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UNIVERSIDAD CATLICA DE LA SANTSIMA CONCEPCIN

FACULTAD DE CIENCIAS. QUIMICA AMBIENTAL

[TTULO DEL
DOCUMENTO]
HABILITACION PROFESIONAL QUA - 1000

Autor: xxxxxxxxxxxxx
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Introduccin

El petrleo es una sustancia que hoy en da se considera como una de las

materias primas ms importantes por las cuales se negocian. Es la fuente de
energa ms importante en la actualidad. Su origen es mediante la
descomposicin de materia orgnica.

El petrleo es una sustancia compuesta por hidrogeno y carbono (hidrocarburo),

est se puede hallar en estado lquido o gaseoso. En estado lquido se conoce
como crudo y en estado gaseoso como gas natural.

Como se mencion anteriormente el petrleo se origina de materia orgnica, la

cual es formada principalmente por detrito de organismos vivos acuticos,
vegetales y animales que vivan en los mares, desembocaduras de los ros o
lagunas cercanas al mar. La materia orgnica se deposita y se va cubriendo por
sedimentos a medida que queda a mayor profundidad se transforman en
hidrocarburos, mediante la degradacin que es producida por bacterias aerobias
en primera instancia y luego por bacterias anaerobias.

Del petrleo se obtienen distintos derivados como: gasolina, kerosene, bencina,

gas propano, disolventes, parafinas, entre otros, los cuales proporcionan una
funcin importante dentro del desarrollo de las industrias como tambin de nuestra
vida cotidiana. Pero as mismo como proporcionan una funcin importante para el
desarrollo de las industrias, paralelamente esta sustancia puede causar diferentes
impactos ambientales sobre el medio ambiente, un ejemplo claro de lo
mencionado es lo que se estudiar en este proyecto de investigacin, el cual a
travs del anlisis de un suelo contaminado con petrleo, extrado en las
cercanas de una industria, se pretende, mediante la biorremediacin volver a su
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condicin natural el suelo contaminado con petrleo, mediante la aislacin de una

bacteria que cumpla con los requerimientos necesarios para llevar a cabo este
proceso.

I. Hiptesis y objetivos

Hiptesis:

Objetivo general:
Evaluar muestras de suelo contaminado con Hidrocarburos mediante ensayos de
toxicidad.

Objetivos especficos:
1. Determinar muestras de suelo contaminado con hidrocarburos las
caractersticas fsico-qumicos.
2. Evaluar ecotoxicolgicamente suelos contaminados con hidrocarburos a
travs de Dafna Magda, E. Foetida, Selenastrum capricornutum y
3. Determinacin y cuantificacin de Hidrocarburos totales en muestras de
suelo mediante cromatografa gaseosa.
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II. Metodologa

II.1: Anlisis fsico-qumicos:

a. Humedad (Nch1515 of.79):

Para el anlisis de la humedad en el suelo, se debern seguir los siguientes pasos
indicados segn la norma chilena:

- Se determinar y registrar la masa de un recipiente limpio y seco con su

tapa (m r).

- Se colocar la muestra de ensayo en el recipiente cerrando inmediatamente

la tapa. Determinar y registrar la masa del recipiente ms la muestra hmeda (m
h).

- Se retirar la tapa, colocando el recipiente con la muestra en la estufa a 110

5C y secar a masa constante.

- Sacar el recipiente con la muestra de la estufa, colocar nuevamente la tapa

y dejar enfriar a temperatura ambiente. Determinar y registrar la masa del
recipiente ms la muestra seca (m s).

Se calcular la humedad como la prdida de masa de la muestra de acuerdo con

la siguiente frmula, aproximando a 0,1 %:

Dnde:

w : humedad (%).

m h : masa del recipiente ms la muestra hmeda (grs).

m s: masa del recipiente ms la muestra seca (grs).

