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Resumen 3

Los peroxisomas son orgnulos eucariticos rodeados por una nica membrana bicapa, que
contiene una variedad de protenas segn el organismo; principalmente realizan reacciones de
degradacin de metabolitos txicos (detoxificacin), catabolismo de cidos grasos lineales y de
cadena ramificada, y eliminacin de H2O2 (formado en algunos procesos oxidativos) por catalasa.
Las protenas llamadas peroxinas participan en el reclutamiento, el transporte y la introduccin de
las protenas de la matriz peroxisomal en los peroxisomas. Las protenas de la matriz contienen las
seales de orientacin peroxisomal PTS1 y / o PTS2 que son reconocidas por las peroxinas Pex5 y
Pex7, respectivamente. La evidencia inicial indic que la enzima biosinttica de la penicilina
isopenicilina N aciltransferasa (IAT) de Penicillium chrysogenum se encuentra dentro de los
peroxisomas. Ahora hay evidencia slida (basada en microscopa electrnica y / o datos
bioqumicos) de que la IAT y las enzimas que activan el cido fenilactico y los cidos grasos tambin
se encuentran en los peroxisomas. De manera similar, las protenas CefD1 y CefD2 de Acremonium
chrysogenum que realizan las reacciones centrales (activacin y epimerizacin de la isopenicilina N)
de la ruta de la cefalosporina estn dirigidas a los peroxisomas. La evidencia creciente apoya la
conclusin de que algunas enzimas implicadas en la biosntesis de micotoxinas (por ejemplo, toxina
AK) y la biosntesis de molculas de sealizacin en plantas (por ejemplo, cido jasmnico o auxinas)
se producen en peroxisomas. La alta concentracin de sustratos (en muchos casos txicos para el
citoplasma) y enzimas dentro de los peroxisomas permite la sntesis de metabolitos con actividades
biolgicas o farmacolgicas interesantes. Esta compartimentacin plantea desafos adicionales para
la clula debido a la necesidad de importar los sustratos en los peroxisomas y exportar los productos
de Wnal; los transportistas involucrados en estos procesos todava son muy poco conocidos. Este
artculo se centra en nuevos aspectos de los procesos metablicos que ocurren en los peroxisomas,
a saber, los procesos de degradacin y detoxificacin que conducen a la biosntesis y secrecin de
metabolitos secundarios.

Introduccin

Los peroxisomas son orgnulos eucariticos ubicuos rodeados por una nica membrana bicapa. Las
protenas peroxisomales, denominadas peroxinas, participan en la importacin de protenas
matriciales, protenas diana y de membrana peroxisomal, herencia y regulacin del tamao y la
abundancia del peroxisoma. Las protenas de la matriz peroxisomal son dirigidas e importadas en
los peroxisomas debido a la presencia de una seal de direccin peroxisomal conservada (PTS), y
una vez dentro de estos orgnulos, juegan una variedad de funciones esenciales para la fisiologa
celular, como la oxidacin de cidos grasos. oxidacin y epimerizacin de cidos grasos de cadena
ramificada, metabolismo de compuestos reactivos y catabolismo de poliaminas. En los hongos
Wusasus, la biosntesis de los antibiticos de? -lactama se compartimentaliza [27, 75, 85] y los
peroxisomas desempean un papel crucial que alberga algunos pasos de las vas biosintticas de
penicilina y cefalosporina. En esta revisin nos enfocamos en las protenas y enzimas peroxisomales,
especialmente aquellas involucradas en la desintoxicacin de compuestos orgnicos txicos, la
biosntesis de penicilina / cefalosporina y la secrecin de metabolitos de peroxisomas mediada por
resistencia a mltiples frmacos.

Peroximasas
Los peroxisomas, tambin conocidos como microcuerpos, representan una clase de organelos
plsticos morfolgicos (que varan de 0,1 a 1 m de dimetro) que se encuentran en prcticamente
todas las clulas eucariticas [34]. Los peroxisomas ocurren en clulas de rin y de hgado de
mamferos, plantas (especialmente en clulas fotosintticas de la hoja estrechamente asociadas con
cloroplastos y mitocondrias), hongos, levaduras y ciertos protozoos. A diferencia de otros orgnulos,
como el ncleo, las mitocondrias o los cloroplastos, los peroxisomas no contienen ADN. Aunque
estos organelos se describieron por primera vez en 1954, se identificaron Wed y se designaron como
peroxisomas (debido a la presencia tpica de oxidasas y catalasas) una dcada despus [15]. Los
peroxisomas estn rodeados por una delgada membrana bicapa individual (aproximadamente 7
nm) con una baja relacin protena-lpido que, debido a la naturaleza txica o peligrosa de algunos
metabolitos acumulados dentro de este orgnulo, acta como una barrera que protege el citosol de
esos compuestos . En este contexto, los peroxisomas actan como un horno de desecho de
compuestos orgnicos txicos, donde se oxidan, se unen a las molculas transportadoras y se
secretan por va oral fuera de las clulas (vase a continuacin). La membrana peroxisomal es una
estructura dinmica modificada segn las necesidades ambientales, formndose principalmente del
retculo endoplsmico, aunque las mitocondrias tambin estn involucradas en la biognesis de la
membrana del peroxisoma [92].

