PRCTICA 1

PREPARACIN DE SOLUCIONES MADRE, REGULADORES DE CRECIMIENTO Y

MEDIOS DE CULTIVO

Objetivos
Conocer las instalaciones y el equipo del Laboratorio de Biotecnologa de Plantas, as como su correcto
funcionamiento.
Aprender sobre la preparacin de soluciones madre, reguladores de crecimiento y medios de cultivo.
Procedimiento

Preparacin de soluciones madre

Macroelementos (segn el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)

1. Para preparar una solucin 10X (que ser 10 veces ms concentrada) multiplique por 10 la cantidad
indicada para cada uno de los macroelementos (Ver Cuadro 1).
NH4NO3 : 1650 mg*10: 16500 mg
2. Pese cada uno de los macroelementos por separado.
3. En un baln aforado de 1000 ml, agregue 500 ml de agua destilada y adicione uno a uno las cantidades
pesadas de los macroelementos. NOTA: Espere a que se disuelva cada macroelemento antes de adicionar
el siguiente.
4. Agite y afore a 1000 ml con agua destilada.
5. Transfiera la solucin de macroelementos a una botella para su almacenamiento.
6. Rotule la botella con el nombre de la solucin (Macroelementos 10X), fecha y nombre de la persona que
lo prepar.
7. Para recordar la cantidad de solucin madre de macroelementos que se debe de adicionar por litro de
medio de cultivo: 1000 ml/10X: 100 ml de la solucin madre por litro de medio de cultivo.

Microelementos (segn el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)

1. Para preparar una solucin 200X (que ser 200 veces ms concentrada) multiplique por 200 la cantidad
indicada para cada uno de los microelementos (Ver Cuadro 1).
H3BO3: 6.2 mg*200: 1240 mg
2. Pese cada uno de los microelementos por separado.
3. En un baln aforado de 1000 ml, agregue 500 ml de agua destilada y adicione uno a uno las cantidades
pesadas de los microelementos. NOTA: Espere a que se disuelva cada microelemento antes de adicionar
el siguiente.
4. Agite y afore a 1000 ml con agua destilada.
5. Transfiera la solucin de microelementos a una botella para su almacenamiento.
6. Rotule la botella con el nombre de la solucin (Microelementos 200X), fecha y nombre de la persona que
lo prepar.
7. Para recordar la cantidad de solucin madre de microelementos que se debe de adicionar por litro de
medio de cultivo: 1000 ml/200X: 5 ml de la solucin madre por litro de medio de cultivo.

Vitaminas (segn el medio de cultivo Murashige y Skoog 1962)

1. Cada vitamina se prepara por separado.
2. Pese 50 mg de cido nicotnico, piridoxina y tiamina por separado.
3. En un baln aforado de 100 ml, agregue 50 ml de agua destilada y adicione la cantidad pesada de la
vitamina.
8. Transfiera la solucin de cada vitamina a una botella para su almacenamiento.
4. Rotule la botella con el nombre de la solucin, concentracin, fecha y nombre de la persona que lo
prepar.
5. NOTA: El mio-inositol se pesa y se agrega a la hora de preparar el medio de cultivo.
Hierro
1. Tome un beaker de 1000 ml y agregue 700 ml de agua destilada. Introduzca una pastilla magntica y
coloque el recipiente sobre un calentador.
2. Cuando el agua est hirviendo agregue la cantidad pesada de hierro (Ver Cuadro 1).
3. Coloque el beaker en un lugar oscuro y cuando este fro transfiera la solucin a un baln aforado y
agregue agua hasta la marca de aforo.
4. Transfiera la solucin de hierro a una botella ambar para su almacenamiento.
5. Rotule la botella con la nombre de la solucin, concentracin, fecha y nombre de la persona que lo
prepar.

Reguladores de crecimiento
1. Cada reguladores de crecimiento se prepara por separado.
2. Pese 50 mg de cada uno de los reguladores de crecimiento por separado (Ver Cuadro 3).
3. En un baln aforado de 50 ml, agregue 25 ml de agua destilada y adicione la cantidad pesada de los
reguladores de crecimiento.
4. Transfiera la solucin de cada reguladores de crecimiento a una botella para su almacenamiento.
5. Rotule la botella con el nombre de la solucin, concentracin, fecha y nombre de la persona que lo
prepar.

Preparacin de medios de cultivo

1. Tome un beaker de 1000 ml y agregue 250 ml de agua destilada. Introduzca una pastilla magntica y
coloque el recipiente sobre un agitador magntico.
2. Agregar 30 g de sacarosa y las alcuotas de las soluciones madre de macroelementos, microelementos,
vitaminas, hierro y reguladores de crecimiento (Ver Cuadro 2).
3. Agregue agua destilada al beaker sin llegar a la marca de los 1000 ml.
4. Mida el pH del medio de cultivo utilizando un pHmetro.
5. Afore el medio de cultivo a 1000 ml.
6. Pese y agregue el gelificante.
7. Antes de dispensar el medio de cultivo en frascos Gerber debe de calentarlo en el microondas por 6-7
minutos.
8. Esterilizar el medio de cultivo en una autoclave a 121 C por 21 minutos.
9. Si el medio de cultivo contiene sustancias lbiles al calor (que se puedan degradar) despus de autoclavado
en la cmara de flujo laminar permita que el medio se enfrie. Una vez fro agregue la sustancia
previamente esterilizada mediante filtracin (Milipore 0.22 M).

