La cromatografia y sus aplicaciones

Bibliografa de consulta:
Cromatografia sobre papel y capa fina. Electrofresis. (I. Smith y J. Feinberg)
Quimica Analtica Cualitativa. (Burriel)
Vnculos Web en Internet

Qu es la cromatografia?

Es la tcnica ms desarrollada en los ltimos aos, empleada en la qumica

analtica.
Su empleo presenta notables ventajas:
1. Es sencilla, rpida y no requiere aparatos complicados.
2. Abarca escalas microanalticas hasta escalas industriales.
3. Es una tcnica poco o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias
lbiles.
Constituye una metodologa imprescindible en estudios bioqumicos, toxicolgicos,
estructurales, etc. No solo utilizando como tcnica de separacin e identificacin,
sino como mtodo preparatorio, incluso a escalas industriales.
La palabra cromatografia proviene de kromatos, color y graphos, escrito.
Una de las definiciones de la tcnica ms correcta seria, la dada por Keulemans:
"Mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se distribuyen
en dos fases, una de las cuales constituye un hecho estacionario de gran
desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa a traves o a lo largo del lecho
estacionario (fase mvil)."
En todo proceso cromatografico la fase mvil es la que provoca un movimiento de
las distintas especias para que abandonen el medio soporte, y la fase estacionaria
la que suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que
condiciona que cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad.

CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS:

Son clasificados segn el estado fsico de la fase, el mecanismo de separacin y

el tipo de soporte.
La fase mvil puede ser un gas o un lquido, y la estacionaria u lquido o un slido.
Se pueden establecer cuatro tipos de cromatografia: gas-lquido, lquido-lquido,
gas-slido, lquido-slido.
Los mecanismos por los que los diferentes componentes son separados en los
procesos cromatograficos son variados. En algunos casos participan ms de un
mecanismo en un mismo proceso de separacin por lo que dificulta la

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clasificacin. Los principales mecanismos que intervienen en la separacin
cromatografica son:
Adsorcin: Gases o lquidos contenidos en la fase mvil son retenidos por una
adsorcin selectiva en la superficie del slido que constituye la fase estacionaria.
En la interfase slido-fase mvil hay un aumento de concentracin respecto a la
inicial. Este mecanismo controla la cromatografia gas-slido y lquido-slido.
Reparto: Los componentes de la fase mvil son retenidos por la fase estacionaria
liquida en funcin de su solubilidad en ella. Si las dos son liquidas se tiene un
proceso de extraccin en continuo.
Intercambio Ionico: La fase estacionaria constituida por un slido intercambiando
iones con iones contenidos en la fase mvil, liquida. El intercambio de iones
slido-solucin esta regulado por la afinidad quimica de los iones con ambas fases
y por sus respectivas concentraciones.
Tamao Molecular: Especies neutras de alto peso molecular pueden ser
separadas en virtud de su tamao donde la fase estacionaria es un gel hidrofilico
altamente poroso que retiene las molculas de menor tamao al de los poros. Las
molculas de mayor tamao son retardadas en su paso por pequeas fuerzas de
adsorcin de la superfie externa del gel que luego son excluidas de la fase
estacionaria.
Migracin Elctrica: Los componentes inicos de una muestra son separados por
su diferente velocidad y sentido con que se desplazan en un campo elctrico. La
fase estacionaria puede ser un papel saturado por un electrolito. La aplicacin de
un campo provoca un movimiento diferencial de los iones dependiendo de su
carga y de su movilidad ionica.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Qu es la cromatografia en papel?

La cromatografia en papel es la tcnica de separacin e identificacin de

sustancias qumicas mediante un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de
papel de filtro.
Se toma una pieza de papel de filtro y cerca de uno de sus extremos se deposita
una gota de la solucin que contiene la mezcla de las sustancias que se quieren
separas. Se deja secar la gota y quedara la mancha de las sustancias mezcladas.
El extremo del papel mas proximo a la mancha se introduce en un disolvente
apropiado, pero sin que la mancha llegue a introducirse en l.
Existen muchos tipos de cromatografia sobre papel, una primera divisin de las
variadas clases podra ser:
1- Cromatografia ascendente: el disolvente se encuentra en el fondo del
recipiente que sostiene al papel y va subiendo a traves de el por capilaridad.
2- Cromatografia descendente: el disolvente esta en un recipiente esta en un
recipiente del que cuelga el papel, fluye por l hacia abajo por una combinacion
de capilaridad y gravedad.