Biogenesis y abundancia de peroxisoma.

La formacin de peroxisomas depende de las protenas codificadas por los genes PEX (ms de 30
protenas diferentes descritas hasta ahora y conocidas colectivamente como peroxinas) que estn
involucradas en la importacin de protenas matriciales, protenas diana y de membrana
peroxisomal, herencia y regulacin del nmero peroxisomal y tamao [47, 60]. Se cree que las
protenas de matriz de peroxisoma se sintetizan en ribosomas libres en el citosol antes de la
importacin. Dependiendo de la seal de orientacin peroxisomal conservada (PTS) incluida en su
C-terminal (PTS1) o cerca del extremo N-terminal (PTS2) [60], estas protenas son reconocidas por
las peroxinas Pex5 y Pex7, respectivamente [66, 88], que los atan y los liberan dentro del
peroxisoma. El dinamismo de los peroxisomas se logra a travs del equilibrio molecular entre la
biognesis (aumento) y la degradacin (autofagia). Bsicamente, la formacin de novo de los
peroxisomas del retculo endoplsmico parece estar asociada con la protena Pex3, que tambin
desempea un papel en la herencia de los peroxisomas [86]. Se sugiere que esta peroxina es esencial
para la formacin de compartimentos vesiculares iniciales denominados pre-peroxisomas, que
crecen mediante el reclutamiento de protenas de membrana peroxisomal recin sintetizadas y
protenas de matriz para formar un peroxisoma maduro que se multiplica por Wssion. La misin
peroxisomal implica varios pasos consecutivos, parcialmente superpuestos, para algunos de los
cuales la protena de membrana pex11 ms abundante es crucial [113]. El mecanismo de accin de
Pex11 implica la induccin de la asimetra de la membrana, lo que resulta en la curvatura de la
membrana durante el peroxisoma Wssion [93]. Adems de Pex11, una segunda clase de protenas
es la familia de las protenas similares a la dinamina, que son grandes GTPasas involucradas en la
fusin de membranas y eventos de Wssion [61, 92, 102, 113]. Para mantener el metabolismo
peroxisomal de acuerdo con los requisitos ambientales y de desarrollo, la degradacin de los
peroxisomas (pexofagia) adems de la biognesis controla el nmero de peroxisomas. Por lo tanto,
la abundancia de peroxisomas puede reducirse rpidamente a travs de vas autofgicas, que
degradan selectivamente peroxisomas fusionndolos a lisosomas o vacuolas. Los componentes de
dos sistemas de conjugacin de tipo ubiquitina y las peroxinas Pex3 y Pex14 estn implicadas en la
degradacin selectiva de los orgnulos [91, 110].

Organelos relacionados con peroxisoma.

Ciertos organismos poseen organelos microscpicos relacionados con peroxisomas que llevan a
cabo funciones especficas adicionales. Estos orgnulos estn representados por los glucosomas de
los tripanosomtidos, los cuerpos Woronin de los hongos Wlamentous y los glioxisomas de las
plantas y los hongos Wusasus, aunque la distincin entre glioxisomas y peroxisomas es actualmente
controvertida. Los glucosomas, como los peroxisomas, estn rodeados por una nica membrana y
tienen una matriz de protena densa, que contiene principalmente enzimas glucolticas [45]. Se ha
propuesto que los glucosomas estn relacionados con los peroxisomas, ya que algunas vas o
enzimas que se encuentran comnmente en los peroxisomas tambin estn presentes en los
glucosomas de algunas especies [94, 146]. Adems, la similitud de secuencia significativa existente
entre las protenas peroxisomales y glicosomales requeridas para la importacin de protenas
matriciales en tripanosomtidos, levaduras y humanos sugiere que estos orgnulos tienen una
estrecha relacin evolutiva [31, 97]. El hecho de que el segmento de gluclisis Embden-Meyerhof
tenga lugar dentro de los glucosomas hace que estos orgnulos sean nicos. Los cuerpos de
Woronin son organelos densos derivados del peroxisoma que son exclusivos de los hongos Wusasus.
Tienen una membrana doble y se localizan cerca de los tabiques, donde juegan un papel importante
en el sellado del poro septal despus de la lesin hifal, evitando as el sangrado citoplsmico [71]. El
componente principal del cuerpo de Woronin es la protena HEX1, que porta una seal PTS1 y se
localiza dentro de la matriz peroxisomal [54, 70], donde se autoensambla para producir un
ensamblaje slido de protena a escala micromtrica [54, 152]. Aunque estos orgnulos estn
formados por peroxisomas, su biognesis es poco conocida [67]. Los glioxisomas son organelos que
se encuentran en las plantas (tejidos que almacenan aceite) y en los hongos Wusasus [101, 143],
desempeando un papel en la movilizacin de lpidos a los azcares durante el ciclo del glioxilato.
La clasificacin de los glioxisomas, a diferencia de los glicosomas mencionados anteriormente y los
cuerpos de Woronin, como diferentes de los peroxisomas de los orgnulos es controvertida debido
a las diferencias triviales mostradas con respecto a otros peroxisomas. Se crea inicialmente que los
glioxisomas, adems de tener funciones peroxisomales, poseen las enzimas clave Wve del ciclo del
glioxilato: citrato sintasa, aconitasa, isocitrato liasa, malato sintasa y malato deshidrogenasa.
Actualmente, est bien documentado que las nicas dos enzimas nicas del ciclo de glioxilato que
pueden distinguir los glioxisomas de otros peroxisomas son la isocitrato liasa y la malato sintasa. los
peroxisomas son isocitrato liasa y malato sintasa. Estas observaciones, junto con la genmica
funcional y los estudios de biologa celular, sugieren que el trmino "glioxisoma" no es adecuado y
que los glioxisomas y peroxisomas se deben unir bajo la misma clase de orgnulos [101].