Unidades para la preparacin de medios de cultivo

Concentracin molar Conversin de mili molar a mgl-1

1 M: el peso molecular en gl-1
1 mM: el peso molecular en mgl-1 10-3 M
1 M: el peso molecular en gl-1 10-6 M o 10-3
mM
Conversin de mgl-1 a mili molar
No. mg CaCl2 2H2O/peso molecular CaCl2 2H2O
= 440 mg/147.019 = 2. 99 mM
2,4-D: peso molecular 221.0
1 M 2,4-D: 221.0 gl-1
1 mM 2,4-D: 221.0 mgl-1 = 0.221 gl-1
1 M 2,4-D: 221.0 gl-1 = 0.221 mgl-1
Conversin de micro molar a mgl-1
(M * peso molecular)/106=mgl-1
 Cuadro 1. Preparacin de las soluciones madre para el medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) (MS).

Componente Concentracin en el medio Concentracin en la solucin Pesar (g)

MS (mgl-1) madre (mgl-1) para 1 litro
Macroelementos
(10X)
NH4NO3 1650 16500 16.5
KNO3 1900 19000 19.0
CaCl2 2H2O 440 4400 4.4
MgSO4 7 H2O 370 3700 3.7
KH2PO4 170 1700 1.7
Microelementos
(200X)
H3BO3 6.2 1240 1.24
MnSO4. 4H2O 22.3 4460 4.46
ZnSO4. 7H2O 8.6 1720 1.72
KI 0.83 166 0.166
Na2MoO4. 2 H2O 0.25 50 0.05
CoCl2. 6H2O 0.025 5 0.005
CuSO4.5H2O 0.025 5 0.005
Hierro (100X)
EDTANaFeO4 43 4300 4.3
Vitaminas (200X)
cido nicotnico 0.5 100 0.1
Piridoxina 0.5 100 0.1
Tiamina 0.5 100 0.1
Myo-inositol 100 20000 20
Otros
Glicina 2 400 *
Sacarosa 30000 Aadir fresco 30
Agar 8000 Aadir fresco 8

* Pesar 50 mg y disolver en 100 ml de agua destilada.

Cuadro 2. Cantidad de los componentes del medio de cultivo Murashige y Skoog (1962) necesarias para
preparar 1 L de medio de cultivo.

Componente Concentracin Cantidad a utilizar para 1 L de medio de cultivo

Macroelementos 10X 100 ml
Microelementos 100X 10 ml
Fe-EDTA 100X 10 ml
Tiamina 0.5 mgml -1 0.2 ml
cido nicotnico 0.5 mgml-1 1 ml
Piridoxina 0.5 mgml -1 1 ml
Glicina 0.5 mgml -1 4 ml
Inositol - 100 mg
Sacarosa - 30 g
Agar - 8g
pH - 5.6
Cuadro 3. Caractersticas de los principales reguladores de crecimiento utilizados en cultivo de tejidos.

Regulador de crecimiento Abreviacin Peso molecular Solubilidad

cido 2,4-diclorofenoxiactico 2,4-D 221.0 Etanol 95%
cido 3-indolactico AIA 175.2 1 N NaOH Etanol 95%
cido 3-indolbutrico AIB 203.2 1 N NaOH Etanol 95%
cido naftalenactico ANA 186.2 1 N NaOH Etanol 95%
Adenina A 189.1 H2O
Sulfato de adenina AS 404.4 H2O
6- Bencilaminopurina BAP 225.2 1 N NaOH
2-isopenteniladenina 2-Ip 203.3 1 N NaOH
Kinetina Kin 215.2 1 N NaOH
Zeatina Z 219.2 1 N NaOH - 1 N HCl
cido giberlico AG 346.4 Etanol
cido abscsico ABA 264.3 1 N NaOH

Si necesita cambiar un compuesto con un nmero de hidratacin por otro, como por ejemplo MnSO4. 4H2O
(PM1: 223.09) por MnSO4. H2O (PM2: 169.01)

M2: (M1*PM2)/PM1

En donde:
M1: es la masa requerida del compuesto qumico original
M2: es la masa requerida del compuesto qumico sustituto
PM1: es el peso molecular del compuesto qumico original
PM2: es el peso molecular del compuesto qumico sustituto
 HOJA CONTROL PREPARACIN MEDIOS DE CULTIVO

Preparado por: ____________________________ Fecha: _______________

Cultivo: __________________________________ Etapa: _______________

Cantidad a utilizar
Concentracin ( ____ ) L
por 1L

Macroelementos MS 10X 100 ml

Microelementos MS 100X 10 ml

Tiamina 0.5 mgml-1 0.2 ml

cido nicotnico 0.5 mgml-1 1 ml

Piridoxina 0.5 mgml-1 1 ml

Na-Fe EDTA 100X 10 ml

Sacarosa 30 g

Reguladores de crecimiento

Otros

Glicina 0.5 mgml-1 4 ml

Gelificante

pH