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En ambos casos el disolvente avanza a lo largo del papel pasando por encima de
la mancha, al avanzar disuelve y arrastra las sustancias de la mancha, cada una
de ellas se mueve, por lo general a distinta velocidad que las otras.
Se deja actuar el disolvente un tiempo determinado, se seca el papel y se
observan las sustancias separadas si tienen color, o en caso de no tener color se
procede al revelado por una reaccin quimica apropiada.
Esta tcnica se conoce como cromatografa monodimencional y el papel resultante
recibe el nombre de cromatograma monodimencional.

La resultante de las fuerzas:

Cuando el disolvente avanza sobre las manchas de las sustancias, comienzan a
actuar dos tipos de fuerzas opuestas: unas que arrastran y otras que retardan.
Las fuerzas propulsoras actan apartando las sustancias de su punto de origen y
desplasandolas en direccin del flujo de origen.
Las fuerzas retardantes tratan de impedir el movimiento de las sustancias,
llevndolas fuera del disolvente que fluye y hacia atrs en el papel.
La distancia recorrida por cada sustancia a partir del origen, en un tiempo dado, es
la resultante de estas dos clases de fuerzas.

Fuerzas propulsoras:
Cuando se realiza un cromatograma en papel, las fuerzas propulsoras ms
importantes son: el flujo de disolvente y la solubilidad de cada sustancia en le
disolvente.
Flujo del disolvente:

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 Si la sustancia cromatografiada fuera completa e instantneamente soluble
en el disolvente que avanza, por ejemplo agua y azcar, y no actuaran fuerzas de
retardo la sustancia ascender desde el origen hasta donde llega el diluyente. En
cambio si la sustancia fuera completamente insoluble en el disolvente en
movimiento no se movera del origen.
La corriente del disolvente es la misma para todas las sustancias de la mancha,
as pues, si el disolvente fuese capaz de disolver instantnea y completamente
todas las sustancias, estas avanzaran juntas hasta el final de la trayectoria del
disolvente y terminaramos donde empezamos con todas las sustancias juntas.
Solubilidad:
Una fuerza diferencial es, en efecto, la solubilidad. Pocas son las sustancias
que ofrecen la misma solubilidad en cualquier disolvente. La particular solubilidad
de una sustancia en la corriente del disolvente es una fuerza propulsora que
tiende a desplazarla, manteniendola en movimiento a lo largo del papel.

Fuerzas retardantes:
Hay tambin dos fuerzas retardantes principales: la adsorcin y el reparto.
Adsorcin:
La celulosa de la que esta hecho el papel de filtro, posee propiedades
adsorbentes. Las sustancias depositadas en el papel, en cromatografa, pueden
ser ms o menos adsorbidas en el papel.
La adsorcin es otra de las fuerzas diferenciales, esto significa que unas
sustancias son adsorbidas ms que otras y, por consiguiente, la liberacin de las
sustancias de las manchas variar de una sustancia a otra. Esto contribuye de
nuevo a la separacin. Mientras que se va realizando el cromatograma, las
sustancias mas fuertemente adsorvidas se van quedando atrs, mientras que las
adsorvidas con menos fuerza avanzan hacia el frente.
Reparto:
La cormatografia se basa, en una medida considerable, en la presencia de dos
fases liquidas individualizadas. Una de ellas es la corriente del disolvente
circulando por el papel de filtro. La otra es la fase acuosa contenida en el mismo
papel de filtro. Una hoja de papel de filtro aparentemente seca contiene entre un 6
y 12% de agua firmemente adherida a la celulosa. Aqu es donde entra en funcin
el reparto.
Cuando una sustancia que es soluble en dos disolventes no mezclados es
expuesta al mismo tiempo a ambos, se repartir entre ellos. La cantidad que se
encuentre en cada disolvente depender de la relativa solubilidad del soluto en
cada uno. El grado de reparto, una vez conseguido el equilibrio, se llama
coeficiente de reparto o razon de distribucin.

Constante Rf:
El ltimo punto alcanzado por el disolvente en su avance se denomina frente del
disolvente. Puede usarse como punto de referencia para expresar las distancias
relativas recorridas por las diferentes sustancias en un cromatograma. El smbolo
utilizado para designar esta distancia relativa es Rf y se define mediante:

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 distancia recorrida por el compuesto desde el origen
Rf =
Distancia del origen al frente del disolvente

Como el denominador es siempre mayor que el numerador en Rf debera ser un

decimal. Por razones de conveniencia se suele expresar como un porcentaje.
Asi un Rf de 50 indicara que el compuesto avanzo la mitad de la distancia del
frente del disolvente.

Cromatografa de adsorcin en columna

La fase estacionaria est constituida por un slido que se empaqueta en una

columna, normalmente de vidrio.
Los componentes a separar se aaden en forma soluble por la parte superior
de la columna, quedando retenidos en la misma. Posteriormente los componentes
se desplazan arrastrados por una fase mvil lquida. Dependiendo de la absorcin
selectiva de cada uno de ellos por la fase estacionaria se desplazan a distinta
velocidad, efectundose la separacin.
Para que haya una separacin efectiva de los componentes, su velocidad a
travs de la columna debe ser suficientemente diferente y la longitud de la
columna, adecuada.
Por ejemplo, si por una columna con almina como absorbente se introduce
una disolucin conteniendo nitratos de Fe (III), Cu (II) y Co (II) y posteriormente se
pasa agua ligeramente acidulada con cido ntrico se observa la separacin de
tres zonas diferenciadas (de arriba abajo) pardo- rojiza de Fe (III), azul de Cu (II) y
rosa de Co (II). Si se desean apreciar mejor las distintas bandas se puede
introducir una solucin de ferrocianuro potsico como revelador. Se observan
entonces coloraciones ms intensas; azul oscuro de Fe4 [Fe (CN)6]3, pardo- rojiza
de Cu2 [Fe (CN) 6] y verdosa de Co2 [Fe (CN) 6].

a) Anlisis frontal.- Supongamos una disolucin conteniendo tres componentes

A, B y C, que se introduce continuamente en una columna en la que la adsorcin
sigue el orden C, B, A. La especie menos adsorbida, A, emerge la primera por la
parte inferior de la columna, y sigue saliendo indefinidamente. Despus de un
perodo en que slo sale A, comienza a salir tambin B, obteniendo una mezcla A
+ B. Finalmente sale el componente ms retenido C, junto con A y B.

b) Anlisis por desplazamiento.- La mezcla a ser separada se absorbe en una

pequea zona en la parte superior de la columna. Posteriormente se introduce un
disolvente (o una disolucin) que sea ms fuertemente absorbido que cualquiera
de los componentes. El efecto resultante es que los componentes son
desplazados de la columna por el disolvente- desplazante y, adems, cada uno de
ellos desplaza al inmediatamente menos absorbido.
A la salida de la columna van saliendo consecutivamente todos los
componentes y el desplazador, separados pero uno junto al siguiente.

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 c) Anlisis por elucin.- Despus de fijar los componentes en la parte superior
se pasa un disolvente puro que no se adsorbe. Los componentes van avanzando
por la columna dependiendo de la fuerza con que son adsorbidos; cada uno de los
cuales es distribuido en una pequea zona. Si la columna es suficientemente larga
y los valores de Rf difieren bastante, se puede lograr la separacin de mezclas
bastante complejas. En la Fig. VIII-12 se muestra un cromatograma desarrollado
por este mtodo. Cada componente puede ser recogido y analizado a la salida de
la columna.

Adsorbente y eluyentes

Son muchos los slidos que se han utilizado como fase estacionaria en
cromatografa de adsorcin. Los ms importantes son almina, silicato de
aluminio, silicagel, xido, silicato y carbonato de magnesio, xido, carbonato y
fosfato de calcio, como inorgnicos; y carbn, almidn y azcares como orgnicos.
Normalmente deben ser sometidos a un proceso trmico de activacin superficial
antes de su utilizacin.
Como eluyentes se utilizan agua, alcoholes, cetonas, steres, cloroformo,
tetracloruro de carbono, etc. Su capacidad de elucin depende de su polaridad,
del absorbente y de las especies a eluir.

