CROMATOGRAFA

La cromatografa es un mtodo analtico empleado ampliamente en la separacin, identificacin y

determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas.
La cromatografa fue inventada por el botnico ruso Mikhail Tswett poco despus del inicio del siglo XX.
Tswett hizo pasar pigmentos vegetales (macerado de algas) como clorofilas y xantofilas, a travs de columnas
de vidrio empacadas con CaCO3 dividido finamente. Las especies separadas aparecan como bandas coloridas
sobre la columna, lo cual explica el nombre que se escogi para el mtodo (del griego chroma que significa
color y graphein que significa describir).
La cromatografa es una tcnica en la cual los componentes de una mezcla son separados con base en
las velocidades a las cuales son pasados a travs de una fase estacionaria por una fase mvil gaseosa o
lquida.
Los componentes de una mezcla son llevados a travs de una fase estacionaria por el flujo de una fase
mvil gaseosa o lquida. Las separaciones estn basadas en las diferencias en la velocidad de migracin entre
los componentes de la muestra.
Todos los mtodos tienen en comn el empleo de una fase estacionaria y una fase mvil.

Fase estacionaria: Esta fija en el sistema.

Fase mvil: Solvente que mueve los solutos a travs de la fase estacionaria.

Sistemas Cromatogrficos:
Sistemas mviles:
Sistemas estacionarios:

Tipos de fases:
Mviles Estacionarias Cromatografa contracorriente
Gas Slidas (polmero que absorbe) G.S.C.
He, H, N, CO, Ar Lquido a la temperatura de trabajo G.L.C.
Cromatografa supercrtica
Lquido Slido H.P.L.C.
(Acetonitrilo, tetrahidrofurano, H.P.T.P.L.C.
acetato de nitrilo, etc.) L.C.
Lquido Estado micelar Electroforesis capilar

A la temperatura de trabajo se permite un intercambio.

Cualquier qumico debe saber usar H.P.L.C. y L.C.

H.P.L.C. o High Performance Liquid Chromatography (cromatografa lquida de elevado comportamiento

o cromatografa lquida de alta eficiencia) es la de mayor uso actualmente.
H.P.T.P.L.C. (cromatografa lquida planar de alta eficiencia) la disposicin de la fase est sobre un
plano.

La columna contiene dos extremos:

Un extremo por donde se introduce la muestra (gaseosa, solucin, slida) con una jeringa, y en el caso de
G.L.C. se llama septa.
Otro extremo en donde se sita el detector, el que ve lo que pasa por el. Es especfico para cada tcnica.

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Salazar-Jimnez 2
TA debe permitir volatilizar la muestra a un estado gaseoso, temperatura superior al punto de ebullicin de la
muestra.
TB, en la columna debe existir una temperatura tal que la muestra se mantenga voltil.
La esfera (n) viaja a travs del sistema gracias a que existe una fase mvil que la lleva al detector. Esta tiene
una solubilizacin puntual en cada elemento, puntual de la columna.

Cuando una sustancia no tiene ninguna retencin en la fase estacionaria, el tiempo que pasa o
transcurre cuando ella es detectada se llama tiempo muerto (t0). Pasa y escurre, es el mnimo tiempo
que demora la sustancia del punto A al C.
Toda sustancia que interacciona con la fase estacionaria se demora un tiempo determinado, tiempo de
retencin (tR).
Siempre tR > t0
tR depende de las condiciones de T, P, calidad qumica y propiedades de la molcula analito. Este
constituye un parmetro identificador hasta cierto punto y se puede investigar.
En G.L.C. lo mejor para evaluar t0 es el CH4, y el H.P.L.C. se usa NaNO3

Cromatograma tpico para mezcla de compuestos.

Constante de distribucin: AMVIL AESTACIONARIA

KL = C S donde: CS: concentracin molar analtica del soluto en la fase estacionaria

CM CM: concentracin molar analtica del soluto en la fase mvil

Tiempo corregido: Parmetro que describe mejor la interaccin con la fase estacionaria. Significa el tiempo
que la sustancia permanece en la fase estacionaria. Corresponde a:
tR` = tR tO

Velocidad lineal:
Velocidad lineal promedio de las molculas de la V0 = L donde: L = largo de la columna
fase mvil: tO

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 Velocidad lineal promedio de la migracin del V=L donde: L = largo de la columna
soluto: tR

Relacin entre la velocidad de migracin y la constante de distribucin.