Protenas de matriz peroxisomal.


La presencia de un gran nmero de protenas en la matriz peroxisomal implica que varias funciones
metablicas, que varan con el organismo, la etapa de desarrollo y las condiciones ambientales,
tienen lugar dentro de estos orgnulos (Tabla 1). En general, estas funciones estn relacionadas con
la oxidacin de cidos grasos, el metabolismo del perxido de hidrgeno, el oxgeno reactivo y la
sealizacin de las especies reactivas del nitrgeno, el envejecimiento celular, la inmunidad innata
antiviral y el metabolismo de las poliaminas [18, 34, 129, 141]. Este amplio conjunto de funciones
podra ser ms especfico en mamferos, plantas u hongos. En las clulas de mamferos, los
peroxisomas tambin estn implicados en la biosntesis del plasmalgeno, el fosfolpido ms
abundante en la mielina [141], en la formacin de cidos biliares [30] y en la ruta de la pentosa
fosfato. Otras funciones peroxisomales conocidas incluyen el metabolismo del glioxilato
(glioxisomas) [64], la fotorespiracin en plantas, la gluclisis (glucosomas) en tripanosomtidos, el
metabolismo de fuentes inusuales de carbono y nitrgeno que pueden ser txicas para las clulas
en algunas levaduras (metanol, cido oleico , D-aminocidos y purinas) [137], y la biosntesis de
micotoxinas o antibiticos? -lactam en algunos hongos Wlamentous que contienen los genes de
biosntesis de? -lactama [75, 85, 122] (Tabla 1).

Orientacin de protenas de matriz peroxisomal

Como se indic anteriormente, varias actividades enzimticas tienen lugar en los peroxisomas. Estas
actividades son realizadas por diferentes protenas que deben ser importadas dentro de los
peroxisomas desde el citosol [149]. Algunas de las protenas que se encuentran en la matriz
peroxisomal son espectroscopia de peroxisoma, mientras que otras tienen localizaciones
subcelulares mltiples debido a la presencia de varias seales de direccin dentro de la misma
protena, como en el caso de la 3 hidroximetilglutaril-coenzima A (CoA) liasa [5 ] y? -methylacyl-CoA
racemase [63]. Adems, la localizacin peroxisomal de una cierta protena puede ser especfica de
la especie. Los peroxisomas pueden importar protenas plegadas monomricas e incluso
oligomricas [38]. La isopenicilina N aciltransferasa (una enzima peroxisomal que cataliza el ltimo
paso de la biosntesis de penicilina) se importa en peroxisomas independientemente del estado de
procesamiento; esta protena puede entrar en los peroxisomas como un? -? heterodmero o como
un monmero sin procesar [35].

Secuencias de orientacin de peroxisomas

El principal mecanismo que determina la localizacin peroxisomal de una protena es la presencia


