitamin A.

Key Words: Vitamin A; Liquid cromatography; Infant food (source: BIREME).

INTRODUCCION

Vitamina A es el nombre genrico utilizado para La principal funcin de la vitamina A es la proteccin de la

describir al retinol, sus steres y los correspondientes
ismeros. Slo est presente, como tal, en los alimentos
de origen animal, aunque en los vegetales se encuentra
como provitamina A en forma de carotenos.
Los diferentes carotenos se transforman en vitamina A
en el cuerpo humano, se almacenan en el hgado en
grandes cantidades y tambin en el tejido graso de la
piel (palmas de las manos y pies, principalmente), por lo
que podemos subsistir largos perodos sin su aporte1.
Correspondencia: Ruth Prez Caldern. Centro Nacional de Alimentacin
y Nutricin. Tizn y Bueno 276, Lima 11, Per. Telf.: (0511) 4639588 Fax:
(0511) 4639617.
Email: r_whittembury@yahoo.es
piel y su intervencin en el proceso de visin de la retina.
Tambin participa en la elaboracin de enzimas en el
hgado y de hormonas sexuales y suprarrenales. El dficit
de vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad en
los ojos (membrana conjuntiva) y en la piel, y afecciones
diversas de las mucosas. En cambio, el exceso de esta
vitamina produce trastornos como alteraciones seas, e
incluso inflamaciones y hemorragias en diversos tejidos.
La vitamina A se encuentra principalmente en productos
animales tales como leche, crema, mantequilla, queso,
huevos, carne, hgado, rin y aceite de hgado de bacalao.
Por lo general, se encuentra como steres de cidos
grasos de cadena larga pero tambin se encuentra como
retinol. Se destruye muy fcilmente con la luz, con la

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temperatura elevada y con los utensilios de cocina de
hierro o cobre2.
Los alimentos infantiles instantneos, en su gran mayora,
son fortificados normalmente utilizando formulaciones
especiales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo,
siendo la ingesta diaria recomendada (RDA) de 400 -
700 mg de vitamina A, para nios de 1-10 aos de edad3.
En el Per, los programas de complementacin
alimentaria distribuyen alimentos instantneos a la
poblacin con alto riesgo de desnutricin; en ese sentido,
el desarrollo de tecnologas adecuadas para la
evaluacin de micronutrientes como la vitamina A, son
necesarias para el control de calidad de los productos
designados a los beneficiarios de estos programas.
El anlisis de las vitaminas en los alimentos es un gran
desafo para los analistas dado que se asocia con
problemas significativos. Muchos de estos problemas
han sido eliminados gracias a los recientes avances en
la tecnologa y el desarrollo de nuevos enfoques
analticos. A pesar de ello, no es una tarea fcil analizar
vitaminas y se necesita experiencia y los conocimientos
adecuados para producir resultados reproducibles, que
sean exactos y vlidos.
El primer mtodo vlido para la determinacin de
Vitamina A fue un bioensayo4; luego, se establecieron los
mtodo espectrofotomtrico y fotomtrico5, sin embargo,
ambos mtodos estn expuestos a interferencias, desde
algunas sustancias como carotenos, derivados y
productos de descomposicin de la vitamina A que
podran absorber luz en la misma regin ultravioleta o
dar colores similares con los reactivos utilizados en la
determinacin fotomtrica. Es as, que estos mtodos
no son lo suficientemente especficos para determinar
esta vitamina, adems que la confiabilidad de sus
resultados depende del xito en los pasos de purificacin
y los procedimientos de trabajo.
Como vemos, el problema realmente no son los mtodos
de determinacin, sino ms bien los procedimientos de
extraccin, ya que debido a su inestabilidad, algunos
autores prefieren extraer separadamente cada vitamina
liposoluble 6.
En ese sentido, y buscando una ptima metodologa de
anlisis, en el presente estudio se realiz la validacin
de la metodologa por HPLC para la determinacin de
vitamina A contenida en alimentos infantiles instantneos.
MATERIALES Y METODOS
EQUIPOS
Se utiliz un equipo de cromatografa lquida de alto
rendimiento (HPLC), marca Shimadzu, modelo LC10A,
con inyector automtico, bomba con sistema de degasificacin,
con integrador o sistema de registro, software para el
procesado de datos cromatogrficos, detector de arreglo
de diodos (longitud de onda variable). La columna
cromatogrfica fue de acero inoxidable LC-18 para fase
Determinacin de vitamina A por HPLC
reversa, de 25 cm x 4,6 mm de dimetro interno, 5mm de
dimetro de partcula, y guarda columna con cartucho
C18, Supelco. Las condiciones tpicas de operacin fue-
ron: sistema isocrtico, flujo 1,2 mL/min, volumen de in-
yeccin 20 ml, deteccin UV 242 nm, temperatura de hor-
no, ambiente, y tiempo de corrida 7 min. La fase mvil fue
metanol al 100% grado HPLC.
REACTIVOS
Metanol grado HPLC( Merk), estndar all-trans Retinol:
Vitamina A (Sigma), hexano p.a. (Merck), etanol absoluto
p.a. (Merk), solucin de hidrxido de potasio al 50%, BHT
Acido Ascrbico (antioxidantes), y agua tridestilada o
grado HPLC. Solucin stock estndar de vitamina A: Se
disolvieron 100 mg del estndar en 100 mL de etanol
absoluto, con aproximadamente 0,002 g de BHT, y se
guard la solucin en congelacin (-20C), se verific la
pureza del estndar mediante la medicin de su espec-
tro de absorcin (la vitamina A y los correspondientes
steres muestran un espectro de absorcin caractersti-
co, donde la posicin del pico mximo depende del sol-
vente): en etanol, el retinol a 325 nm, tiene un coeficiente
de extincin (E 1% - 1cm.) de 1843).
PROCEDIMIENTO
Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil
(papilla) en un baln de base plana, se coloc un mag-
neto y se adicion 70 mL de etanol absoluto. Se coloca-
ron los tubos de reflujo y se agit la mezcla hasta su
ebullicin con corriente de nitrgeno. Luego, se adicion
20 mL de solucin de KOH al 50% y se saponific la
mezcla por 30 minutos con agitacin moderada. Antes
de finalizar esta etapa se enjuag el contenido con 50 mL
de agua en 3 porciones. La solucin se enfri a tempera-
tura ambiente y luego se filtr al vaco. Se coloc inme-
diatamente el contenido en una pera de separacin de
250 mL y se adicion 50 mL de hexano p.a. para proce-
der a la extraccin. Se agit la mezcla por 20 segundos y
al separarse las fases se coloc la capa superior (fase
orgnica) en un baln de 250 mL de base redonda que
contena aproximadamente 0,5 g de BHT cido
ascrbico. Se efectu dos veces ms la extraccin y se
juntaron los extractos en el baln de 250 mL. Se evapor
a sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavapor
con bao de agua a 40C, se diluy inmediatamente con
metanol grado HPLC el residuo, y se llev a volumen en
un matraz volumtrico de 10 mL. Finalmente, se pas la so-
lucin final por un filtro de 0,2 mm, llenndolos en viales m-
bar de 2 mL para colocarlos en el inyector del cromatgrafo.
CLCULOS
Concentracin de Vitamina A (mg/g ppm ) = Am x Cs x D
As Wm
Donde: Am (Area del pico de vitamina A en la muestra), As
(Area del pico de vitamina A en el estndar), Cs (Concen-
tracin de vitamina A en el estndar, mg/ml), D (Factor de
dilucin), Wm (Peso de la muestra, g).
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DISEO EXPERIMENTAL CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs el obtenido por el