V = VO * 1 donde: VS: volumen de la fase estacionaria

1+ KL Vs/Vm VM; volumen de la fase mvil

Los dos volmenes se pueden estimar por un mtodo para el cual se prepara la columna.

Capacidad (factor de capacidad k`)

La capacidad es un parmetro experimental importante que se emplea ampliamente para describir las
velocidades de migracin de solutos en columnas. Para un soluto la capacidad se define como:
k`= tR tO = tR`
tO tO

La capacidad se relaciona con la constante de distribucin: KL = *k`

Donde se define como: (para columna solo capilar)

= (RC df)2 donde: RC = radio de la columna.

2 RC df df = grosor del film.

Para G.L.C. la columna es de slice con un polmero externo, la fase estacionaria se ubica como un film
(pelcula) alrededor del tubo.

KL se puede calcular experimentalmente, a partir de los datos de la columna. Por lo tanto, se puede
utilizar para evaluar parmetros termodinmicos del sistema.
Cuando el factor de capacidad es mucho menor que la unidad tiene lugar la elusin tan rpidamente que
la determinacin de los tiempos de retencin es difcil.
Cuando el factor el factor de capacidad quizs sea mayor que 20 a 30, los tiempos de elusin se
convierten en excepcionalmente largos.
Idealmente las separaciones deben realizarse bajo condiciones en las cuales los factores de capacidad
para los solutos de una mezcla estn entre 1 y 5.

Cuando se tiene dos sustancias se debe cuantificar la relacin entre las sustancias.
Se produce una dispersin de forma gaussiana.
Cuando se tienen dos sustancias cercanas, cuantificar la posicin se hace mediante una variable
denominada selectividad.

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 La selectividad para dos analitos en una columna proporciona una medida de que tan bien la columna
separa a los dos.

Selectividad:

= (tR)B tO donde: (tR)B > (tR)A

(tR)A tO

Siempre es mayor o igual a la unidad por definicin.

No se debe confundir con el concepto de grado de

resolucin que tienen dos seales.

La resolucin RS de una columna proporciona una

medicin cuantitativa de su capacidad para separar
dos analitos. Esta se define como:

RS = 2[(tR)B (tR)A]
WA + WB

Si RS 1.5 existe separacin de seales

Si RS < 1.5 Existe una superposicin o
solapamiento entre las seales.
No se puede cuantificar entre ambas seales.

MODELO:

Lo ms probable es que las partculas estn en una esfera gaseosa por la menor energa.
Si la estructura qumica de A es parecida a la fase estacionaria, puede interaccionar con la fase
estacionaria, solo si KLA 0.
Mayor velocidad de la partcula en fase gas que en fase estacionaria.
Como las partculas de gas en la fase estacionaria se mueven mas lento que en la fase mvil, se genera
una dispersin molecular interna (pelota Rugby).
Lnea base: Cuando el detector no indica partculas.

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La varianza del peak indica dispersin de la molcula.

La teora de la velocidad de la cromatografa describe las formas y anchuras de los picos de elusin en trminos
cuantitativos basados en un mecanismo aleatorio para la migracin de molculas a travs de la columna.

Eficiencia de las columnas cromatogrficas

La eficiencia de una columna cromatogrfica se refiere a la magnitud del ensanchamiento de la banda que
ocurre cuando un compuesto pasa a travs de la columna.

Descripcin cuantitativa de la eficiencia de la columna

En mediciones cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatogrficas se emplea dos trminos:

Altura de un plato (H)

Nmero de platos tericos (N)

La altura de un plato se conoce como la altura equivalente de un plato terico. (HETP)

Los dos trminos se relacionan mediante la ecuacin:

N=L donde: L: longitud del empaque de la columna

H N: numero de platos tericos
H: altura de un plato, altura equivalente de un plato terico

La eficiencia de las columnas cromatogrficas se incrementa a medida que se hace mayor el nmero de
platos y a medida que la altura del plato se hace menor.
A menor varianza, menor dispersin y mayor eficiencia.

Altura de plato:

Debido a que las bandas cromatogrficas son gaussianas y debido a que la eficiencia de una columna se refleja
en la anchura de los picos cromatogrficos, la varianza por unidad de longitud de columna se utiliza como una
medida de la eficiencia de la columna.

H = 2 donde: 2: varianza [cm2]

L L y H [cm]

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Numero de platos:

Se evala experimentalmente con los datos que aparecen en el cromatograma.

Se mide el tiempo de retencin de un pico y la altura del pico en su base (en unidades de tiempo).