de una secuencia de orientacin peroxisomal consenso (PTS) en la secuencia de aminocidos. La
presencia de un PTS, sin embargo, no significa necesariamente que la protena sea verdaderamente
peroxisomal, como se ha confirmado para la fosfomevalonato - quinasa humana, que posee un
PTS1, pero que habitualmente se localiza en el citosol. Esto podra indicar que otras secuencias
adems de la seal de direccionamiento PTS1 son importantes para la localizacin subcelular. Las
secuencias de direccin del peroxisoma se dividen en dos tipos (PTS1 y PTS2) de acuerdo con los
residuos de aminocidos que los constituyen y la posicin que toman dentro de la protena. PTS1
est presente en la regin C-terminal de la protena y consiste en la secuencia consenso SKL o
variaciones de la misma (S / A / C (K / R / H / N) - (L / I / M), mientras que PTS2 se encuentra cerca
de la regin N-terminal de la protena y est representada por la secuencia consenso (R / K) - (L / I /
V) -X5 (Q / H) - (L / A) [16, 105, 123]. Las peroxinas receptoras Pex5 y Pex7 reconocen las seales
PTS1 y PTS2, respectivamente [66, 88]. Los residuos que rodean a un STP putativo tambin son
importantes para la seleccin, ya que pueden aumentar la unin entre la protena y su receptor [79,
82, 83, 103, 124]. Las protenas que contienen PTS1 son ms abundantes que las que contienen una
secuencia PTS2. Adems de PTS1 y PTS2, tambin se ha informado de que en algunas protenas otras
secuencias de direccionamiento interno tambin pueden servir como PTS y varias protenas de
matriz peroxisomal carecen de PTS1 cannico se clasifican a peroxisomas a travs de Pex5 [138].
Otra forma de importar protenas en la matriz peroxisomal es mediante el transporte de transporte
de enlace, donde carecen de protenas g un PTS se puede clasificar en peroxisomas de una manera
dependiente de Pex5 formando un complejo con una protena que contiene PTS [52, 138]. Como se
mencion brevemente anteriormente, la importacin de protenas peroxisomales que contienen
PTS1 y PTS2 est mediada por las peroxinas Pex5 y Pex7, respectivamente. Ambos receptores
cargados de carga atracan en los mismos componentes de translocon de peroxisoma, seguidos por
la liberacin de carga y el reciclado del receptor, como parte del proceso completo de translocacin
entre el citosol y el peroxisoma [14, 87]. Durante el ciclo de importacin, Pex5 reconoce y une la
protena que lleva PTS1 en el citosol. La unin est mediada por siete repeticiones
tetratricopeptdicas (cada una constituida por un motivo degenerado de 34 aminocidos que forma
dos haces helicoidales), que estn presentes en la mitad C-terminal de la protena receptora [11,
32]. Por el contrario, en aquellas protenas que tienen secuencias de direccin peroxisomal interna,
la interaccin est mediada por la mitad N-terminal de Pex5 [149]. Una vez que la protena de carga
y el receptor estn unidos, este complejo se une al complejo de atraque, que consiste en peroxinas
Pex13, Pex14 y Pex17 (esta ltima solo identificada en las levaduras) [89, 149] localizada en la
membrana peroxisomal, donde la carga se libera en la matriz peroxisomal. Este proceso de
translocacin requiere la ubicuitina ligasas RING-Wnger Pex2, Pex10, Pex12 [28, 50, 100, 117, 120,
148], y Pex8 (este ltimo solo se identifica en las levaduras) [1]. Luego, Pex5 se libera de la
membrana en una forma dependiente de adenosina trifosfato (ATP) y ubiquitina (mediada por la
enzima conjugada con ubiquitina Pex4 en levaduras o UbcH5a / b / c en humanos) [40, 99, 147] a la
citosol, donde se degrada o se recicla para una nueva ronda de importacin [14, 19, 87]. La
liberacin del receptor de la membrana se lleva a cabo mediante las pex1 ATPase perox Pex1 y Pex6,
que estn ancladas a la membrana del peroxisoma, por Pex15 en levaduras o por Pex26 en
mamferos [23, 37, 56, 76, 154]. Las protenas que contienen PTS2 se importan a los peroxisomas
por el receptor Pex7, que requiere componentes proteicos adicionales para la direccin del
peroxisoma, funcionando as como un correceptor PTS2 [115]. La importacin mediada por Pex7
requiere Pex5 en varios organismos [10, 46, 77, 89, 95, 106, 150]. Sin embargo, el Pex7 fngico no
requiere Pex5 para la importacin de protena peroxisomal. En cambio, funciona en concierto con
otras protenas auxiliares, como Pex18 y Pex21 en Saccharomyces cerevisiae [104] y Pex20 en
Neurospora crassa [118], Yarrowia lipolytica [22], Pichia pastoris y Hansenula polymorpha [96].
Aunque el conocimiento previo sobre la maquinaria de importacin es amplio, el mecanismo de
translocacin de protenas a travs de la membrana peroxisomal es todava oscuro. Los procesos
DiVerent, como los eventos de invaginacin de membrana (similares a la endocitosis), los procesos
de fusin de vesculas o la formacin dinmica de poros transitorios, se han propuesto como
modelos para la translocacin de protenas [26, 80]. De acuerdo con la hiptesis de poros
transitorios, Pex5 y Pex14 forman un canal de conduccin inica controlado y dinmico de
aproximadamente 9 nm inducido por el complejo receptor citoslico-carga [80]. En relacin con
esto, tambin se ha sugerido que la maquinaria mnima de translocacin requerida para la
importacin de protena matricial en P. pastoris est representada por los receptores PTS y Pex14
[69].