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m r : masa del recipiente (grs).

b. ph:
Para la determinacin del pH se utilizar el mtodo potenciomtrico (willard et
al.,1974; Bates, 1983), el cual se lleva a cabo mediante el siguiente procedimiento:

- Pesar 1 g de suelo y colocarlo en un vaso precipitado de 25 mL.

- Agregar 10 ml de agua destilada.
- Agitar y dejar reposar 10 minutos.
- Ajustar el potencimetro con las soluciones amortiguadoras.
- Pasados los 10 minutos, medir el pH con el potencimetro.

Los Criterios de evaluacin que se utilizarn son los descritos en la tabla N1:

Categora Valor de pH
Fuertemente cido < 5.0
Moderadamente cido 5.1 6.5
Neutro 6.6 7.3
Medianamente alcalino 7.4 8.5
Fuertemente alcalino 8.5
Tabla N1: Criterios de evaluacin (NOM-021-REC-NAT-2000)

c. Conductividad Elctrica:

El mtodo de la conductividad elctrica se realizar por medio de un

conductmetro sobre una muestra de extracto de suelo.
Para llevar a cabo este mtodo se deben desarrollar algunos procedimientos que
son necesarios para obtener la conductividad elctrica de la muestra de suelo:

- Preparacin de la pasta de saturacin:

1) Pesar 40 g de suelo seco y colocarlo en un recipiente de plstico, si el suelo es

arenoso o areno-migajoso pesar 600 g.
2) Agregar agua destilada con la bureta y mezclar con la esptula hasta
saturacin.
3) Golpear el recipiente con cuidado sobre la mesa de trabajo para asentar el
suelo.
4) La pasta estar lista cuando se observe un brillo en su superficie (formacin de
un espejo), esto no sucede en el caso de suelos con alto contenido de arcilla.
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5) Anotar el volumen de agua gastado (ml).

6) Dejar reposar la pasta durante una hora y comprobar a criterio su saturacin.

7) Tapar el recipiente y dejarlo reposar por tres horas, excepto suelos arcillosos
que deben dejarse reposar 24 horas.

- Obtencin del extracto del suelo:

1) Colocar papel filtro sobre el embudo, humedecerlo con agua destilada, dejando
drenar el exceso. Conectar el sistema de filtracin al vaco.

2) Mezclar nuevamente la pasta y colocarla en el embudo y aplicar vaco.

3) Obtener un extracto de aproximadamente 50 mL.

- Determinacin de la conductividad elctrica:

1) Calibrar el conductmetro con un solucin estndar: KCl 0,1 N y 0,01 N, con cada una se ajusta el
equipo segn lo indicado en la siguiente tabla:

Solucin estndar de KCl Conductividad elctrica a 25C

0,1 N 12,9 dS/m
0,01 N 1,412 dS/m
Tabla N2: Datos para la calibracin del conductmetro.

2) Leer la conductividad elctrica y la temperatura del extracto.

3) Para convertir la conductividad elctrica en unidades de salinidad, se toma el

valor de referencia de una solucin de NaCL 0,05 N con una conductancia de 604
mhos/ cm a 25C como el factor, que al multiplicarlo por la conductividad expresa
la salinidad:
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Salinidad = mhos/cm X 604

4) Criterios para evaluar la salinidad de un suelo, con base en su conductividad:

Categora del suelo Valor (mmhos/cm o dS/m )

No salino 0 2.0
Poco salino 2.1 4.0
Moderadamente salino 4.1 8.0
Muy salino 8.1 16.0
Extremadamente salino >16.0
Tabla N3: Criterios de evaluacin para la salinidad del suelo.

d. Materia orgnica:
Para el anlisis de la materia orgnica que se encontrar presente en el suelo, se
debern llevar a cabo los siguientes pasos:

1) Pesar suelo seco (0.1 a 0.3g) dentro de una cpsula de porcelana.

2) Encender el analizador de carbono y esperar a que la temperatura del horno

llegue a 900C. Una vez que el equipo est estabilizado a esta temperatura, se
procede a analizar las muestras.