N es adimensional y se define como:

N = 16 (tR)2
W2

Para obtener H, se mide la longitud de la columna (L) y se aplica: H = L/N

Eficiencia a temperatura constante (Isoterma):

H f (v de la fase mvil) f(x) Va Deemter Modificada

v=f donde: v = velocidad lineal

A A = seccin rea (dado por equipo)
f = flujo (dado por equipo)
A partir de un cromatograma:

N = 16 (tR)2 ancho abajo N = 5,54 (tR)2 ancho medio

W2 W2

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 Se pueden obtener distintos valores de N, ajustando la velocidad lineal, con lo que se fabrica un grafico
de vO v/s H (obtenible a partir de N y L) y se busca el mnimo d la funcin.
Obtenemos H mnimo y su respectiva velocidad ptima.
Si no se logra captar la mxima eficiencia se debe probar con otra fase estacionaria.

Para pick delgados se ocupa N 2, pero se debe estar en el punto crtico. Es decir, el anlisis con N 2 es ms lento
(<vo), pero H es ms pequeo.
Con He se puede trabajar en un rango mayor de velocidades, y con H 2 es mas rpido ya que el mnimo se
produce a mayor velocidad lineal. Con He y H 2 como gas en la fase mvil se puede trabajar en un rango ms
amplio.

Modelo matemtico para explicar: Ecuacin de Van Deemter

Ecuacin Original:

H = A + B + C vO
vO

Se usaba cuando la columna esta rellena con partculas (slice en general) y en cada superficie estaba el film de
la fase estacionaria (sobre las partculas).

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Ecuacin Modificada:

H = A + B + (CL + CM) vO
vO

Parmetros:

A = constante de Eddy A = 2 dp donde: dp = tamao promedio de partculas

Si se tiene columna rellena A 0

Si se tiene columna capilar no rellena A = 0 (dp = 0)

Flujo laminar, en el borde la velocidad de la fase mvil es cero.

Existe distribucin gaussiana de los vectores de flujo en relleno regular.
H debido a irregularidades de la columna.

B = difusin longitudinal.

En H.P.L.C. como fase mviles estado lquido B 0

En cromatografa de gases B es mayor:

B = 2 DM donde: DM = coeficiente de difusin en fase mvil (depende de la naturaleza del gas y de T

= resistencia del sistema a choques de partculas 1

CL = coeficiente de transferencia de masa de la fase estacionaria.

CL = f (k`), funcin compleja propuesta que depende de df 2/DS,

CL = f (k`) df2 donde DS es el coeficiente de difusin en la fase estacionaria.

DS

Para incrementar la eficiencia se debe elegir un df menor.

Esto esta supeditado a la T y la naturaleza de la fase estacionaria.

Para columnas capilares:

CL = 2 k`df2 = KCL Este trmino es vlido solo cuando df es muy pequeo (df 0)
3 (1+k`) DS Cuando df es grande el factor 2/3 aumenta KCL
KCL depende de la unin de las partculas unas con otras. Se modifica df.
Cuando las partculas se unen hay un cambio en el grosor y pasa a ser una
constante (CL = KCL)

CM = coeficiente de transferencia de masa de la fase mvil.

Se dice que es funcin de: CM = f (K*dp/DM), donde dp es funcin del dimetro de la columna (dc).

Para columnas capilares en G.L.C. existe una funcin definida:

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 CM = (1+6k`+11k`2)
96(1+k`)2 (dc2/DM)

Para calcular el mnimo, se deriva la expresin y se iguala a cero: H/v0 = 0, obtenindose:

VOPTIMA = [B/(CM+CL)]1/2 HMINIMO = A + 2[B(CM+CL)]1/2

Resolucin de columnas

El usuario debe optimizar el proceso cromatogrfico de manera que la resolucin sea mayor a 1,5.
La resolucin RS de una columna proporciona una medicin cuantitativa de su capacidad para separar
dos analitos.
La resolucin debe ser de tal forma que si se tienen dos sustancias se puedan separar
La resolucin en general es una funcin de (selectividad), k`(capacidad) y N (nmero de platos
tericos.

RS = N1/2 (-1) (k`B)

4 (1+k`B)

A B C

Trmino A depende de la construccin de la columna.

Trmino B depende de , y este a su vez de la naturaleza qumica de los compuestos a separar (cargas,
momento dipolar).
Trmino C depende de la naturaleza de la sustancia y de la naturaleza de la fase estacionaria y para H.P.L.C.
tambin depende de la fase mvil.