Protenas de membrana peroxisomal

Las protenas de membrana peroxisomal (PMP) estn codificadas por genes nucleares, traducidas
en ribosomas citoplasmticos e importadas despus de la traduccin en la membrana peroxisomal.
La maquinaria de importacin de los PMP es diferente de la de las protenas de la matriz
peroxisomal, ya que la mayora de las mutaciones de PEX que interrumpen la importacin de
protenas de la matriz todava muestran una integracin funcional de los PMP [13, 25, 39]. En
general, se han propuesto dos vas de importacin para la seleccin de PMP [134]. En la va de Wrst,
las protenas hidrofbicas se insertan directamente en las membranas peroxisomales existentes
despus de ser sintetizadas en el citosol [121]. Alternativamente, en la segunda va [125, 126], las
PMP pueden sintetizarse en el retculo endoplsmico rugoso, donde se concentran en vesculas pre-
peroxisomales. Estas vesculas funcionan como un origen para la formacin de novo de peroxisomas
o se fusionan con la membrana de los peroxisomas existentes. Como consecuencia de estas dos vas
de incorporacin, los PMP se pueden dividir en dos clases llamadas clase I (para la va Wrst) y clase
II (para la segunda) [109]. Mientras que la clase I corresponde a los PMP que se importan a las
membranas peroxisomales a travs de una va dependiente de Pex19p, los PMP de clase II se dirigen
independientemente de Pex19p a las membranas de peroxisoma [55]. Las seales de direccin de
la protena de membrana peroxisomal (mPTS) se identificaron para varios PMP con al menos una
regin transmembrana [21, 49]. Los PMP de clase I poseen un mPTS que se reconoce en el citosol
por la peroxina Pex19p. Esta peroxina es una protena farnesilada principalmente localizada en el
citosol y parcialmente asociada con la membrana peroxisomal. Pex19p funciona como un receptor
de importacin y / o chaperona requerido para la estabilizacin de los PMP en la membrana
peroxisomal [78]. Una vez que se reconoce el motivo mPTS del PMP, Pex19p dirige el complejo
Pex19p-PMP a la membrana peroxisomal mediante el acoplamiento a su socio de unin anclada a
la membrana Pex3p [29]. A continuacin, el PMP se inserta en la membrana peroxisomal,
probablemente con la ayuda de Pex19p y Pex3p. Finalmente, Pex19p vuelve al citosol, donde se
reinicia el proceso de importacin de PMP [109]. Una pequea proporcin de PMP pertenece a los
PMP de clase II, que se clasifican indirectamente a los peroxisomas a travs del retculo
endoplsmico. El mPTS de esta clase se encuentra en la regin N-terminal y contiene una regin
transmembrana, pero no un sitio de unin Pex19p [44, 119]. Se sabe que Pex3p, Pex16p y Pex22p
pertenecen a los PMP de clase II [33, 44]. Sin embargo, los mecanismos responsables de dirigirse a
la membrana peroxisomal y la incorporacin en el retculo endoplsmico todava son bastante poco
conocidos [44, 98, 126, 128].

