UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUIMICA Y BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

Laboratorio de Bioqumica-TUAQF

Extraccin y purificacin de cidos nucleicos

(2 sesiones)

Introduccin

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayora de los

estudios de biologa molecular y de todas las tcnicas de recombinacin de ADN. En este caso, los mtodos
de extraccin permiten obtener cidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para despus
realizar anlisis especficos tales como de modificaciones genticas, anlisis de genotipos, de paternidad,
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), etc. La calidad y la pureza de los cidos nucleicos son dos de los
elementos ms importantes en ese tipo de anlisis. Si se desea obtener cidos nucleicos muy purificados,
que no contengan contaminantes inhibidores, es preciso aplicar mtodos de extraccin adecuados.
Para extraer los cidos nucleicos del material biolgico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las
nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los restos de clulas. El procedimiento de lisis idneo
suele consistir en un equilibrio de tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material
inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico
diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecnica (trituracin, lisis
hipotnica, etc.), tratamiento qumico (detergentes, agentes caotrpicos, reduccin con tioles, etc.),
digestin enzimtica (Proteinasa K, etc.).
Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por
ejemplo, una misma solucin puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales
caotrpicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivacin de las
nucleasas, los restos de clulas se eliminan fcilmente por filtracin o precipitacin.
A menudo se efecta una extraccin con disolventes para eliminar los contaminantes de los cidos
nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una combinacin de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las
protenas. Para concentrar los cidos nucleicos suele realizarse una precipitacin con isopropanol o etanol,
si la cantidad de cido nucleico diana es escasa, este puede aadirse a la mezcla.

Mtodo de extraccin y purificacin con CTAB

El protocolo del mtodo del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por Murray y
Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado posteriormente, en 1987, por Wagner y sus
colaboradores (Wagner et al., 1987). El mtodo es adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y
alimentos derivados de vegetales y est especialmente indicado para eliminar los polisacridos y los
compuestos polifenlicos, que, de otro modo, alteraran la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este
procedimiento se ha aplicado con frecuencia en gentica molecular de los vegetales y ha sido probado en
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ensayos de validacin para detectar OGM (Lipp et al., 1999; 2001). Se han elaborado algunas variantes
adicionales para adaptar el mtodo a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin
transformar (Hupfer et al., 1998; Hotzel et al., 1999; Meyer et al., 1997; Poms et al., 2001).

Principios del mtodo del CTAB: lisis, extraccin y precipitacin

Las clulas vegetales pueden lisarse con el detergente inico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB),
que forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los
polisacridos, los compuestos fenlicos y los dems contaminantes permanecen en el sobrenadante y
pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentracin salina y se
precipita con etanol o isopropanol. En esta seccin se describirn los principios de las tres etapas
principales: la lisis de la membrana celular, la extraccin del ADN genmico y su precipitacin.

a. Lisis de la membrana celular: Tal como se ha mencionado anteriormente, la primera etapa de la extraccin
del ADN es la rotura de la membrana celular y nuclear, para lo cual la muestra homogeneizada se trata
primero con el tampn de extraccin, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB. Todas las membranas biolgicas
presentan la misma estructura general, integrada por molculas de lpidos y de protenas, unidas por
interacciones no covalentes.

La figura ilustra cmo se libera el ADN

genmico cuando el detergente captura los
lpidos y las protenas al entrar en contacto
la membrana celular y el tampn de
extraccin con CTAB. Con una concentracin
salina (NaCl) determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los cidos nucleicos. El EDTA es
un componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la
desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente
disminuye. El Tris-HCl confiere a la solucin la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior
daa el ADN). Es importante sealar que, como los cidos nucleicos se degradan fcilmente en esta fase de
la purificacin, debe reducirse al mnimo el tiempo transcurrido entre la homogeneizacin de la muestra y
la adicin de la solucin tampn con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la clula y de los
orgnulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el
ADN.

b. Extraccin: En esta etapa, se separan los complejos formados por los cidos nucleicos y el CTAB de los
polisacridos, los compuestos fenlicos, las protenas y los dems lisados celulares disueltos en la solucin
acuosa. Es especialmente importante eliminar los polisacridos y los compuestos fenlicos, pues pueden
inhibir numerosas reacciones enzimticas. En concentraciones hiposalinas (NaCl < 0,5 M), los
contaminantes de los complejos de cidos nucleicos no precipitan y pueden eliminarse extrayendo la
solucin acuosa con cloroformo. El cloroformo desnaturaliza las protenas y facilita la separacin de las
fases acuosa y orgnica. La fase acuosa suele constituir la fase superior. No obstante, si dicha fase es densa
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debido a la concentracin salina (> 0,5 M), formar la fase inferior. Adems, si el pH de la solucin acuosa
no se ha equilibrado debidamente (pH 7,8 8,0), los cidos nucleicos tendern a repartirse en la fase
orgnica. Si es preciso, la extraccin con cloroformo se realizar dos o tres veces, con objeto de eliminar
por completo las impurezas de la capa acuosa. Para perfeccionar la extraccin de los cidos nucleicos,
puede retroextraerse la fase orgnica con una solucin acuosa, que se aade a continuacin al extracto
anterior. Una vez purificados los complejos de cidos nucleicos, puede procederse a la precipitacin,
ltima etapa del procedimiento.

