MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS

o
Reaccin del Biuret

o Mtodo de Lowry

o Mtodo de Bradford

o Absorcin en el ultravioleta
 El nombre de la reaccin procede del
compuesto coloreado formado por la
condensacin de dos molculas de urea
con eliminacin de amonaco.

Si una solucin fuertemente alcalina de

sulfato cprico (CuSO4) se aade a una
solucin de protena se forma una
complejo entre el ion cprico y los enlaces
peptdicos, con aparicin de una
coloracin violeta-prpura, que presenta
un mximo de absorcin a 540 nm.

Las caractersticas ms importantes de la

reaccin son:

La reaccin del Biuret se aplica, a partir de

los tetrapptidos, a todos los pptidos y
protenas.

Su rango de determinacin es de 1 a 6
mg/ml.

No depende de la composicin de
aminocidos.

Algunos compuestos (NH4+, Tris, etc.)

dan la reaccin.
 Para aumentar la sensibilidad de la
reaccin del biuret, el complejo protena-
Cu2+ se hace reaccionar con el reactivo
de Folin-Ciocalteus, dando una coloracin
azul, con un mximo de absorcin a 500
nm.
Esta coloracin se debe a la reduccin del
cido fosfomolbdico/fosfotngstico a azul
de heteropolimolibdeno, por medio de los
residuos tirosilos, triptofanilos, y en menor
grado, cisteinilos e histidilos de las
protenas que forman el complejo con el
Cu2+.
Las caractersticas del mtodo son:

La intensidad de la coloracin vara con la

composicin de aminocidos de la protena

La reduccin del reactivo fosfomolbdico y

fosfotngstico con la tirosina y triptofano
presentes en la protena

Es ms sensible que el ensayo del biuret.

El rango es de 0,1-1 mg/ml.

Presenta muchas interferencias.

 MTODO DE BRADFORD
Consiste en la formacin de un compuesto de
adsorcin de coloracin azul entre los residuos de
aminocidos bsicos de las protenas y el
colorante Azul Coomassie
Absorbe luz a 595 nm
El rango de determinacin de protena es de 1-10
g/ml (ensayo micro) y de 0,5 -1,4 mg/ml (ensayo
estndar)
La intensidad de absorcin depende del contenido
de aminocidos bsicos y aromticos.
 ABSORCIN EN EL ULTRAVIOLETA
Las protenas poseen una banda de
absorcin a 280 nm como consecuencia de
la absorcin de los residuos de tirosina y
triptofano en esta regin del espectro
Es un mtodo no destructivo
El rango de concentracin que se puede
determinar depende del contenido de los
aminocidos Tyr y Trp, y oscila entre 0,05 y
2 mg/ml
La presencia de sustancias absorbentes a
280 nm conduce a interferencias
 DETERMINACIN DE NITRGENO
PROTEICO POR KJELDAHL

Determina la materia nitrogenada total

La protena se calcula multiplicando el
Nitrgeno total (N) por un factor
emprico asumiendo que las protenas
tienen aproximadamente un 16% de N
y el resultado se expresa como
Protena (N x 6,25)
Clculos

% N = NHCl x Volumen de cido corregido x 14 g N x 100

g de muestra mol

% protena = % N x 6,25
 Equipo completo

Titulacin

Digestin

Destilacin