Vas de degradacin y conversin de metabolitosen peroxisomas


La diversidad de enzimas y procesos metablicos localizados en los peroxisomas es impresionante.
En todos los casos, estos procesos metablicos tienen en comn la oxidacin y / o degradacin de
compuestos orgnicos y la eliminacin de H2O2 (formado en algunas reacciones oxidativas) por
catalasa (una enzima presente muy frecuentemente en los peroxisomas). No todas las enzimas que
se sabe que estn dirigidas a los peroxisomas estn presentes simultneamente en estos orgnulos.
Las clulas tienen la capacidad de dedicar formas "especializadas" de peroxisomas a procesos
metablicos especficos al concentrar en estos orgnulos conjuntos especficos de enzimas
dependiendo de las necesidades metablicas de las clulas. Algunas enzimas localizadas en los
peroxisomas, como la fenilacetil-CoA ligasa (PhlA) que activa el cido fenilactico o fenoxiacetilo,
estn claramente implicadas en la detoxificacin de estos cidos orgnicos unindolos al grupo
amino del cido 6-aminopenicilnico (6-APA). Los cidos orgnicos aromticos utilizados como
sustratos para la biosntesis de penicilina se forman en la naturaleza por la degradacin de molculas
de fenilpropanoides que a su vez se producen por catabolismo de lignina o de aminocidos
aromticos (fenilalanina, tirosina). Los cidos fenilacticos y fenoxiacticos son txicos para P.
chrysogenum, impidiendo el crecimiento a concentraciones superiores a 2,0 g / l [62, 65]. La cepa
de laboratorio Wis54-1255 resiste hasta 2,0 g / l de cido fenilactico en medio slido, mientras que
dos mutantes diferentes interrumpidos en el gen phlA no pudieron crecer a una concentracin de
cido fenilactico (o cido fenoxiactico) de 1,5 g / l. Es digno de mencin que un transformante
que sobreexpresa el gen phlA (que contiene una actividad de la enzima phenylacetyl-CoA ligasa ocho
veces mayor en comparacin con la cepa Wis54-1255 de control) resiste hasta 3,0 g / l de cido
fenilactico. De hecho, la resistencia al cido fenilactico o fenoxiactico es uno de los mtodos
clsicos de seleccin de cepas despus de la mutagnesis aleatoria [8]. Lamas-Maceiras et al. [65]
observ que los mutantes alterados por phlA todava contienen un 46% de actividad fenilacetil-CoA
ligasa y proporcionaron evidencia de la presencia de un segundo gen homlogo a phlA. De hecho,
cuando el genoma de P. chrysogenum se secuenci, se observaron otras enzimas anotadas como
coumaroil-CoA ligasas [135]. Algunas de estas protenas de tipo cumaroil-CoA-ligasa tienen de hecho
actividad de fenilacetil-CoA ligasa (vase a continuacin). Otro ejemplo de compuestos txicos que
se eliminan en los peroxisomas al unirse a los compuestos intermedios de? -lactama es el de los
cidos grasos de cadena ramificada en A. chrysogenum [75] (vase a continuacin). Algunas rutas
de degradacin pueden haber sido reclutadas e integradas en vas biosintticas de metabolitos
secundarios.

Enzimas peroxisomales implicadas en cefalosporina biosntesis.

Las cefalosporinas son antibiticos de amplio espectro producidos por A. chrysogenum y algunos
otros hongos Wusasus que se utilizan ampliamente y con xito en medicina en el tratamiento de
diferentes infecciones bacterianas. La va biosinttica de la cefalosporina (Fig. 3a) comienza con la
condensacin no ribosomal de los aminocidos tres precursor L -? - cido aminoadpico, L-cistena y
L-valina para formar el tripptido ACV [2]. Esta reaccin se lleva a cabo por la ACV sintetasa [6]
codificada por el gen pcbAB [41]. El tripptido se cicla para formar IPN por la IPN sintasa codificada
por el gen pcbC [111]. La IPN, que tiene una actividad antibacteriana dbil, puede ser secretado sin
pasar a travs de los peroxisomas (terminando as una va penicilina) o se convierte a las
cefalosporinas en varios pasos, algunos de los cuales tienen lugar en los peroxisomas (la ruta de
cefalosporina). En el ltimo caso, el IPN se isomeriza a la D-conWguration por las enzimas
codificadas por dos genes enlazados, cefD1-cefD2, dando lugar a la penicilina N (Penn) [74, 132],
que ms tarde se convierte en deacetoxicefalosporina C (DAOC) mediante una etapa de expansin
del anillo catalizada por la deacetoxicefalosporina C sintasa (codificada por el gen cefEF). Esta
enzima tambin puede oxidar el grupo metilo en el carbono 3? de la deacetoxicefalosporina C para
dar deacetylcephalosporin C (DAC) [20, 114]. Ambas actividades estn ubicadas en un solo
polipptido codificado por el gen cefEF [112]. El ltimo paso de la va de biosntesis de cefalosporinas
implica la conversin de DAC a cefalosporina C (CPC) por la acetiltransferasa DAC codificada por el
gen cefG [42, 140] (figura 3a). En las cepas de A. chrysogenum, los genes para la biosntesis de la
cefalosporina C estn organizados en dos grupos separados localizados en diferentes cromosomas
(Fig. 3b) [43]. El cluster temprano gen, localizado en el cromosoma VII (4,6 Mb), contiene los genes
pcbAB y pcbC (que codifican las enzimas para la WRST dos etapas de la ruta para formar IPN) y cefD1
y cefD2, responsables de la epimerizacin de IPN en PenN.