c. Precipitacin: En esta ltima etapa se separan los cidos nucleicos del detergente, para lo cual la solucin
acuosa se trata primero con una solucin de precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en
concentracin elevada (NaCl > 0,8 M). Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un
precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio en lugar de NaCl por su
capacidad tampn. En estas condiciones, el detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede
eliminarse por lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento con etanol al
70 % permite una mayor purificacin o elucin de los cidos nucleicos de la sal residual.

Cuantificacin del ADN mediante espectrofotometra

El ADN, el ARN, los oligonucletidos e incluso los mononucletidos pueden cuantificarse directamente
en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o densidad ptica, DO) de
luz ultravioleta (tambin puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene
cantidades significativas de contaminantes como protenas, fenol o agarosa, la medicin
espectrofotomtrica de la irradiacin ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. En este
mtodo, los tampones acuosos con escasa concentracin inica (por ejemplo, tampn TE) resultan
idneos. La concentracin de cidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con
un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un cociente. Dado que las
protenas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los cidos
nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una
absorcin a 230 nm significa que la muestra est contaminada con hidratos de carbono, pptidos, fenoles,
compuestos aromticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2
aproximadamente. Cuando la cantidad disponible de cidos nucleicos es escasa, puede emplearse el
mtodo de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad de cidos nucleicos a
partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el bromuro de etidio irradiado con luz UV,
comparndola con unos patrones de concentracin.

Medicin en una muestra desconocida: Para medir la concentracin, se utilizan cantidades determinadas
de solucin de ADN en funcin de la capacidad de la cubeta empleada (por ejemplo, 5 l de ADN diluidos
en 195 l de agua si la capacidad de la cubeta es inferior a 0,2 ml). Despus de calibrar el
espectrofotmetro y de aadir la solucin de cidos nucleicos, se tapa la cubeta, se mezcla la solucin y se
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mide la absorbancia. Con objeto de reducir los errores de pipeteado, debe efectuarse la medicin al menos
dos veces y siempre con 5 l de solucin de ADN, como mnimo. Se desaconsejan los valores de A260
inferiores a 0,02 o comprendidos entre 1 y 1,5 (segn el instrumental empleado) por el elevado margen de
error que entraan. La concentracin c de un cido nucleico determinado presente en una solucin se
calcula conforme a las ecuaciones siguientes:

ADN monocatenario: c(pmol/l) = A260/0,027

ADN bicatenario: c(pmol/l) = A260/0,020
ARN monocatenario: c(pmol/l) = A260/0,025
Oligonucletido: c(pmol/l) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG + 0,84NT

donde A260 es la absorbancia medida a 260 nm, un ejemplo de los valores de la absorbancia de ADN de
timo de ternera muy purificado, en suspensin en un tampn TNE 1x, considerando que el ADN de
referencia es ADN bicatenario, con una A260 = 1 a 50 g/ml, en una cubeta cuyo paso de luz es de 10 mm,
donde A260/A280 = 2,0 y A260 = 0,56, por lo tanto, 0,56*0,20 = 28 ug/ml.

Procedimiento:

1. Pesar 100 mg de muestra homognea en un tubo estril de 1,5 ml para microcentrfuga

2. Agregar 300 l de agua desionizada estril
3. Agregar 500 l de tampn a base de CTAB y mezclar
4. Agregar 20 l de proteinasa K (20 GM/ml), agitar e incubar a 65C durante 30-90 minutos
5. Agregar 20 l de ribonucleasa A (10 GM/ml), agitar e incubar a 65C durante 5-10 minutos
6. Centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g aproximadamente
7. Trasladar el sobrenadante a un tubo de microcentrifugacin que contenga 500 l de cloroformo y
agitar durante 30 segundos
8. Centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases;
9. Tomar 500 l de la capa superior y llevar a otro tubo de microcentrifugacin que contenga 500 l de
cloroformo y agitar
10. Centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g;
11. Trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugacin;
12. Aadir 2 volmenes de solucin de precipitacin a base de CTAB y mezclar
13. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente
14. Centrifugar durante 5 minutos a 16 000 g
15. Desechar el sobrenadante; disolver el precipitado en 350 l NaCl (1,2 M)
16. Aadir 350 l de cloroformo y agitar durante 30 segundos
17. Centrifugar durante 10 minutos a 16,000 g hasta que se separen las fases
18. Trasladar la capa superior a otro tubo de microcentrifugacin
19. Aadir 0,6 volmenes de isopropanol y agitar
20. Centrifugar durante 10 minutos a 16 000 g
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La solucin de ADN puede conservarse en la nevera dos semanas como mximo o en el congelador a - 20C
durante ms tiempo.