mtodo oficial (de 9,72%).
Se analizaron muestras de papilla realizndose los
ensayos en las muestras previamente homogenizadas Los resultados de la precisin del sistema, basados en
con 2 analistas en 2 das diferentes para cuantificar la la variacin del tiempo de retencin, rea y altura; se mues-
vitamina A expresada en mg/g. Cada analista realiz 08 tran en la Tabla 1. La recuperacin obtenida fue de 97,98%
ensayos por da, bajo condiciones de repetibilidad y vs. la obtenida por el mtodo oficial de la AOAC (de 98,8%).
reproducibilidad. La temperatura en el rea de cromatografa
lquida fue 23C + 2C. La precisin del mtodo analtico
se estudi sobre el sistema, evaluando la dispersin de
4 inyecciones por cada uno de los 5 niveles de concen-
tracin de la solucin estndar de vitamina A; y sobre el
mtodo, evaluando la dispersin de la preparacin de la
muestra. La evaluacin correspondi a todo el procedi-
miento, desde la preparacin de la muestra hasta la me-
dicin del analito por parte del instrumento.

La exactitud del mtodo se evalu en trminos de recu-

peracin. El analito se adicion a la matriz, disuelto en el
mismo solvente usado para la extraccin, y se dej en
contacto con sta por muchas horas antes de la extrac-
cin, para permitir su interaccin. Para tal efecto, se tra-
baj con 3 niveles de concentracin diferentes adiciona-
dos a la muestra. Las concentraciones de trabajo adicio-
nadas fueron las siguientes: Nivel 1 = 3 ppm; Nivel 2 = 5
ppm; Nivel 3 = 7 ppm. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y
1,78 mL de una solucin estndar de 100 ppm de vitami-
na A y se adicionaron a 6 muestras de papilla por nivel.
Figura 1. Cromatogramas de la curva de calibracin correspondientes a
Se dej en contacto la solucin estndar con las mues- 5ppm y 15ppm de vitamina A.
tras durante toda la noche bajo refrigeracin y, al da si-
guiente, se realiz el tratamiento y se hicieron las lectu-
ras de los resultados de las 18 muestras.
La especificidad del mtodo se represent mediante los
espectros y el reporte de su correspondiente pureza con
las muestras empleadas para la evaluacin de la preci-
sin y con la solucin estndar. La evaluacin de la es-
pecificidad del sistema se realiz mediante el software
del equipo, trabajndose con la solucin estndar y la
evaluacin. La determinacin de los lmites de deteccin
y cuantificacin se evalu sobre las muestras emplea-
das para la prueba de precisin. Estos parmetros tam-
bin fueron determinados por el software del equipo6.