El clster de genes "tardos" est ubicado en el cromosoma I (2.2 Mb) y contiene los genes cefEF y
cefG, cuyos productos proteicos estn implicados en la conversin de PenN en CPC. En A.
chrysogenum, inicialmente se inform que las enzimas de la va de biosntesis de cefalosporinas
(sintetasa de ACV, IPN sintasa, expandasa / hidroxilasa y DAC acetiltransferasa) tienen localizacin
citoslica [27, 136, 139]. Sin embargo, el paso central de la va biosinttica de la cefalosporina C
(catalizada por un sistema de protenas de dos componentes codificado por los genes cefD1 y cefD2)
parece estar localizado en los peroxisomas [132]. Es interesante que la etapa de epimerizacin
discrimina entre la corta "ruta de IPN" que resulta en la secrecin de IPN (un antibitico dbil) y la
"va de cefalosporina" larga (que incluye una continuacin de la va corta). El anlisis bioinformtico
de las secuencias de aminocidos CefD1 y CefD2 mostr que ambas enzimas contienen una seal
de orientacin peroxisomal. CefD1 tiene un PTS1 (PRL) C terminal, mientras que CefD2 contiene
seales PTS1 (EKL) y PTS2 (KLVVELAGL) [127]. Adems, en los primeros estudios bioqumicos [68],
se inform que el pH 7.0 es el pH ptimo para la conversin de IPN en PenN en extractos libres de
clulas de A. chrysogenum, que es coincidente con el pH estimado de la luz peroxisomal [139]. La
presencia de protenas relacionadas con CefD1 y CefD2 (aunque no ortlogos estrictos) en otros
hongos que carecen del grupo de cefalosporina sugiere que A. chrysogenum ha reclutado y
adaptado estos genes de otras funciones fngicas o quizs de organismos no fngicos mediante un
mecanismo de transferencia de genes horizontal [43]. , 74].

El sistema de epimerizacin de IPN es similar a las racemasas de? -metilacilo de mamfero

Las enzimas de epimerizacin de IPN CefD1 y CefD2 son homlogas a las enzimas implicadas en la
degradacin de los cidos grasos \ beta - metilo (Fig. 1) [74]. En las clulas animales, las racemasas
implicadas en la degradacin de estos cidos grasos ramificados se utilizan para su detoxificacin.
En A. chrysogenum, pueden actuar de manera similar, convirtindolos en cido \ alpha - hidroxi -
adpico, cido \ beta - cetoadpico y cido \ alpha - aminoadpico que se detoxifican unindolos a 6
- APA. La formacin de adipil- o glutaril-6-APA es conocida en los hongos productores de \ beta -
lactama, ya que estos compuestos son sustratos para las enzimas de crecimiento rpido en la
biosntesis in vivo de cefalosporinas modificadas. Las racemasas de? -metilacil-CoA son enzimas de
degradacin de cidos grasos de cadena ramificada, algunas de las cuales estn implicadas en la
biosntesis de cidos biliares. Catalizan la racemizacin de una amplia gama de cidos carboxlicos
de cadena ramificada de metilo activados como CoA-tiosteres [144]. Los sustratos fisiolgicos de
esta enzima son cidos grasos ramificados en la dieta, como el cido pristanic (cido 2,6,10,14-
tetrametilpentadecanoico), que es un? producto de oxidacin del cido fitnico, derivado de la
degradacin de la clorofila en los alimentos. La misma enzima se usa para la biosntesis de cidos
biliares (ver arriba). ? La oxidacin de los cidos grasos de cadena ramificada de metilo y tambin la
degradacin de la cadena lateral del colesterol que conduce a los cidos biliares se producen en los
peroxisomas [30]. Sin embargo, Kotti et al. [63] han demostrado que la misma enzima puede estar
dirigida a los peroxisomas y las mitocondrias. La secuencia N-terminal acta como una secuencia de
direccionamiento mitocondrial dbil, mientras que la secuencia C terminal contiene una seal PTS1.

Transporte de intermedios de cefalosporina dentro y fuera de peroxisomas

La epimerizacin de IPN a PenN en peroxisomas implica la presencia de sistemas de transporte


especficos para ambos compuestos intermedios biosintticos de cefalosporina C a travs de la
membrana peroxisomal. Sobre la base de los patrones de agrupamiento de genes para la biosntesis
de metabolitos secundarios [48] identificamos en el grupo de genes de cefalosporina temprana
algunos de estos transportadores de metabolitos clave. Usando este enfoque, las protenas de
membrana implicadas en el transporte de productos intermedios se han clonado y caracterizado.