Cromatografa de reparto en columna

Esta tcnica es semejante a la mencionada anteriormente en cuanto a

materiales utilizados, mtodos operativos, etc. La diferencia reside en la fase
estacionaria utilizada y, en consecuencia, en el mecanismo de separacin.
En cromatografa de reparto la fase estacionaria es un lquido, poco miscible
con la fase mvil. Los solutos se distribuyen entre las dos fases dependiendo de
su solubilidad en cada una de ellas, es decir, segn su coeficiente de reparto.
Aunque el mecanismo fundamental de la separacin es la extraccin o reparto,
es prcticamente imposible evitar adsorciones por parte del slido soporte, por lo
que muchas de las separaciones son empricas, no pudiendo realizarse un exacto
tratamiento terico.
Los slidos soportes ms utilizados son el silicagel, el polvo de celulosa y la
tierra de diatomeas; menos aplicacin tienen el almidn y el relleno de bolas de
vidrio.

Cromatografa sobre geles porosos

Es un tipo de cromatografa que se aplica, fundamentalmente, a la separacin

de productos macromoleculares sobre geles hinchables por agua o por cualquier
otro lquido previamente escogido.
El fundamento de este tipo de cromatografa consiste en que al hincharse el
gel queda una cadena muy abierta con grupos terminales generalmente polares
que son capaces de adsorber agua u otros disolventes polares. Segn el nmero
de ligaduras entre las grandes cadenas existe un tamao crtico (lmite de
exclusin) de molcula que puede entrar en el interior del gel, mientras que las

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molculas de mayor tamao pasarn a travs del mismo, con lo que, en principio,
se origina una separacin de molculas de acuerdo con su diferente tamao.
El fenmeno puede considerarse como una filtracin a travs de un tamiz
molecular y por eso a esta tcnica se la llama tambin cromatografa con tamiz
molecular (ctm); as mismo se la ha denominado, Penetracin sobre gel,
exclusin molecular y tamizado molecular.

Cromatografa de capa fina

La llamada capa fina consiste en una placa de vidrio, rectangular o cuadrada,

denominadas cromatoplacas, o simplemente placas sobre cuya superficie se
deposita una capa uniforme muy delgada (en ocasiones de algunas micras de
espesor) de una substancia absorvente, casi siempre silicagel o almina, en
condiciones tales que resulte uniformemente extendida y suficientemente
adherida. En general, de hace una papilla acuosa con el adsorbente, que se
deposita sobre la placa mediante un aplicador adecuado. Las placas se secan en
estufa para activar la superficie del adsorbente y se encuentran aptas para
efectuar la cromatografa.
A las ventajas de resistencia a la temperatura y a los reactivos agresivos de la
cromatografa en capa fina, hay que aadir una mayor nitidez y sensibilidad de los
cromatogramas, as como una mayor rapidez en su desarrollo. Adems, los
cromatogramas obtenidos pueden conservarse indefinidamente y archivarse si se
pulveriza la placa revelada con una dispersin de un plstico transparente y
especial donde quede grabado el cromatograma sobre la pelcula endurecida del
plstico, que se separa fcilmente del soporte.
Las aplicaciones son semejantes a las de la cromatografa de papel.

Electroforesis

El fundamento de la tcnica consiste en depositar sobre un medio poroso una

mezcla de especies cargadas (algunas pueden ser neutras). Por aplicacin de un
campo elctrico entre los extremos del soporte poroso las especies se separan en
funcin de su carga y su movilidad inica en ese medio. Para favorecer el paso de
la corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos), que son
generalmente disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el
soporte poroso, debidamente escogidas para que no formen precipitados con las
especies del problema.
Como soportes se han utilizado almina, lana de vidrio, almidn, agar- agar,
gel de silice, etc. tanto en columna como en capa fina, pero quizs el mtodo ms
utilizado es el que emplea como soporte papel. Se suelen utilizar tiras de acetato
de celulosa, casi transparentes, que por poseer una estructura ms uniforme y un
poro menor que el del papel filtro, tienen un mayor poder de resolucin. A estas
ventajas del acetato de celulosa se aade su fcil solubilidad en cidos, lo que
facilita la posterior determinacin de las especies separadas.
La emigracin de las distintas especies en el papel depende de la magnitud y
signo de su carga, del tamao de la partcula, de las propiedades adsorbentes del

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soporte (que deben atenuarse en lo posible), del voltaje aplicado y de la intensidad
de corriente.