RESULTADOS Figura 2. Curva de calibracin de Vitamina A.

En la Figura 1 se muestran los cromatogramas re-

presentativos de dos concentraciones (mayor y menor)
Tabla 1. Precisin del Sistema
de vitamina A para la curva de calibracin. El tiempo de
retencin de la vitamina A fue 3,91 0,5 min, siendo el %RSD , terico %RSD, experimental
tiempo total de anlisis para una muestra de 7 min. La
respuesta de deteccin fue lineal en el rango de concen- 5 ppm 7 ppm 9 ppm 12 ppm 15 ppm
traciones de 5 15 mg/g (Figura 2), obtenindose un
coeficiente de correlacin r=0,99. El lmite de deteccin Tr < 10% A 0,43 0,62 0,44 0,47 0,32
del mtodo en base a la seal / ruido (S/N) fue de 0,06 mg/g A < 3% H 1,78 1,045 0,64 0,89 0,66
y el lmite de cuantificacin de 0,58 mg/g. El perfil de la H > 3% Tr 0,12 0,061 0,061 0,032 0,064
precisin que se obtuvo en 16 determinaciones por
analista en dos das diferentes, fue: CV de repetibilidad Tr: tiempo de retencin.
A: rea.
de 3,09% para el analista A, y 2,25% para el analista B vs. H: altura.
en tanto, el mtodo oficial de la AOAC (CV de 3,62%); el

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La especificidad del mtodo se muestra en la Figura
3, donde se observa la ausencia de interferencias debi-
do a la adecuada extraccin del analito, y adems se
muestra la comparacin del espectro del estndar puro
vs el espectro del analito en la muestra.
Figura 3. Cromatograma de muestra con espectro del analito.
DISCUSION
Varias tcnicas han sido propuestas para la medi-
cin de la vitamina A en alimentos infantiles frmulas
infantiles. Cada una de ellas tiene sus ventajas y limita-
ciones, pero, comparado con otros mtodos por HPLC,
nuestra metodologa propuesta tiene la ventaja de que el
tratamiento de la muestra se realiza en menos tiempo,
en relacin al mtodo oficial de la AOAC 992.06 Vitamina
A (Retinol) in Milk-Based Infant Formula. Adems, la co-
lumna que se utiliza en el mtodo propuesto (C18) es
ms comercial que la columna del mtodo de la AOAC
(ciano), ya que esta ltima trabaja en fase normal siendo,
por tanto, ms difcil de controlar y por la naturaleza no
polar del extracto, se debe usar cromatografa en fase
reversa. El tiempo de corrida por muestra es tambin
ms corto en nuestra metodologa (7 minutos), compa-
rado con el mtodo oficial que es de 10 minutos. Estas
caractersticas contribuyen al menor costo del anlisis.
Es necesario tener presente que tanto la saponificacin,
la isomerizacin y la ruptura de la vitamina A son retarda-
dos por la adicin del antioxidante (cido ascrbico) y el
uso de nitrgeno, el cual interfiere con los agentes de
oxidacin presentes. Asimismo, el retinol y sus steres
son rpidamente destruidos por la luz, el oxgeno y los
cidos, por lo que deben almacenarse en frascos mbar
o cubiertos con papel platino o su equivalente.
Determinacin de vitamina A por HPLC
La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse
de la luz y la oxidacin, evitndose la luz solar directa y la
luz brillante. La iluminacin artificial es mejor proporcio-
nada por tubos fluorescentes dorados equivalentes.
En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedi-
miento deberan realizarse en material de vidrio mbar
para prevenir la degradacin.
Dado que el calor tambin contribuye a la isomerizacin o
a una posterior alteracin de las vitaminas, debera evi-
tarse el calor innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cui-
dado que, por ejemplo, la evaporacin de los solventes
se realice lo ms suave posible utilizando un evaporador
rotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfria-
miento adecuado de los condensadores y un vaco ptimo.
Adems, se debe hacer un control espectrofotomtrico
de la pureza del estndar.
De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos con-
cluir que el Mtodo de ensayo CENAN-DQ.ME.16: Mtodo
para la Determinacin de Vitamina A (retinol) en alimen-
tos infantiles instantneos por HPLC es preciso, exacto,
especfico y sensible para los parmetros evaluados en
este estudio, ya que se encuentran dentro de los rangos
establecidos.
REFERENCIAS
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1. URL disponible en: http://laisla.com/uned/guianutr/
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de Chile. Instituto de Nutricin y Tcnica de los Alimentos
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1987.
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