A partir de la ecuacin anterior se obtienen otras expresiones:

N = 16 RS2 ()2 (1+k`B)2 Con esta ecuacin se puede calcular el nmero de platos tericos necesarios para
llevar a cabo una resolucin dada.
(-1)2 (k`B)2

Efecto de la resolucin sobre el tiempo de retencin.

El tiempo de retencin de B (tRB) necesario para fluir dos especies A y B con una resolucin R S esta dado por:

(tR)B = 16RS2H2(1 + k`B)3 donde: vO: velocidad lineal de la fase mvil.

vO ( - 1)2 (k`B)2

Para el clculo de la resolucin se hace la proyeccin a partir de los picos en el cromatograma.

En algunos casos de detectores conductmetros (que miden conduccin trmica) aparece un peak
primero que corresponde al aire.

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Parmetros de retencin.

Tiempo de retencin (tR)

Tiempo muerto (tO)
Tiempo de retencin corregido (tR`)
Volumen de retencin (VR)

VR = tR fc donde: fc = flujo de la columna, medido con un flujmetro. [ml/min]

Volumen muerto (VO)

Volumen de retencin corregido (VR`)

VR` = tR` fc = VR VO

Volumen de retencin ajustado: se define en cromatografa de gases (V R)

VR = VR j donde: j = constante de Gidding

La cada de la presin no es lineal.

Volumen de retencin neto (VN)

VN = VR j = (VJ VO) j

Volumen especfico de retencin (VO)

VO = 273,2 Kf / TC O donde: TC = temperatura de la columna

Kf = CS/CM
O = densidad de la fase estacionaria

La T de trabajo debe ser mayor a la temperatura de ebullicin de la muestra para que este en estado gaseoso.

Velocidad de la sustancia con retencin (v)

Velocidad de la sustancia sin retencin (vO) = siempre es mayor.
Volumen especfico de retencin (Vo)

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 Vg = (273 R) / PM i Pi donde: PM = peso molecular
i = coeficiente de actividad del soluto en fase estacionaria a dilucin infinita
(Rango 0.3 5.0)
Pi = presin de vapor de saturacin del soluto puro a la T de trabajo

Obtencin de Vg:

Vg
K = Vg
L = Fo [T C - O][1] [Po PW]
[273] [Po] [tR tO] donde: W = peso de fase estacionaria de la columna
[T] [W]
273.2 [760] [Pi + Po]
Vg es un elemento de criterio para anlisis cualitativos
Si se tiene un Vg experimental igual a terico entonces hay probabilidad que se trate de la sustancia en
cuestin.
Sin embargo todo anlisis cualitativo es mas complicado, ya que involucra dos alternativas si o no.
La energa libre molar de Gibbs parcial de un soluto a dilucin infinita en la fase estacionaria puede ser
calculada:
G = -RTC ln (KL)

Efecto de la velocidad de flujo de la fase mvil en la eficiencia de la columna

El grado de ensanchamiento de la banda depende del tiempo que la fase mvil esta en contacto con la
fase estacionaria.
La eficiencia de la columna depende de la velocidad de flujo de la fase mvil.
Tanto para G.L.C. como H.P.L.C. las alturas mnimas (eficiencia mxima) ocurren a velocidades de flujo
relativamente bajas.

En H.P.L.C. los peak en el cromatograma

aparecen en forma clara y distinta si se trabaja sobre
0.8, por lo tanto no se puede trabajar en el rango
mnimo (>0.5). el rango de trabajo es de [0.8;0.9-2.0]
ml/min
Hay otras columnas que son mucho ms
rpidas pero estn construidas de otro material [5.0-10]
ml7min
Generalmente en los papers se trabaja a 1.0mi/min

En G.L.C. la velocidad mxima se puede

trabajar en un factor 2 VMAX. Se puede trabajar en
rango ms amplio.

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Otras variables que afectan la eficiencia de la columna son:

Dimetro de las partculas que constituyen el relleno

H es mayor (menor eficiencia) a medida que las columnas estn rellenas, disminuyendo H (mayor eficiencia) a
medida que se tienen partculas ms pequeas.
Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamao de partcula del empaque de la
columna empleando capas ms delgadas de la pelcula inmovilizada (en donde la fase estacionaria es un
lquido adsorbido sobre un slido).
Para compensar la perdida de eficiencia se puede tener:
Partculas grandes columna grande
Partculas pequeas columna pequea

Dimetro de la columna

Para aprovechar el efecto del dimetro de la columna se han utilizado columnas cada vez ms estrechas. A
menor dimetro aumenta la eficiencia.

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