3) El mtodo utilizado para hacer los anlisis en este equipo debe indicar que se
est utilizando el accesorio para muestras slidas; y en caso de contar con un
software para la integracin de los datos se debe incluir la curva patrn, para que
el resultado de la medicin se proporcione con base en sta.

4) Colocar la muestra dentro de la cmara de slidos y proceder a la medicin.

5) El tiempo de corrida de cada muestra es aproximadamente de cinco minutos. Al

final el software presenta la cantidad de carbono (mg kg-1suelo o en porcentaje)
contenido en el suelo.

6) El resultado debe ser ajustado por la humedad de la muestra, para indicarlo en

mg de C/kg suelo completamente seco.
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7) Interpretacin del contenido de materia orgnica en el suelo:

Clase Suelos volcnicos Suelos no volcnicos

Muy bajo <4.0 <0.5
Bajo 4.1 6.0 0.6 1.5
Medio 6.1 10.9 1.6 3.5
Alto 11.0 16.0 3.6 6.0
Muy alto >16.1 >6.0
Tabla N4: Clasificacin segn el Porcentaje de materia orgnica.

II.2: Ensayos de Toxicidad:

a. Selenastrum Capricornutum:
Para llevar a cabo este ensayo de toxicidad ser necesario llevar a cabo los
siguientes pasos:

- Preparacin de Inculo algal:

Se realizar un cultivo de S.capricornutum de 4 a 7 das en desarrollo de fase

exponencial, para luego realizarle un conteo del nmero de clulas por
microscopa ptica con cmara Neubauerl. Posteriormente esta dilucin del cultivo
se le adicionar 18 mL de medio nutritivo enriquecido para que de esta manera se
obtenga un inculo con 2.6 x 10 5 clulas.

-Mtodo de dilucin de muestras:

En esta etapa se realizar un control, donde se distribuirn 2.5 mL de solucin

amortiguadora de pruebas en 5 frascos respectivamente (15 mg NaHCO 3/L), estas
se realizan en replicas (3 series con 5 frascos respectivamente) como se muestra
en la Figura N1.
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Figura N1: Mtodo de dilucin de muestra.

-Obtencin de resultados:

Una vez terminada la preparacin de las muestras se realizar el Bioensayo (No.

De clulas/ mL inicial; pH inicial) para que posteriormente se registren los datos
del No. De clulas/mL diaria (72 h) a un pH final, de esta manera se podr calcular
la biomasa (% de inhibicin), por medio de un anlisis estadstico (Probit), donde
se obtendr la CI 50 96 horas.

b.Daphinia magna:
Para el desarrollo de esta prueba de toxicidad se emplearn neonatos (<24 horas
de nacido), donde sern expuestos a diferentes concentraciones de la muestra o
agente txico durante un periodo de 48 horas. Mediante esta prueba de toxicidad
se podr determinar la concentracin de la muestra problema que produce la
muerte al 50% de la poblacin de neonatos expuestos (CL 50) con un nivel de
confiabilidad del 95%, al mismo tiempo se podr determinar la concentracin
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mnima (se observa efecto de mortalidad, LOEC) y as tambin la que no producir

la muerte de neonatos (NOEC).

La figura N2 nos muestra de forma ms clara el procedimiento que se llevar a

cabo para la preparacin de la prueba de toxicidad, el cual consiste en la
realizacin de un control positivo y uno negativo ambos en triplicado. En el control
negativo se utilizar agua dura reconstituida sin suplementos y en el control
positivo una solucin del compuesto toxico de referencia (Cr VI) preparada a partir
de dicromato de potasio.

El control negativo se emplear para verificar el adecuado estado de salud de los

organismos, de manera que se esperar que al final del experimento se obtenga
una sobrevivencia mayor al 90%. El control positivo se utilizar para valorar la
estabilidad de la sensibilidad de los organismos.

