REACCI N DE LAS PEROXIDASAS Y ACTIVIDAD PSEUDOPEROXIDASA

GUTIERREZ MERA, Ingrid Daniela y RENGIFO BERATE; Andrea.

danny_0920@hotmail.com; andrebernate1243@hotmail.com Universidad Icesi, Facultad
de Ciencias Naturales, Programa Qumica Farmacutica, Laboratorio de Bioqumica
Santiago de Cali, Colombia Septiembre 9 de 2015 1.

RESULTADOS. En esta prctica se llev a cabo dos tipos de ensayos, el primero con
dos muestras nativas y el segundo con dos muestras desnaturalizadas; todo esto con el fin
de determinar si la actividad peroxidasa; descomponer el perxido de hidrgeno en ox-
geno y agua1 (ecuacin 1) en dichas muestras fue debido a la actividad de una enzima, o
a cualquier otro agente qumico. Para realizar dicho ensayo se tomaron entre 4 y 5 hojas
de espinaca y se maceraron muy bien hasta obtener el sumo de este; y tambin se
recolectaron aproximadamente entre 2 o 3 gotas de sangre del dedo meique. Despus
de esto cada uno se diluy con agua destilada; donde se distribuyeron cada uno en dos
tubos de ensayo, dos para la desnaturalizacin (sangre y espinaca) y los otros dos para
las muestras nativas.

Imagen 1. Recoleccin de sangre.

Para llevar a cabo la desnaturalizacin de estos, las muestras se calentaron por 3

minutos a 100C en un bao Mara y a continuacin se siguieron los pasos de la tabla
1 obteniendo los resultados mostrados en la misma.
H2O2 H2O + O2 Ecuacin 1. Actividad peroxidasa. Tabla 1.

Resultados para las muestras desnaturalizadas. Muestra (mL) H2O2 (gotas) Bencidina
(mL) Resultados Espinaca 3 0.5 Negativo
Sangre diluda 3 0.5 Positivo
Imagen 2. Desnaturalizacin de muestras. Para las muestras nativas, se hizo el
procedimiento de la tabla 2 despus de la recoleccin, y se muestran los resultados
obtenidos en la misma.
Tabla 2. Resultados para las muestras nativas.
Muestra (mL) H2O2 (gotas) Bencidina (mL) Resultados Espinaca 3 0.5 Positivo Sangre
diluda 3 0.5 Positivo

Adicional a estas pruebas, tambin se ensay la actividad de la enzima en una tela,

manchndola con una muestra nativa de sangre, lavndola con agua y jabn, para
luego hacer la prueba con el perxido de hidrgeno y bencidina, obteniendo un resultado
positivo, este se muestra en la tabla 3. Tabla 3.
Resultados para la tela manchada con sangre. Muestra Resultado Tela manchada con
sangre Positivo 2.

ANLISIS DE LOS RESULTADOS. Al igual que otros grupos funcionales, el grupo hemo
de la hemoglobina es capaz de descomponer el perxido de hidrgeno de forma no
enzimtica, a esto se le llama actividad pseudoperoxidasa de la hemoglobina. Las
reacciones pseudoperoxidasas se analizan usando el H2O2 como sustrato y bencidina
como cromgeno, este ltimo proporciona una coloracin azul caracterstica que permite
diferenciar la actividad peroxidasa o pseudoperoxidasa positiva

2. En el caso de las muestras nativas el resultado para la sangre diluida fue positivo ya que
al agregarle H2O2 se pudo observar burbujas en la reaccin indicando la
descomposicin del sustrato agregado, y al agregar la bencidina se observ la
coloracin azul esperada, demostrando actividad pseudoperoxidasa, pues el oxgeno
liberado en la reaccin convierte un compuesto incoloro en cambio de color (ecuacin 2);
y en la espinaca se muestra actividad peroxidasa, debido a que se descompuso el
perxido de hidrgeno y se present la coloracin azul por parte de la bencidina, esto
se puede observar en la imagen 3. Imagen 3. Muestras nativas despus del procedimiento.
Ecuacin 2. Reaccin despus de haber agregado el sustrato y el cromgeno. Para el
caso de las muestras desnaturalizadas (imagen 4) en la sangre el resultado es positivo,
por lo que la hemoglobina es termoestable, resistiendo temperaturas tan elevadas como el
tratamiento a 180C durante 20 minutos, manteniendo as su actividad
pseudoperoxidasa. Imagen 4. Muestras desnaturalizadas despus del procedimiento. En
el caso de la espinaca desnaturalizada, esta arroj un resultado negativo, pues no se
presenci la coloracin azul por parte del cromgeno, lo cual nos indica que la actividad
enzimtica se deba a una protena, ya que al calentarse la muestra se afectan en esta
la estructura y funcin de ciertas protenas presentes en la misma, haciendo que al
agregar el perxido de hidrogeno y la bencidina ya no se produzca la coloracin
caracterstica que se esperara se presentara. Para la tela manchada con sangre de
puede ver en la imagen 5 que aunque esta se lav con detergente, hipoclorito y etanol
sigui presentando actividad pseudoperoxidasa, debido a la presencia de oxgeno
detectado en forma de burbujas y a la coloracin azul caracterstica de la bencidina.
Imagen 5. Ensayo de la tela manchada con sangre. 3.

CONCLUSIONES. En esta prctica se determin la actividad peroxidasa y

pseudoperoxidasa presente en la espinaca y sangre respectivamente de forma cualitativa
mediante la observacin de burbujas causadas por el sustrato y por la coloracin azul
causada por el cromgeno. La actividad pseudoperoxisada persiste en el caso de la
tela manchada con sangre incluso si la tratamos de eliminar la mancha lavndola. Las
peroxidasas para descomponer el H2O2, necesitan la presencia de otro sustrato en el
medio de reaccin, que a su vez es oxidado durante el proceso; por eso se consideran
que estas son enzimas ambivalentes. Esta prueba tiene valor exclusivamente cuando
es negativa, sirviendo para ratificar la negatividad de las pruebas con certeza en estudios
como los de medicina legal. 4.

BIBLIOGRAFIA. 1. Buscado a peroxidasa en: [en lnea]. [Citado 6 septiembre 2015].

Disponible en: http://cybertesis.uach.cl/tesis/uach/2009/far173e/doc/far173e.pdf 2.
Buscado a actividad peroxidasa: [en lnea]. [citado 6 septiembre 2015]. Disponible en:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02
/parte08/02.html 3. Buscado a hemoglobina en: Ricardo Martnez Rodrguez, Raquel R.
Fundamentos tericos y prcticos de la histoqumica. Pg. 337