Dos transportadores peroxisomales CefM y CefP en el grupo de cefalosporina

Encontramos dos transportadores de membrana peroxisomal codificados por los genes cefM [127]
y cefP [133]. Estos genes se encuentran en el grupo de genes de cefalosporina "temprana" (Fig. 3b).
El anlisis de las protenas CefM y CefP mediante herramientas bioinformticas revel la presencia
de un dominio de unin Pex19p en las secuencias de aminocidos de ambas protenas. Este dominio
es caracterstico de los PMP de clase I (ver arriba) que son reclutados por la protena Pex19 para ser
incorporados a la membrana peroxisomal [78, 108]. El gen cefM localizado aguas arriba de cefD1
(figura 3b) codifica una protena de bomba eZux (482 aminocidos con una masa molecular
deducida de 52.2 kDa) que pertenece a la familia 3 (protenas eZux de frmaco) de la clase de
membrana de la superfamilia principal facilitadora (MFS) protenas. Un mutante cefM knockout
mostr una drstica reduccin en la produccin de PenN y CPC extracelular, mientras que acumul
PenN intracelular. Los experimentos de microscopa confocal con la protena hbrida GFP Xuorescent
CefM mostraron una probable ubicacin de la membrana microbody de la protena CefM [127]. El
otro gen clave transportador de metabolitos conocido como cefP [133] se encuentra aguas arriba
del gen cefT [131] (figura 3b). El gen cefP codifica una protena de 866 aminocidos con una masa
molecular deducida de 99,2 kDa y con 11 llaves transmembrana putativas. La inactivacin dirigida
del gen cefP dio como resultado una reduccin drstica en el CPC y una acumulacin de IPN en los
caldos de cultivo. La falta del transportador CefP en las cepas interrumpidas bloquea la conversin
de IPN a PenN, lo que indica que el gen cefP es esencial para la biosntesis de la cefalosporina C. Los
experimentos in vivo de microscopa de Xuorescencia usando una protena hbrida funcional DsRed-
CefP indicaron que los orgnulos inicialmente descritos como microcuerpos [127] son peroxisomas
autnticos, ya que esta protena hbrida se co-localiza con la protena reportera dirigida a
peroxisoma EGFP-SKL [133]. Estos resultados permitieron la propuesta de un modelo para el
transporte de los intermedios IPN y PenN dentro y fuera de los peroxisomas (Fig. 4). Este modelo
comienza con la sntesis de ACV e IPN en el citosol por la sintasa del ACV citoplsmico y la IPN sintasa,
respectivamente [27]. El IPN intermedio es transportado por la protena CefP desde el citosol a la
matriz peroxisomal a travs de la membrana peroxisomal, donde se convierte en PenN por el
sistema de epimerizacin de dos protenas (CefD1-CefD2) [132, 133]. Ms tarde, el producto de
epimerizacin PenN parece ser transportado desde el lumen peroxisomal al citosol por el vehculo
CefM [127]. Finalmente, las dos ltimas enzimas de la ruta biosinttica de cefalosporina C
convierten PenN en CPC en el citosol [27, 136].

Figura 3. La va biosinttica de la cefalosporina C y la organizacin deldos grupos de genes de


biosntesis de cefalosporina C en A. chrysogenum.una ruta de biosntesis de la cefalosporina C. b
gen de la cefalosporina C racimos. El clster "temprano" incluye la biosntesis (pcbAB, pcbC, cefD1
y cefD2) y los genes transportadores (cefT, cefM y cefP). Los El clster "tardo" incluye genes cefEF
y cefG.

Fifura 5. Compartimentalizacin de la va biosinttica de la cefalosporina C en A. chrysogenum.


Modelo propuesto que describe el transporte de intermedios dentro y fuera de peroxisomas,
mostrando la localizacin de los transportadores CefT, CefM y CefP. Cys, L-cistena, Val, L-valina;
ACV, \ alpha (L - \ varepsilon - aminoadipil) - L cisteinil - D - valina; ACVS, sintetasa de ACV, IPNS
isopenicilina N sintasa; IPN, isopenicilina N; IPN-ACS, isopenicilina N-CoA sintetasa; IPN-ACE,
isopenicilina N-CoA epimerasa; PenN, penicilina N; EH, deacetoxicefalosporina sintasa (expandasa /
hidroxilasa); DAC, deacetilcefalosporina C; DAC-AT, DAC acetiltransferasa; CPC, cefalosporina C.

La cefalosporina C (CPC) es el precursor de antibiticos ms potentes contra la infeccin humana


causada por bacterias productoras de penicilinasa [16]. CPC fue producido por un hongo
filamentoso, Acremonium chrysogenum, a travs de la fermentacin. La ruta de biosntesis de CPC
comienza con la condensacin de tres aminocidos: cido la-aminoadpico (a-AAA), L-cistena y L-
valina, para formar el tripptido, La-aminoadipil-L-cisteinil-D-valina ( ACV) por ACV sintetasa (ACVS)
[45]. El segundo paso de la va es la ciclacin del ACV para formar isopenicilina N (IPN) [24] catalizada
por una ciclasa (IPNS) [25] con oxgeno libre como aceptor de electrones. Posteriormente, el IPN se
isomeriza a penicilina N (Pen N) mediante una racemase lbil. La cuarta y quinta reaccin es la
expansin oxidativa del anillo de Pen N a deacetoxicefalosporina C (DAOC) [39] y luego a
desacetilcefalosporina C (DAC) por una enzima bifuncional (expandasa / hidroxilasa, DAOCS / DACS)
[8, 29], que requiere un cetoglutarato, Fe2 ?, y O2. Finalmente, DAC se transforma en CPC mediante
una acetil-CoA: DAC acetiltransferasa como se muestra en la Fig. 1.CPC, cefalosporina C

(Martn, Ulln, & Garca-Estrada, 2012)


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