CROMATOGRAFIA DE GASES

Esta tcnica es similar a la cromatografia de columna, con la diferencia de que el

sistema es cerrado y la fase mvil es un gas. La separacin de los componentes
gaseosos se produce por adsorcin selectiva sobre un slido (C.G.S.) o por
reparto entre un gas inerte y un lquido no voltil que constituye la fase
estacionaria (C.G.L.). En la actualidad esta tecnica (C.G.L.) es la ms empleada,
aplicandose el analisis de gases o de lquidos y slidos que puedan volatilizarse a
temperatura no superior a 400C.
L C.G.S. es anloga a la C.L.S.
Los componentes del gas problema son sostenidos selectivamente por un slido
absorbente dispuestos en columna metlica, recta o en espiral. El gas problema
es inyectado en la corriente de un gas inerte que le conduce hasta la columna y
que hace la fase mvil. En la distribucin de los componentes del problema entre
el gas portador y el slido absorvervente se verifica una separacin por lo que
emergen de la columna a distintos tiempos pasando finalmente por un detector
que los identifica y cuantifica.
En la C.G.L. la fase estacionaria es un lquido no voltil absorbido en un soporte
slido que rellena la columna. Los componentes del gas problema son
desplazados selectivamente, como en la cromatografia de reparto, por el gas
portador que fluye de manera continua.
Los componentes de la muestra se separan de acuerdo con sus coeficientes de
reparto entre las dos fases.

INSTRUMENTACION

Esta cromatografia es tan sencilla como las dems, necesita un montaje

instrumental ms complejo debido al trabajo con gases, lo que obliga a trabajar en
sistema cerrado y a controlar caudales, presin y temperatura.

FASES MOVILES: como gases inertes portadores se utilizan H, He, N y aire. La

eleccin del gas portador depende del sistema en estudio y sobre todo del
detector que se utilice.

FASE ESTACIONARIA: en C.G.S. los absorbentes mas utilizado son carbn,

alumina, silicagel y tamises moleculares. En el C.G.L. es necesario un slido
soporte adsorvente y un lquido no voltil, el slido soporte mas utilizado es la
tierra diatomeas. Los lquidos que constituyen la fase mvil son muchos, depende
de la mezcla a separar y de la temperatura de operacin (esteres, polioles, aceite
de silicona, etc.).

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DETECTORES: son muchos tipos de detectores, estos actan siempre por
comparacin de alguna propiedad fsica o quimica (densidad, calor de combustin,
etc.) del gas portador solo (antes de la introduccin de la muestra) y de la mezcla
de gas portados y componentes de problemas. Los detectores se diferencian
principalmente por su selectividad y sensibilidad, por destruir o no la muestra y por
ser integrales o diferenciales, los primeros miden continuamente la muestra
acumulada desde el principio del analisis y los segundos miden concentraciones
instantneas. Se utilizan ms los detectores diferenciales.

EVALUACION DE LOS CROMATOGRAMAS

Los distintos componentes de la muestra emergen de la columna a tiempos

diferentes dependiendo de su retencin en la misma, definido como volumen de
retencin el volumen de mezcla gaseosa que emerge de la columna entre la
introduccin de la muestra y la aparicin de un componente. Se calcula a partir
del tiempo transcurrido y de flujo gaseoso.

V r = tr F

El volumen de retencin, asi como el tiempo de retencin (para un flujo constante)

son variables cualitativas que permiten la identificacin de especies. Normalmente
se utilizan los valores respecto al mximo del aire (V'r) o valores relativos frente a
una especie patron. Estas variables cualitativas solo son constantes cuando se
producen exactamente las condiciones, por lo que no son muy utilizadas para
identificaciones directas. Utilizando muestra patrones, la cromatografia de gases
constituye el mtodo rpido y excelente para confirmar la presencia concreta en
una muestra. Adicionando un patrn al problema, no deben aparecer nuevos picos
en el cromatograma y deber observar el rea que constituye la muestra patrn.
La evaluacin cuantitativa se basa en que, en determinadas condiciones, el rea
del pico (detector diferencial) y la altura del escaln (detector integral) son
proporciones a la concentraciones de especies.