Tal como se muestra en la figura N2 una vez preparadas las soluciones se

transferirn 10 neonatos de menos de 24 horas de nacidos a cada una de las
soluciones. Una vez que se finaliza con la transferencia de los organismos se
colocarn bajo condiciones controladas de iluminacin y temperatura (10-20 E/
m2 /s y 20 2 C respectivamente) por un periodo de 48 horas.

Trascurrido el tiempo (48 horas) se registrar el nmero de organismos muertos.

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Figura N2: Preparacin de la prueba.

C.Eisenia Foetida:
Para llevar a cabo este ensayo de toxicidad se utilizar como material biolgico
celomocitos obtenidos de la lombriz de tierra E. Foetida con un peso entre 300 y
600 mg. El procedimiento que se llevar a cabo en esta prueba se dividir en
varias etapas:

-Obtencin de los celomocitos:

Las lombrices se lavarn con una solucin de NaCl al 4%, para luego colocarlas
sobre papel filtro humedecido con la misma solucin. Se le aplicarn masajes
suaves en los ltimos segmentos de la regin posterior del cuerpo para luego
colocarla en una caja Petri sobre un trozo de hielo, durante 2 minutos.

Se le aplicar una incisin superficial a nivel de la regin abdominal. El fluido

celmico se extraer por medio de una pipeta Pasteur y se colocar en tubos de
vidrio con 5 mL de solucin LBSS. Luego el fluido deber lavarse con solucin
LBSS, centrifugando a 200 rpm a 4C durante 10 minutos. Finalmente, el botn
celular se resuspender en 1 mL de solucin LBSS.
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-Cuenta celular y determinacin de la viabilidad:

La suspensin celular (0,1 mL) se mezclar en un tubo de ensayo con 0.02 mL de

azul de tripano al 0,4% y se agitar. Despus de 3 minutos de reposo se colocarn
20 L de la mezcla en la cmara Neubauer con un cubre objeto sobrepuesto. Se
contarn el nmero de clulas teidas de azul en el cuadrante del centro y en los
cuatro de las orillas. El nmero de clulas por mL se calcular multiplicando el
promedio de los cuadrantes por el factor de dilucin y por el volumen de la cmara
(104). La viabilidad se calcular mediante la siguiente formula:

-Ensayo de citotoxidad con rojo neutro:

En tubos de ensayo se prepararn las diluciones de la muestra en una serie

logartmica. En la cmara de flujo laminar se adicionarn 50 L de la suspensin
celular en cada uno de los tubos y se le agregarn 1 mL del medio de cultivo
RPMI1640. Todos los tubos se incubarn a 22C por 24 horas a 1 atmsfera de
CO2 al 5 %.

La mezcla de cada tubo se centrifugar a 2500 rpm por 5 minutos para la

eliminacin de los compuestos txicos. Las clulas se resuspendern en una
solucin amortiguadora de fosfatos y se vuelven a centrifugar. Nuevamente se
resuspender el botn celular en 1mL de solucin de colorante rojo neutro (50
g/mL). Posteriormente todos los tubos sern incubados por 3 horas en las
mismas condiciones que se describieron anteriormente.

El colorante se eliminar por centrifugacin a 2500 rpm durante 5 minutos y el

botn celular se resuspender rpidamente en una solucin amortiguadora de
fosfatos. A cada tubo se le agregarn 1.3 mL de solucin de cido actico al 1 % y
etanol al 50% y se dejarn reposar a temperatura ambiente por 15 minutos. La
absorbancia de las muestras se leern en un espectrofotmetro de luz visible a
540 nm.
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-Expresin de resultados:

Esta prueba de toxicidad determinar el potencial de toxicidad letal en el cultivo,

expresado como la concentracin letal media (CL 50). Se utilizar el mtodo Probit,
para evaluar la relacin dosis-respuesta del contaminante sobre el organismo en
trminos de CL50 y su precisin o intervalo de confianza.
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C. Carta Gantt
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C.I.Recursos Solicitados

D. Bibliografa.