Extracción de ADN humano

Eppendorf Columna

Eppendorf Tubo de
sin tapa collección
 Procedimiento – obtención
células
Enjuagar la boca con agua

Isopo 20 veces en cada mejilla

Isopo a eppendorf 1.5 ml con 500uL

buffer de lisis y vortex 6 seg. T°
ambiente 10 min
Extracción de ADN humano
 Extracción de ADN Humano

Sangre  Folículo capilar

Semen  Huesos
Saliva  Tejidos Momificados
Dientes
 ¿Para que extraemos ADN?

Clonación

RFLPs

Secuenciación
Microarreglos

PCR
 Pasos Generales del Proceso

Lisis celular

Purificación ADN
Remoción de Proteínas

Precipitación/Elusión
ADN
 Pasos Generales del Proceso

Lisis celular

Purificación ADN
Remoción de Proteínas

Precipitación/Elusión
ADN
 Lisis Celular

 Sonicación: Ultrasonidos - Destruye la membrana celular

 Detergentes: Desestabiliza la membrana (Disuelve Lípido

 Agentes Caotrópicos: Condiciones Denaturantes

 Lisis Celular

Lisis mecánicas
Choque térmico
Nitrógeno líquido

Detergentes
Desestabiliza 
anfipático
Tensión superficial
Disuelve lípidos http://learn.genetics.utah.edu/units/activities/extraction/images/1and2.jpg
 Lisis Celular

Proteinasa K
 Membranales
 Nucleares
 Histonas
 DNAsas 
conservación
ADN

 Celulasas
 Pared celular
vegetal
 Lisis Celular

 Agentes caotrópicos
 Desestabilizan
interacciones
hidrofóbicas de las
proteína
 Solubilización de AN.
 Remoción de
proteínas pasos
subsecuentes.
 Inhibición de
nucleasas.

bd.unsl.edu.ar/download.php?id=397
 Tiocianato de Guanidina (R)
 Agente Caotropico

 Perjudicial si es inhalado o
ingerido.

 Causa irritación en piel,

ojos y en el tracto
respiratorio.

 Ficha de seguridad:
http://www.jtbaker.com/
msds/englishhtml/g8432.h
tm
 Pasos Generales del Proceso

Lisis celular

Purificación ADN
Remoción de Proteínas

Precipitación/Elusión
ADN
 Obtención y Purificación
 Solventes orgánicos: Fenol-Cloroformo
 Solubilidad diferencial

Fase acuosa ß ADN

ß Proteínas polares

Fase orgánica
ß Proteínas

• Precipitación: Isopropanol y/o etanol

 Obtención y Purificación

Cromatografía de Afinidad
Las sales caotrópicas crean un
entorno hidrofóbico alrededor del
ADN.

Entorno Hidrofóbico: Los ácidos

nucleicos se unen perfectamente a
la membrana de sílica de las
columnas.

Elución de la membrana de sílica

con buffer de baja [sales] o agua.
 Obtención y Purificación

Cromatografía de afinidad:

Ventajas:
Ningún efecto sobre AN.
Alta pureza.
Rápido.

Desventajas:
Costoso.
 Obtención y Purificación

+ +

+ +

+ +

+ +
+ +

+ +
+
+ +
+
+
Cromatografía de Intercambio Iónico
 Obtención y Purificación

 Cromatografía de intercambio iónico:

 Ventajas:
Protección del ADN:
 Dnasas (quela cofactores)
Quela contaminantes e inhibidores de PCR
 Cationes metálicos
Económico
Rápido

 Desventajas:
Ambiente ácido = hidrólisis ADN
Restricción (ssADN)
Obtención y Purificación

 Pureza depende de:

 Tratamiento de la muestra (antes y después

de extracción).
 Condiciones de esterilidad.

 Medición de concentración 
espectrofotómetro.
 Pasos Generales del Proceso

Lisis celular

Purificación ADN
Remoción de Proteínas

Precipitación/Elusión
ADN
 Precipitación de ADN

 Etanol : ADN es insoluble en alcohol

 Elección del Método de
Extracción

 Tipo de muestra

 Target a detectar

 Grado de pureza requerida

 Cantidad de ADN

 Integridad requerida

 Presencia de inhibidores
 Purificación por Columna

Quick-gDNA™ MiniPrep Plus (Zymo Research)

 Lisis: Cell Buffer & Proteinasa K.

 Obtención de ADN: Cromatografía de Afinidad

 Limpieza del ADN: Wash buffer.

 Elusión: DNA Elution Buffer

PROCEDIMIENTO
 Procedimiento – obtención
células
Agregar 1:1 Binding
Buffer Transferir Mezcla de células
(420µl) y mezcle

Columna con un tubo de colección

centrifugar a 13,000 x g por 1min

Descartar tubo de colección con el contenido.

 Procedimiento – purificación
por columna
Agregar 400 µl de
Columna Nuevo tubo de colección Pre-Wash Buffer a
la columna

Centrifugar a 13,000 x g por 1 min o

hasta drenar completamente el
líquido

Agregar 700 µl de Wash Buffer a la columna

Centrifugar a 13,000 x g por 1 min o hasta

drenar completamente el líquido
 Procedimiento – purificación
por columna
Agregar 200 µl de Wash Buffer a la columna

Centrifugar a 13,000 x g por 1 min o

hasta drenar completamente el líquido

Centrifugar a 13,000 x g por 1 min o

hasta drenar completamente el líquido

Transferir columna Eppendorf 1.5 ml

 Procedimiento – purificación
por columna
Agregar 50 µl de Elution Buffer a la columna

Incubar a T° ambiente por 5 min.

Centrifugar a 13,000 x g por 2 min.

Incubar DNA a 55 °C por 5 min

Guardar tubo eppendorf 1.5 con ADN eluido a -

20°C