APLICACIONES

La cromatografia de gases constituye el mejor mtodo analtico ideado para la

separacin de gases, lquido o slidos que pueden pasar fcilmente al estado de
vapor o transformndolos previamente en otros estados voltiles Ej. metilacin de
cidos grasos en el analisis de aceite y a resuelto problemas de muy difcil
solucin para la quimica analtica empleada hace una dcada. Por eso su
utilizacin es indispensable en analisis industriales, forenses bromatologicos,
toxicologicos, clnicos y de contaminacin ambiental.

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIN

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En las cromatografas clsicas, en las que la fase mvil es un lquido que fluye a
traves de un slido por el efecto de la gravedad para alcanzar alta resolucin seria
necesario emplear columnas excesivamente largas, lo que se traducira en un
desarrollo muy lento de los cromatogramas.
Estos inconvenientes se han resuelto con la cromatografia de alta resolucin, en la
que se trabaja con pequeas columnas, muy empaquetadas y forzando el paso de
la fase mvil mediante elevadas presiones, con lo que se consiguen separaciones
muy efectivas en un plazo muy corto de tiempo.
Dependiendo de la fase estacionaria, el mecanismo de separacin puede ser
reparto, adsorcin, tamao molecular (geles) e incluso cambio ionico, aunque los
mtodos mas utilizados estn basados en reparto y adsorcin.
El esquema fundamental de un cromatografo de alta resolucin esta constituido
por un deposito y un dispositivo de bombeo de la fase mvil que opera a elevada
presin (hasta 500 atm.), un sistema de inyeccin de la muestra, columnas
resistentes, generalmente e acero inoxidable, rellenas de fase estacionaria, un
detector y un sistema de registro grfico. La columna y los detectores van
introducidos en termostatos.
Los detectores ms utilizados en esta tcnica estn basados en absorciometria
UV y en medida de ndices de refraccin, siendo los cromatogramas obtenidos
semejantes a los de cromatografia gaseosa con detector diferencial.

APLICACIONES

1. Concentracin de trazas
2. Separacin de iones interferentes en analisis clsico
3. Separaciones de iones de caractersticas similares
4. Desmineralizacin del agua
5. Preparacin de disoluciones patrn
6. Disolucin de sustancias insolubles.

CLASIFICACION DE LAS CROMATOGRAFIAS

CROMATOGRAFIA EN COLUMNA ABIERTA
Nombre de la Fase estacionaria Fase mvil Desplazamiento Mecanismo de
Tcnica fase mvil separacin
C. slido-lquido Sol. absorbente Lquido Gravedad Adsorcin
C. lquido-slido Liq. Absorbido en Lquido Gravedad Reparto,
soporte sol. Adsorcin
C. sobre geles Sol. Gel poroso Lquido Gravedad Tamao

Electroferesis Sol. polmero Liq. ionico Emigracin inica Emigracin inica

C. intercambio Sol. Cambiador Lquido Gravedad Afinidad quimica

ionico ionico

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CROMATOGRAFIA EN COLUMNA CERRADA

C. de gases Sol. Absorbente Gas Presin Adsorcin

Liq. Absorbido en
soporte sol.
C. liquida de alta Sol. Diversos y Liq. Presin Adsorcin,
resolucin liq. Absorbidos reparto, afinidad
en soporte sol. quimica, tamao

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

C. adsorcin en Slido (papel) Lquido polar Capilaridad Adsorcin

papel (gravedad)
C. de reparto en Liq. Polar Lquido no polar Capilaridad Reparto
papel absorbido en (gravedad) (adsorcin, af.
papel slido Quimica)
C. cambio inica Slido Lquido Capilaridad Afinidad quimica
en papel (gravedad)
Electroferesis en Slido (papel) Lquido inico Emigracin Emigracin
papel inica inica

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