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3-Fluorescencia Molecular PDF
3-Fluorescencia Molecular PDF
2.- Se desea analizar vitamina B1 en un preparado comercial de 2.000 g por el mtodo del tiocromo.
Se extrae con HCl y fosfatasa y se diluye a 100 mL. Se purifica una alcuota de 15 mL pasndola por
una columna cromatogrfica, y por causas inherentes al proceso se diluye a 25 mL. De la anterior
solucin, se forman dos porciones de 5 mL, una de ellas se trata con ferricianuro y ambas se aforan a
10 mL para examen fluorimtrico. Una solucin de referencia de 0.2 ppm de tiamina se somete al
mismo tratamiento que la muestra problema, con excepcin de que la porcin introducida en la
columna conserva su volumen original. Se toman dos alcuotas de 5 mL y una se oxida y ambas se
aforan a 10 mL. Se mide la fluorescencia de ambas muestras dando lugar a intensidades de
fluorescencia de 18 y 13 unidades de fluorescencia, respectivamente. Calcular los ppm de vitamina B1
en la muestra.
Solucin: 23 ppm
3.- La forma reducida del dinucletido de nicotinamida y adenina (NADH) es una coenzima
importante y muy fluorescente. Tiene un mximo de absorcin de 340 nm y un mximo de emisin a
465 nm. Las soluciones patrn de esta sustancia generan las siguientes intensidades de fluorescencia:
b) Determinar la pendiente y ordenada en el origen por mnimos cuadrados para la grfica del
apartado anterior.
c) Calcule la desviacin estndar de la pendiente y la que corresponde a la regresin de la curva.
d) Una solucin desconocida tiene una fluorescencia relativa de 12.16. Cul ser su concentracin
en NADH? Calcular la desviacin la desviacin estndar relativa del resultado obtenido, as como
la desviacin estndar relativa del resultado obtenido considerando que el valor de 12.16 es la
media de tres medidas.
-4
Solucin: b) Irel=22.35 cNADH + 3.6x10 ; c) sy/x=0.1747, sb=0.2696; d) c=0.544 M , DER=1.86 %; DER (con
replicados)=1.2 %
DEPARTAMENTO DE QUMICA ANALTICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTOS
5.- A cuatro alcuotas de 10,0 mL de una muestra de agua se adicionaron 0.00, 1.00, 2.00 y 3.00 mL
de una solucin estndar de NaF que contena 10.0 ppb de F- tal y como se muestra resumido en la
tabla. Se adicionaron a cada una 5.00 mL exactos de una solucin que contena un exceso de
complejo de Al con el rojo de Alizarina R, un complejo fuertemente fluorescente, y las disoluciones se
diluyeron a 50.0 mL. La intensidad de de fluorescencia de las cuatro disoluciones y de un blanco
fueron las siguientes:
(I0-I)
IF = K
Por otra parte, la Transmitancia se define como la relacin entre la Intensidad transmitida, I, y
la intensidad incidente I0, siendo la Absorbancia, A, el logaritmo decimal de la transmitancia
cambiado de signo:
I
T= I = I 0 *T
I0
A = bc = log T T = 10 A = 10 bc
Por tanto:
(I0-I010-bc) = K
IF = K I0(1-10-bc)
10-bc se puede aproximar, a concentraciones bajas a la serie de Taylor. Para ello es necesario
hacer un cambio de base:
10 = eln10 = e2.303, por tanto: 10-bc= (e2.303) -bc = e-2.303bc
x x2 x3 xn n xi i
f ( x ) = f ( 0) + f ' ( 0) + f ' ' ( 0) + f ' ' ' (0) + ... + f ( 0) = f ( 0)
1! 2! 3! n! i =0 i !
x 0 x 2 0 x3 0 xn 0 x 2 x3 xn
e = e + e + e + e + ... + e = 1 + x +
x 0
+ + ... +
1! 2! 3! n! 2! 3! n!
Entonces:
e-2.303bc 1-2.303bc
- Si la concentracin es 2.5x10-5 M:
2.303 * 0.1
% E = 100 * 0.1
1 = 11.95%
1 10
- Si la concentracin es 2.5x10-6 M:
bc = 4000*1*2.5x10-6 = 0.01 que est por debajo del umbral de 0.05 de absorbancia.
2.303 * 0.01
% E = 100 * 0.01
1 = 1.17%
1 10
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2.- Se desea analizar vitamina B1 en un preparado comercial de 2.000 g por el mtodo del tiocromo.
Se extrae con HCl y fosfatasa y se diluye a 100 mL. Se purifica una alcuota de 15 mL pasndola por
una columna cromatogrfica, y por causas inherentes al proceso se diluye a 25 mL. De la anterior
solucin, se forman dos porciones de 5 mL, una de ellas se trata con ferricianuro y ambas se aforan a
10 mL para examen fluorimtrico. Una solucin de referencia de 0.2 ppm de tiamina se somete al
mismo tratamiento que la muestra problema, con excepcin de que la porcin introducida en la
columna conserva su volumen original. Se toman dos alcuotas de 5 mL y una se oxida y ambas se
aforan a 10 mL. Se mide la fluorescencia de ambas muestras dando lugar a intensidades de
fluorescencia de 18 y 13 unidades de fluorescencia, respectivamente. Calcular los ppm de vitamina B1
en la muestra.
Solucin: 23 ppm
Como el tratamiento del patrn y de la muestra problema son idnticos, salvo la dilucin de
15 a 25 mL en la columna cromatogrfica, hacemos referencia a la concentracin de patrn de
0.2 ppm de tiamina, que da una fluorescencia de 13 unidades. Por tanto, 18 unidades de
fluorescencia se corresponden a una concentracin de tiamina de:
Esta concentracin debe ser corregida por la exclusiva dilucin cromatogrfica que sufre la
muestra problema. Luego la concentracin de tiamina en los 100 mL es:
ppm de tiamina en la muestra = 0.04615 (mg) / 2x10-3 Kg = 23.1 ppm (mg/Kg o g/g)
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3.- La forma reducida del dinucletido de nicotinamida y adenina (NADH) es una coenzima
importante y muy fluorescente. Tiene un mximo de absorcin de 340 nm y un mximo de emisin a
465 nm. Las soluciones patrn de esta sustancia generan las siguientes intensidades de fluorescencia:
b) Determinar la pendiente y ordenada en el origen por mnimos cuadrados para la grfica del
apartado anterior.
c) Calcule la desviacin estndar de la pendiente y la que corresponde a la regresin de la curva.
d) Una solucin desconocida tiene una fluorescencia relativa de 12.16. Cul ser su concentracin
en NADH? Calcular la desviacin la desviacin estndar relativa del resultado obtenido, as como
la desviacin estndar relativa del resultado obtenido considerando que el valor de 12.16 es la
media de tres medidas.
-4
Solucin: b) Irel=22.35 cNADH + 3.6x10 ; c) sy/x=0.1747, sb=0.2696; d) c=0.544 M , DER=1.86 %; DER (con
replicados)=1.2 %
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5.- A cuatro alcuotas de 10,0 mL de una muestra de agua se adicionaron 0.00, 1.00, 2.00 y 3.00 mL
de una solucin estndar de NaF que contena 10.0 ppb de F- tal y como se muestra resumido en la
tabla. Se adicionaron a cada una 5.00 mL exactos de una solucin que contena un exceso de
complejo de Al con el rojo de Alizarina R, un complejo fuertemente fluorescente, y las disoluciones se
diluyeron a 50.0 mL. La intensidad de de fluorescencia de las cuatro disoluciones y de un blanco
fueron las siguientes: