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37.
Metodos de identificacin
bacteriana en el laboratorio
de microbiologa
2 0 1 0
ISBN-978-84-614-7932-0
I
NDICE DEL DOCUMENTO CIENTFICO
1. Introduccin
II
3. Mtodos moleculares de identificacin bacteriana
3.1. Introduccin
3.2. Genes empleados como dianas moleculares para la identificacin de bacterias
3.2.1. ARNr 16S (rrs)
3.2.2 ARNr 16S-23S y ARNr 23S
3.2.3. rpoB (subunidad de la ARN polimerasa)
3.2.4. gyrB (subunidad de la ADN girasa)
3.3. Fundamento de las tcnicas de identificacin molecular bacteriana
3.3.1. Extraccin del ADN cromosmico
3.3.2. Amplificacin
3.3.3. Secuenciacin del amplicn
3.4. Anlisis de secuencias
3.5. Criterios para la interpretacin de resultados
3.6. Indicaciones de la identificacin molecular
3.6.1. Identificacin de cepas con escasa descripcin, con baja frecuencia de aislamiento, o fenotpicamente
atpicas
3.6.2. Identificacin de cepas de difcil identificacin o de crecimiento fastidioso
3.6.3. Descripcin de nuevos patgenos
3.6.4. Identificacin de bacterias difciles de cultivar
3.7. Desventajas de la identificacin molecular
3.7.1. Calidad disminuida de las secuencias depositadas en la base de datos y errnea asignacin de
especies
3.7.2. Ausencia o baja correlacin entre la identificacin genotpica y fenotpica
3.7.3. Baja resolucin en la identificacin mediante ARNr 16S
3.7.4. Presencia de electroferogramas o cromatogramas de ADN mixtos
3.8. Nuevas tecnologas en la identificacin molecular microbiana
5. Bibliografa
5.1. Bibliografa. Mtodos fenotpicos de identificacin bacteriana.
5.2. Bibliografa. Mtodos moleculares de identificacin bacteriana
5.3. Bibliografa. Mtodos de identificacin bacteriana mediante espectrometra de masas
III
Procedimientos en Microbiologa Clnica
2
DOCUMENTO CIENTFICO
Figura 1. Estructura secundaria del ARNr 16S. Las hlices, comunes a todos los seres vivos y denominadas
hlices universales, se numeran de la 1 a la 48 en orden de aparicin a partir del extremo 5. Las hlices
especficas de procariotas se indican con Pa-b, donde a es el nmero de la hlice universal precedente y b el
nmero de serie. Las regiones relativamente conservadas se presentan en negrilla. Las regiones variables, en
lneas finas, se designan V1-V9, teniendo en cuenta que V4 es exclusiva de eucariotas. Las regiones que se
muestran en lneas discontinuas slo estn presentes en un nmero limitado de estructuras
Tomado de Rodicio M, Mendoza MC. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2004 Apr;22(4):238-45. Reproducido
con permiso de Elsevier Espaa.
10
El anlisis de la secuencia del ARNr 16S Este elevado grado de diversidad en las ITS en
constituye una herramienta muy til en el estudio de diferentes gneros, especies y cepas constituye la
la diversidad bacteriana en muestras clnicas y base para su utilizacin en identificacin, filogenia
ambientales, por lo que se ha estudiado en un gran y/o tipificacin.
nmero de especies bacterianas. Aunque las Aunque en muchos casos se considera que la
secuencias disponibles en las bases de datos secuenciacin de la fraccin 23S puede ser una
presentan un tamao variable, suelen analizarse buena alternativa en los casos en los que la fraccin
entre 500 y 1.500 pb. Actualmente, GenBank es la 16s no proporciona resultados concluyentes,
base de datos con mayor informacin ya que presenta una serie de inconvenientes que han sido
contiene ms de 2 millones de secuencias evaluados por algunos autores. Adems de
depositadas del gen ARNr 16S. Es tambin incrementarse el coste, existen dificultades para la
interesante considerar cuando es necesario analizar amplificacin de fragmentos ms grandes de forma
la secuencia completa o cuando una secuencia de rutinaria con propsitos taxonmicos. Un problema
menor tamao va a proporcionar informacin aadido es la existencia de abundantes secuencias
suficiente. Para diferenciar taxones especficos, de insercin (IS), que sin embargo pueden ser
establecer diferencias entre cepas o para describir fcilmente localizadas y eliminadas mediante anlisis
nuevas especies, es necesario el anlisis de la comparativo, por lo que puede ser utilizado en la
secuencia completa del ARNr 16S. Por el contrario, actualidad como un mtodo auxiliar til con fines
para la mayora de los aislamientos clnicos, la taxonmicos y filogenticos.
secuencia de 500 pb proporciona una identificacin 3.2.3. rpoB (subunidad de la ARN polimerasa).
adecuada (a menor coste), aumentando la La ARN polimerasa (RNAP) es una enzima
posibilidad de encontrar diferencias cuanto mayor es imprescindible en el proceso de transcripcin y
el fragmento secuenciado (ms diversidad por constituye la diana final de las diferentes rutas que
kilobase secuenciada). Hay que tener en cuenta, que controlan la expresin gnica en los organismos
las relaciones filogenticas y los dendrogramas vivos. En bacterias es responsable de la sntesis del
generados pueden ser similares, pero no idnticos ARNm, ARNr y ARNt. La parte central de la RNAP
en funcin del tamao del fragmento del 16S (400kDa) est compuesta de 5 subunidades: el
analizado. dmero 2, , y .
3.2.2. ARNr 16S-23S y ARNr 23S. Tambin se han La subunidad , codificada por el gen rpoB, es el
utilizado otras zonas del ARNr para la identificacin y principal responsable de la actividad cataltica de la
estudio de relaciones filogenticas. Entre ellas las RNAP. Debido a su distribucin universal en las
regiones del espacio intergnico del ARNr 16S-23S bacterias se sugiri su aplicacin como un
(ITS). Estas ITS se presentan en un nmero variable cronmetro molecular de alta potencia. En 1993 y
en funcin del nmero de operones ARNr o alelos rrn utilizando S. aureus se inici la secuenciacin del
(10 en Bacillus subtilis, 10 en Clostridium gen rpoB con el objetivo de identificar
perfringens, 1 en Mycobacterium spp., 1-2 en molecularmente bacterias con repercusin clnica. Se
Mycoplasma spp., etc). Las ITS presentan un tamao presenta en monocopia, con alguna excepcin, y
variable entre diferentes especies (60-pb en tiene un tamao variable segn las especies desde
Thermoproteus tenax a 1529-pb en Bartonella 3.411 pb en S. aureus a 4.185 pb en N. meningitidis.
elizabethae). Este polimorfismo en el tamao, Las secuencias del rpoB presentan en numerosas
tambin se presenta en cepas pertenecientes a una ocasiones mayor calidad que las del ARNr 16S al ser
misma especie, como sucede en S. aureus (303-551- secuencias que se han incluido ms recientemente
pb) y Haemophilus influenzae (478-723-pb). en las bases de datos. Su traslado a secuencias de
Adems, estas variaciones en el tamao de las ITS aminocidos, permiten detectar los errores de
se producen por el nmero y tipo de genes ARNt que secuenciacin que producen los codones de
contienen, como sucede en la mayora de bacterias finalizacin errneos. Adems, la secuencia de
Ala Ile
gramnegativas que contienen ARNt y ARNt , aminocidos deducida permite establecer
Glu
mientras que otros contienen solo ARNt (H. agrupamientos de especies bacterianas.
influenzae, Aeromonas hydrophila). Por el contrario, Otro factor importante, es que existe mayor
Ala Ile
bacterias grampositivas contienen ARNt o ARNt o correlacin en la similitud de la secuencia del rpoB
ambos, o ningn gen ARNt. El anlisis de las con el criterio de inclusin en la misma especie de la
secuencias de las ITS ha demostrado una estructura hibridacin ADN-ADN (DDH <70%). Este criterio no
en mosaico en diferentes especies (H. se cumple fcilmente para valores de similitudes del
parainfluenzae, C. difficile, entre otros), con la ARNr 16S superiores al 99%. Otra circunstancia
presencia o ausencia de bloques de ~100-pb en las favorable del anlisis del rpoB es su aplicacin como
diferentes copias existentes en el genoma. En la instrumento de genotipificacin y de filogenia. Este
identificacin molecular de Bacillus anthracis, B. hecho es consecuencia de que las sustituciones
cereus y B. thuringiensis, la presencia de nucleotdicas que se producen son silentes (tercera
polimorfismos o SNPs (single nucleotide posicin del codn) y que por su funcin de gen
polymorphisms) en las posiciones 75 y 121 del housekeeping probablemente no est sometido a
Ile
ARNt incluido en la ITS completan la identificacin transferencia horizontal gentica. No obstante en
de estas especies tan estrechamente relacionadas. algunos casos, como en Pseudomonas stutzeri, se
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ha demostrado el intercambio horizontal intraespecie aminoacdicas acontecidas principalmente en la
de fragmentos gnicos. subunidad de la topoisomerasa II y su homloga la
El gen rpoB contiene regiones conservadas y topoisomersa IV, conducen a fenotipos de
regiones alternas variables. Los cebadores de amplio resistencia a fluoroquinolonas.
espectro se disean sobre las regiones conservadas El gen gyrB es un buen cronmetro molecular
y suele incluirse una regin interna variable. A para realizar estudios filogenticos en numerosos
diferencia del ARNr 16S, no se pueden utilizar gneros, permitiendo establecer diferencias inter e
cebadores universales para su amplificacin. Sin intraespecie. Actualmente, constituye un marcador
embargo, se puede realizar un diseo de cebadores molecular relevante en la investigacin de especies
de amplio espectro que amplifique diferentes relacionadas, aventajando al ARNr 16S o a las
rdenes pertenecientes a un mismo phylum regiones espaciadoras del ADN.
bacteriano. Por ltimo, existe una gran variedad de genes con
La comparacin de las secuencias del gen fragmentos conservados y regiones variables que se
completo o de sus fragmentos del gen rpoB se utilizan en numerosos grupos de bacterias, hps65
realiza principalmente a travs de las bases de datos (micobacterias), recA (genovariedades de B. cepacia
del GenBank o de BIBI. Una secuencia parcial (300- complex), hsp60 (codifica para la chaperonina 1, y se
750 pb) es suficiente para la identificacin de encuentra altamente conservado en numerosas
aislamientos clnicos, mientras que para las nuevas bacterias, arqueas y eucariotas) y que constituyen
especies se secuencia el gen completo. Se ha una buena alternativa para estudios taxonmicos,
comprobado que el anlisis del fragmento evolutivos, de ecologa y filogenia.
hipervariable (posiciones 2300-3300 pb) se
correlaciona positivamente con el anlisis del gen 3.3. FUNDAMENTO DE LAS TCNICAS DE
completo. IDENTIFICACIN MOLECULAR BACTERIANA.
El gen rpoB constituye uno de los pocos genes Las tcnicas de identificacin molecular en bacterias
candidatos tiles en la identificacin bacteriana en mediante el anlisis del ARNr 16S u otros genes
los anlisis taxonmicos y filogenticos de cepas de mencionados se basa en la amplificacin genmica y
origen humano, animal y ambiental. El gen rpoB en la secuenciacin de esos genes o sus
permite la identificacin a nivel de gnero, especie y fragmentos. El medio de cultivo o las condiciones de
en ocasiones a nivel de subespecie. Aunque no incubacin no sern factores determinantes, pero si
siempre, es tambin til para diferenciar sern factores crticos la tcnica de extraccin del
serovariedades biovariedades como sucede en ADN cromosmico y la amplificacin. A continuacin
Salmonella enterica subsp. enterica). se describen las etapas metodolgicas (Figura 2) a
3.2.4. gyrB (subunidad de la ADN girasa). Es el considerar en la identificacin molecular.
gen codificante de la subunidad de la ADN girasa o 3.3.1. Extraccin del ADN cromosmico.
topoisomerasa II y est implicado en la replicacin Dependiendo de la rapidez en el diagnstico y/o
del ADN bacteriano. De distribucin universal, la dificultad en el crecimiento del patgeno (bajo
presencia en monocopia de gyrB permite la inculo, lento crecimiento, requerimiento de medios
discriminacin e identificacin de especies sintticos complejos, etc.), se podrn aplicar estas
fuertemente relacionadas pertenecientes a los tcnicas directamente sobre muestras clnicas o
gneros Aeromonas, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, sobre el cultivo bacteriano. El ADN genmico se
y tambin enterobacterias, micobacterias y bacterias extraer a partir de las clulas totales mediante
cido-lcticas. Es un marcador de gran utilidad en la diferentes mtodos estndar o sistemas comerciales
sistemtica bacteriana al presentar una tasa de con versatilidad sobre el tipo de muestra clnica o de
sustituciones sinnimas o silentes que se estima en matrices, en el caso de tratarse de una muestra
al menos cuatro veces mayor que la del ARNr 16S. alimentaria o ambiental. Dependiendo del tipo de
La ADN girasa cataliza la interconversin de los bacteria se pueden aplicar modificaciones que
ismeros topolgicos del ADN. Est formada por dos simplifiquen u optimicen la extraccin cromosmica.
monmeros de cada subunidad GyrA y GyrB, 3.3.2. Amplificacin. En un termociclador, este
codificados por los genes gyrA y gyrB, ADN se utilizar como molde para la amplificacin
respectivamente. Interviene en el proceso de por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) de
trascripcin del ADN a travs de su actividad de una secuencia del ARNr 16S con un rango de
superenrollamiento, durante el que la subunidad tamao entre 500-1.500 pb (o de otro tamao si se
suministra la energa necesaria para la accin analizan otros genes). Con cebadores universales o
cataltica de la subunidad por hidrlisis de ATP. de amplio espectro complementarios a las regiones
Las reacciones que catalizan incluyen la formacin conservadas, se amplificara tericamente el gen del
de estructuras anudadas en ADN circular, en cadena ARNr 16S en todas las bacterias. Ninguno de los
sencilla y en doble cadena cerrada. La ADN girasa cebadores utilizados en la actualidad se considera
constituye la principal diana de las quinolonas, totalmente universal, por lo que no se puede realizar
antimicrobianos que se unen al complejo ADN/ADN- una recomendacin especfica de cebadores que
girasa, inhibiendo la etapa de superenrollamiento garantice la amplificacin de todos los procariotas.
negativo previo a la replicacin. Sustituciones
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Figura 2. Etapas del proceso de identificacin bacteriana mediante secuenciacin del ADNr 16S.
Tabla 1. Recomendaciones para la utilizacin del anlisis del ARNr 16S y del gen rpoB en la identificacin
bacteriana.
Categora Recomendaciones
Mnimo:>98,5% similitud
Anlisis del ARNr 16S Ideal: 1.300 a 1.500 pb secuenciadas
<1% posiciones ambiguas
Mnimo:>98,5% similitud
Ideal: :>99% similitud
Comparacin con la secuencia tipo o cepa de referencia
Criterio para la identificacin de especie
que posee estudios de homologa de ADN. Para
diferencias <0,5% a la especie ms cercana, considerar
otras propiedades (fenotipo)
Morfologa de la colonia
Tincin Gram
Anlisis retrospectivo de la
Catalasa/Oxidasa
identificacin fenotpica
Perfil bioqumico
Requerimientos nutricionales
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Frecuentemente, las comparaciones entre las utilidad en la identificacin de especies
diferentes secuencias se muestran mediante los pertenecientes a grupos muy homogneos.
alineamientos lineales y dendrogramas. Esta opcin 3.6.3. Descripcin de nuevos patgenos . La
es proporcionada por BLAST, BIBI y otros programas hibridacin ADN-ADN se considera el gold standard
como PAUP (http://paup.csit.fsu.edu/) o Phylip en la propuesta de nuevas especies y la definitiva
(http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.htm). asignacin taxonmica de una cepa. En base a la
En la realizacin de los dendrogramas se utilizan cintica de reasociacin del ADN-ADN se cuantifica
diferentes algoritmos: el mtodo NJ (neighbor- la definicin gentica de especies cuando existe
O
joining), el mtodo UPGMA (unweighted pair group 70% de homologa ADN-ADN y 5 C en la Tm
method with arithmetic averages) y en ocasiones el para la estabilidad de las molculas del
WPGMA (weighted pair group method with arithmetic heteroduplex. Sin embargo, el elevado tiempo
averages). Los principales agrupamientos se necesario para la realizacin de la tcnica, el trabajo
mantienen si las cepas se hallan muy relacionadas. invertido y su elevado coste hace que cada vez
Si la relacin es ms dbil, la apariencia del menos laboratorios realicen esta tcnica. Y as la
dendrograma se modifica segn el programa mayora de los estudios que describen las nuevas
utilizado. Otro factor que afecta a la comparacin en especies se basan en las secuencias SSU y otros
el dendrograma es la seleccin del outgroup (ser datos polifsicos.
una cepa relacionada pero fuera del grupo Ningn otro gen como el ARNr 16S ha mostrado
comparado, frente a la cual se realiza la primera su amplia aplicabilidad en todos los grupos
comparacin). Si el outgroup no es adecuado, las taxonmicos. Si el objetivo a alcanzar es la
diferencias entre los grupos del dendrograma se identificacin de una bacteria desconocida sin existir
pueden minimizar. conocimiento previo, el ARNr 16S es la mejor
En muchos de los anlisis filogenticos eleccin. El anlisis del ARNr 16S constituye el eje
realizados se observa, que los rboles realizados principal sobre el que se estructuran las ltimas
con las secuencias del rpoB son ms robustos que ediciones del libro de referencia en taxonoma
los obtenidos con las secuencias del ARNr 16S bacteriana Bergeys Manual of Systematic
(menores valores de bootstraps), permitiendo Bacteriology. Muchas de las nuevas especies de
identificar diferentes clusters en los gneros micobacterias (>60) de las 148 existentes han sido
Mycobacterium, Acinetobacter y otros. descritas gracias a la utilizacin de este gen y otros
adicionales, y ha reasignado en nuevos grupos a las
3.6. INDICACIONES DE LA IDENTIFICACIN micobacterias de crecimiento lento y rpido.
MOLECULAR Para la descripcin de una nueva especie, se
En la prctica de la microbiologa clnica se producen recomienda la presencia de diferencias fenotpicas
una serie de circunstancias en las que es til la claras y en la secuencia diferencias de >1 pb/100
identificacin bacteriana mediante mtodos bases. Si estas diferencias son >5%, se podra
moleculares. Entre ellas estn la dificultad en el considerar la existencia de un nuevo gnero. Se
aislamiento, el crecimiento lento, la baja actividad en estima que entre un 10%-20% de los aislamientos no
las pruebas bioqumicas, ausencia o baja efectividad coinciden con los microorganismos descritos y que
de tcnicas serolgicas, etc. Estas situaciones y la puede tratarse de un gnero o especie nueva, pero
necesidad de obtener resultados reproducibles e en cepas obtenidas en la prctica clnica esta
intercambiables entre laboratorios confieren a las frecuencia es muy inferior.
tcnicas moleculares, y en especial al ARNr 16S y al La creciente relevancia del anlisis del rpoB se
rpoB, un gran protagonismo. manifiesta en dos situaciones: 1) el contenido
3.6.1. Identificacin de cepas con escasa bacteriano GC puede estimarse matemticamente
descripcin, con baja frecuencia de aislamiento, por el contenido GC del gen rpoB y 2) la similitud que
o fenotpicamente atpicas. En estas circunstancias presentan las secuencias rpoB de dos especies
la prctica clnica se ve beneficiada por la bacterianas se correlaciona de forma muy
identificacin mediante ARNr 16S, aventajando en significativa con sus correspondientes valores de
rapidez y exactitud a una amplia variedad de hibridacin ADN-ADN (DDH) y con su identidad
sistemas como los perfiles de cidos grasos media en nucletidos (ANI).
celulares, la utilizacin de fuentes de carbono y otras 3.6.4. Identificacin de bacterias difciles de
identificaciones convencionales. cultivar. La utilizacin de cebadores universales
3.6.2. Identificacin de cepas de difcil para el ARNr 16S en la muestra clnica es un paso
identificacin fenotpica o de crecimiento que permite aumentar la concentracin de ADN en
fastidioso. Tal es el caso de la dificultad para bacterias difciles de cultivar o con complejos
diferenciar fenotpicamente las especies de Nocardia requerimientos de cultivo, secuenciando despus el
y de Mycobacterium. Sin embargo, esta identificacin amplicn, y constituye una estrategia eficiente si se
no es completa para algunas especies de detecta un solo microorganismo. De esta forma se ha
micobacterias (Mycobacterium tuberculosis y otras podido constatar la presencia de Bartonella quintana
micobacterias del grupo tuberculosis; M. chelonae y y Coxiella burnetii como principales agentes
M. abcessus; M. avium y M. paratuberculosis), por lo etiolgicos en endocarditis con cultivo negativo. En el
que entre otros genes se recurre al rpoB de gran caso de que la muestra posea un origen no estril o
proceda del medio ambiente, esta estrategia no es
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eficiente. Tambin es til cuando existe tratamiento algunas subespecies de Streptococcus y mucho
antimicrobiano y su cultivo es negativo. En menores que para muchas especies de Clostridium.
situaciones de adherencia, diversidad o En el caso de discrepancias entre el fenotipo y el
microorganismos desconocidos, el anlisis del ARNr genotipo de una cepa, ambos se deben estudiar de
16S, contina siendo til, como sucede en nuevo. Confirmados los resultados, se considera que
infecciones periodontales y biofilms, donde se el genotipo se impone sobre el fenotipo.
combina el cebador directo universal y el reverso 3.7.3. Baja resolucin en la identificacin
especifico para espiroquetas. En el estudio de estas mediante ARNr 16S
comunidades bacterianas, el rpoB tambin puede En ocasiones el ARNr 16S presenta una baja
desempear un importante papel al presentarse en capacidad de discriminacin para algunos gneros y
monocopia frente a la heterogeneidad en las copias especies debido a una reciente divergencia, y es
del ARNr 16S, obtenindose menor ambigedad en necesario complementar la identificacin con el
la secuencia del rpoB. estudio de otros genes o con pruebas fenotpicas
(Tabla 2). As sucede con diferentes especies de los
3.7. DESVENTAJAS DE LA IDENTIFICACIN gneros Bacillus (B. cereus y B. thuringiensis; B.
MOLECULAR globisporus y B. psychrophilus), en los gneros
Distintas causas originan una incorrecta asignacin Brucella, Achromobacter, Strenotrophomonas y
de gnero y especie cuando se realiza una Actinomyces, en el complejo Acinetobacter
identificacin mediante el anlisis de la secuencia y baumannii-A. calcoaceticus, en las micobacterias de
su alineamiento con otras secuencias. crecimiento rpido, y en la familia
3.7.1. Calidad disminuida de las secuencias Enterobacteriaceae (especialmente en Enterobacter
depositadas en la base de datos y errnea y Pantoea). Situacin opuesta se produce por la
asignacin de especies. En la identificacin heterogeneidad intragenmica en el ARNr 16S en el
molecular existe una fuerte dependencia con la gnero Aeromonas. En A. veronii existen ms de 6
precisin de las secuencias depositadas y la copias de ARNr 16S que difieren en >1,5% entre
idoneidad en la asignacin de especie de esas ellas.
cepas. Se produce cuando cepas tipos o de Es necesario recordar que muchas especies o
colecciones certificadas estn incorrectamente subespecies que no pueden identificarse mediante el
identificadas. En otras ocasiones, la nomenclatura ARNr 16S, lo son mediante el anlisis del rpoB
no ha sido actualizada como en el caso de los 3.7.4. Presencia de electroferogramas o
gneros polifilticos. Tambin puede suceder que cromatogramas de ADN mixtos. La utilizacin del
cepas genticamente diferentes (>2% de ARNr 16S como herramienta de diagnstico est
variabilidad) estn incluidas en la misma especie, o limitada a infecciones monobacterianas ya que en
que haya una presencia elevada de un nmero de las polimicrobianas se obtendra un electroferograma
indeterminaciones, o la incorrecta asignacin de mixto. En estas situaciones, con frecuencia, se haya
especie por falta de pruebas fenotpicas o errores. implicada una bacteria anaerobia y la concordancia
Gran parte de estos errores podran minimizarse entre cultivo y secuenciacin es baja. Se han
utilizando sistemas de revisin, tal como realizan descrito diferentes estrategias para resolver esta
bases de datos como el RINDOM o el MicroSeq. circunstancia:
3.7.2. Ausencia o baja correlacin entre la - electroforesis en gel en gradiente
identificacin genotpica y fenotpica. En desnaturalizante denaturing gradient gel
ocasiones surgen dudas respecto a la correlacin electrophoresis (DGGE);
entre las identificaciones fenotpicas y genotpicas, - amplificaciones independientes para
dificultando la asignacin de especie mediante el grampositivos y para gramnegativos;
ARNr 16S. Esto sucede cuando se encuentran - pirosecuenciacin;
genotipos idnticos o similares y diferentes fenotipos. - utilizacin de un algoritmo en el programa
As ha sucedido con M. tuberculosis y M. bovis o M. informtico RipSeq (iSentio) que separa las
africanum; Bordetella pertussis con B. parapertussis seales ambiguas de los cromatogramas mixtos.
y B. bronchiseptica; con las diferentes especies de La identificacin bacteriana proporcionada por el
Brucella, etc. anlisis del ARNr 16S es ms certera, slida y
En otras situaciones, existen especies distintas reproducible que los anlisis fenotpicos, resolviendo
con diferencias fenotpicas pero una gran homologa aproximadamente el 90% de las identificaciones. Sin
en las secuencias del ARNr 16S como ocurre con embargo, no constituye una herramienta infalible. La
Escherichia coli y Shigella dysenteriae o S. elaboracin de recomendaciones en su anlisis
pneumoniae y S. mitis. Por el contrario, se dan casos segn los gneros y especies a identificar, las bases
en los que los microorganismos presentan de datos con mayor calidad de las secuencias
secuencias con un elevado nmero de diferencias y depositadas, la aplicacin complementaria o en
sin embargo, pertenecen a la misma especie o sustitucin de otros genes housekeeping como
genotipo (Clostridium tetani y C. innocuum). dianas, proporcionar en un futuro inmediato
Estas distintas consideraciones se ponen plataformas ms eficientes en la identificacin
claramente de manifiesto cuando se observa que las molecular bacteriana.
diferencias genticas en el ARNr 16S de los gneros
de Enterobacteriaceae son menores que para
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Tabla 2. Ejemplos de gneros y especies bacterianas con menor resolucin en la identificacin por ARNr 16S y
propuestas de genes alternativos
Especialmente el anlisis del rpoB va a contribuir interfiere slo ligeramente en la deteccin del
a una identificacin bacteriana ms eficiente (gnero, patgeno.
especie, subespecie), detectando y reclasificando De forma adicional han surgido plataformas de
nuevos organismos, y mejorando la resolucin identificacin de patgenos que modifican o
filogentica del ARNr 16S. sustituyen la secuenciacin tradicional, como sucede
con la pirosecuenciacin o la espectrofotometra de
3.8. NUEVAS TECNOLOGAS EN LA masas, respectivamente. Mediante plataformas de
IDENTIFICACIN MOLECULAR MICROBIANA amplificacin-pirosecuenciacin se realiza la
Recientemente, la aparicin de la tcnica de PCR en identificacin bacteriana o fngica mediante PCR de
multiplex acoplada a un anlisis de la temperatura de 3 regiones variables del ARNr 16S (V1-V3, o V1, V2
melting (SeptiFast, Roche Diagnostics, Manheim, y V6) y del ARNr 18S, respectivamente, en
Germany) identifica de forma temprana a algunos hemocultivos (BlackLight Sepsis Kit, BlackBio,
agentes etiolgicos bacterianos y fngicos de la Madrid, Spain; Pyromark ID, Quiagen GmbH, Hilden,
sepsis a partir de muestra directa. La regin Germany). Se obtienen 3 amplicones con un tamao
amplificada es el espacio intergnico del 16S-23S inferior a 500 pb, susceptibles de determinar su
ARNr bacteriano o del 18S-5,8S fngico. La no composicin en nucletidos mediante la emisin de
deteccin de todos los potenciales patgenos y la luz por la liberacin de pirofosfatos (subproductos de
necesidad de cultivo para la determinacin del perfil la extensin por polimerizacin de la cadena de
de sensibilidad a antimicrobianos, no permite a esta ADN). Sucesivas innovaciones de este mtodo en la
tcnica sustituir la realizacin de los hemocultivos. amplificacin respecto al tipo de muestra clnica y a
Otras desventajas aadidas al restringido espectro la determinacin de diferentes fragmentos gnicos
de especies detectadas son: falsos positivos con correspondientes a los distintos factores de
bacteremias o fungemias transitorias, fuerte patogenicidad, resistencia, etc., aumentan las
dependencia de la concentracin bacteriana, alto posibilidades de esta plataforma.
coste y carga de trabajo. En el caso de existir Las plataformas de amplificacin-
discrepancias entre la deteccin por ambos mtodos espectrofotometra de masas (PCR/ESI-MS)
diagnsticos, se proponen algoritmos de decisin permiten la deteccin universal de uno o varios
tiles. Una ventaja importante de esta tcnica es que patgenos (bacterias, virus, hongos y protozoos)
la administracin de antimicrobianos al paciente presentes en una amplia variedad de muestras
(ambientales, clnicas, alimentarias o en cultivos) del
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siguiente modo. Tras extraccin y una PCR de utilice para fragmentar la protena se obtienen
amplificacin con parejas de cebadores de amplio diferentes huellas peptdicas. Estas son
espectro, se obtienen uno o varios productos de caractersticas de cada protena. Actualmente
PCR que corresponden a regiones genmicas de hay numerosas bases de datos que recogen las
identificacin de los distintos dominios microbianos huellas peptdicas de multitud de protenas
en relacin con la complejidad de la muestra conocidas. Estas bases de datos se pueden
problema. Estos productos se desalan y son rastrear usando programas bioinformticos para
ionizados y aerosolizados hacia un buscar la huella peptdica que corresponda con
espectrofotmetro de masas. Se generan seales la de aquella protena que se est estudiando y
espectrales que son procesadas para determinar su por tanto poder identificarla.
masa y su composicin en bases. Estos resultados - Tcnicas que se usan para estudiar interacciones
son considerados con los iniciadores de entre protenas, como los sistemas yeast two
amplificacin utilizados en la estrategia T.I.G.E.R hybrids de alto rendimiento o la tcnica Phage
Triangulation Identification for the Genetic Display. Esta ltima permite averiguar con qu
Evaluation of Risks (Ibis T5000, Alcimed, Paris, protenas interacciona una protena problema o
France) entrando la informacin en una base de sonda. Esta tcnica consiste en la expresin en
datos genmica que asigna la determinacin de la superficie de un fago de las protenas que se
especie. Ventajas indicadas son: no requieren cultivo quieren analizar.
o conocer con anticipacin el producto analizado; es En la actualidad el reto principal de la protemica
eficiente en muestras polimicrobianas; en el caso de es su automatizacin y la integracin de las
nuevos patgenos no caracterizados permite la tecnologas mencionadas. Este es un reto cuya
asignacin a gneros o familias bacterianas o vricas; respuesta saldr, principalmente de la bioinformtica.
y tambin permite realizar la deteccin de genes de De entre todas las herramientas que se emplean en
virulencia, de resistencia y la tipificacin. la protemica, en este documento se va a abordar
Recientemente ha aparecido una nueva nicamente la espectrometra de masas, con
plataforma comercial, conocida como PLEX-ID especial mencin a las tcnicas empleadas para la
(Abbott), basada en esta metodologa, que permite el identificacin de microorganismos.
anlisis directo e identificacin de microorganismos
sobre muestras, incluidos los hemocultivos (BAC 4.2. FUNDAMENTO Y VARIANTES TCNICAS
Spectrum Assay). Ha demostrado buenos resultados 4.2.1. Espectrometra de masas. La espectrometra
incluso en bacteriemias polimicrobianas, con de masas es una tcnica analtica que permite
independencia de que sean microorganismos analizar con gran precisin la composicin de
aerobios, anaerobios, cultivables, lentos crecedores diferentes elementos qumicos al permitir la medicin
o incultivables. Destaca como aspecto importante de iones derivados de molculas separndolos en
que podra incluso utilizarse como un mtodo funcin de su relacin masa/carga (m/z). Un in es
cuantitativo. un tomo o molcula cargada elctricamente debido
al exceso o falta de electrones. Dado que la mayora
4. MTODOS PROTEMICOS DE de los iones formados poseen una sola carga, la
IDENTIFICACIN BACTERIANA relacin m/z es equivalente a m.
4.1. INTRODUCCIN En el espectrmetro de masas se produce la
La protemica es el estudio y caracterizacin del separacin de las especies inicas de la muestra, en
conjunto de protenas expresadas por un genoma funcin de su masa. El espectro de masas de cada
(proteoma). Las tcnicas de protemica abordan el compuesto se denomina huella qumica y es una
estudio de este conjunto de protenas y las ms representacin grfica de los fragmentos obtenidos,
usadas se basan en la electroforesis y en la por orden creciente de masa frente a su abundancia
espectrometra de masas. Dependiendo del objetivo relativa.
del estudio se pueden agrupar las tcnicas de 4.2.2. Componentes del espectrmetro de masas.
protemica en los siguientes grupos: Los tres componentes bsicos de un espectrmetro
- Tcnicas empleadas para analizar globalmente el de masas son los siguientes:
proteoma y separar sus protenas. Entre ellas - Fuente de ionizacin. Es el elemento del
destacan la electroforesis bidimensional, DIGE espectrmetro que ioniza el material que va ser
(electroforesis diferencial en gel), ICAT (marcaje analizado. Las tcnicas para la ionizacin, el
isotpico diferencial) y MudPIT (tecnologa de proceso fsico o qumico mediante el cual se
identificacin de protenas multidimensional). producen iones, han sido determinantes para
- Tcnicas usadas para analizar individualmente establecer qu tipos de muestras se pueden
las protenas. Con este objetivo se utilizan analizar por espectrometra de masas. La
distintos tipos de espectrometra de masas. Con ionizacin del electrn (EI) y la ionizacin
ellas se obtiene la huella peptdica que es el molecular se utilizan para los gases y los vapores.
conjunto de fragmentos peptdicos que se Dos tcnicas, usadas a menudo con lquidos y
obtienen tras tratar una protena concreta con muestras biolgicas slidas, incluyen la ionizacin
una proteasa determinada. Las proteasas son por electroespray (ESI desarrollado por Fenn) y la
enzimas que rompen los enlaces peptdicos de desorcin/ionizacin por lser asistida por matriz
las protenas. Dependiendo del enzima que se (MALDI desarrollado por Karas y Hillenkamp).
19
- Analizador de masas. Utiliza un campo elctrico carbono, compuestos glicoconjugados, etc.) y
o magntico para acelerar los iones y separarlos polmeros sintticos.
en funcin de su relacin masa/carga (m/z). Tambin existen actualmente otros mtodos
Actualmente existen diferentes mtodos para como ESI (ElectroSpray Ionization Mass
"filtrar" los iones respecto a su relacin Spectrometry), SELDI (Surface Enhanced Laser
masa/carga, como el cuadrupolo o como el Desorption Ionization), DIOS (Direct Ionisation on
analizador de tiempo-de-vuelo (time of flight, Silicon) y adems acoplamiento MS/MS (Mass
TOF) mediante el cual la determinacin de la Spectrometry/ Mass Spectrometry).
masa en una regin de alto vaco se realiza 4.2.4. Espectrometra de masas MALDI-TOF. La
mediante una medida muy precisa del perodo de espectrometra de masas MALDI-TOF se denomina
tiempo desde la aceleracin de los iones en la MALDI por sus siglas en ingls matrix-assisted laser
fuente hasta que impactan con el detector. desorption/ionization (desorcin/ionizacin por lser
- Detector. Los iones que llegan al detector asistida por matriz) y TOF por el analizador time of
producen una seal elctrica que es procesada, flight (tiempo de vuelo) que se integra tpicamente
ampliada y enviada a un ordenador. El registro con fuentes de ionizacin maldi.
obtenido es el espectro de masas o huella Destacan como ms importantes las siguientes
qumica. Tpicamente, se utiliza un cierto tipo de caractersticas:
multiplicador de electrones (electromultiplicador). - Para obtener iones de forma adecuada es
4.2.3. Variantes de la espectrometra de masas. necesario que la muestra este embebida en
La espectrometra de masas es una tcnica analtica una matriz orgnica
ideada a principios del siglo XX. Durante muchos - Como fuente de ionizacin emplea un laser. Se
aos, las aplicaciones de esta tcnica se vieron generan iones tras bombardear con fotones
limitadas a compuestos (analitos) de bajo peso (laser) la muestra. Se producen rayos UV de
molecular, termoestables y fcilmente volatilizables. 337nm.
En la dcada de los 70 se describen los primeros - La separacin de los iones se produce segn el
experimentos con xito donde las molculas tiempo de vuelo.
termolbiles eran transformadas sin descomposicin - El espectro se genera mayoritariamente por
alguna y en un nico paso a iones gaseosos. Estas iones univalentes.
tcnicas de volatilizacin/ionizacin se denominan - El tiempo de obtencin del espectro es aprox. de
-12
tcnicas de desorcin. En estos casos al analito no un minuto para 10 g de un compuesto de
voltil convenientemente depositado sobre una masa/carga (m/z) de 1.000 Daltons (Figura 3).
superficie metlica en alto vaco, es bombardeado
con un haz de tomos neutros acelerados (FAB), o Figura 3. Representacin de un sistema MALDI-TOF
con un haz de tomos inicos acelerados (LSIMS), o
es expuesto a la accin de un fuerte campo elctrico
que induce su volatilizacin/ionizacin por efecto
tnel (FD), o es expuesto a la accin de un plasma
(PD) o a la accin de un lser (LD). Si bien estos
mtodos de ionizacin ampliaron el uso de la tcnica
a molculas termolbiles y a macromolculas,
prcticamente su lmite de aplicacin es para analitos
de peso molecular por debajo de 700-800 Da.
La introduccin de nuevos mtodos de ionizacin,
que no requieren de la volatilizacin previa de la
muestra, fue el elemento principal que permiti la
extensin de la espectrometra de masas al campo El proceso se puede resumir en los siguientes pasos:
de las biomolculas. Fue a finales de la dcada de - La muestra se mezcla con una matriz en exceso
los 80 tras el xito conseguido por Tanaka (Premio sobre una superficie de metal (tarjeta metlica),
Nobel de Qumica 2002), mediante el uso de de tal forma que ambas cocristalizan cuando se
matrices metlicas (soft laser desorption, SLD) evapora el solvente.
cuando Karas y Hillenkamp simultneamente - Se irradia esta preparacin con un lser, en
describen la deteccin del ion gaseoso intacto de condiciones de alto vaco. La matriz absorbe
protenas con el uso de las matrices orgnicas esta energa y la transfiere a la muestra,
fotosensibles. Dio lugar al desarrollo del mtodo de provocando su ionizacin.
volatilizacin/ionizacin suave, que hoy se conoce - El rea irradiada, de unas pocas micras, se
como matrix assisted laser desorption/ionization calienta dando lugar a la desorcin de los iones
mass spectrometry MALDI. de fase slida a fase gaseosa.
Desde su implementacin prctica, el mtodo de - La muestra ionizada y vaporizada crea una
ionizacin MALDI se ha usado con xito para el densa nube de gas entre dos electrodos. El
anlisis por espectrometra de masas de campo elctrico formado se emplea para
biomacromolculas (cidos nucleicos, nucletidos, acelerar la muestra hasta el detector.
nuclesidos, protenas, pptidos, lpidos, hidratos de
20
- Los iones ms ligeros experimentan una mayor - Es importante emplear el mismo protocolo
aceleracin, viajan ms rpido y llegan primero estandarizado para obtener los perfiles y
al detector. poderlos comparar con una base de datos
- En el detector se genera el perfil o huella previa.
qumica especfico de esa muestra. A continuacin se describen con ms detalle tres
En este tipo de espectrometra es de suma ejemplos de sistemas comerciales que emplean
importancia la matriz ya que funciona como un espectrometra de masas MALDI-TOF para
transmisor, transfiriendo la energa necesaria para la identificacin microbiana: MicrobeLynx de Waters
ionizacin, del lser a las molculas de la muestra. Corporation, MALDI Biotyper de Bruker Daltonics y
La mezcla muestra-matriz debe cristalizar de forma AXIMA@SARAMIS de Schimadzu & Anagnostec
homognea para garantizar una resolucin ptima (Tabla 3). Cada tcnica recomienda sus propios
del espectro. protocolos para la preparacin de la muestra y tiene
4.2.5. Aplicaciones de la espectrometria de asociada una base de datos distinta, junto con un
msas. Las tcnicas de espectrometra de masas se software para la adquisicin de los espectros y
han utilizado y se siguen utilizando para un gran comparacin con la base de datos.
nmero de aplicaciones, como puede ser la medida El primer sistema desarrollado para la
exacta de pesos moleculares, monitorizacin de identificacin bacteriana fue MicrobeLynx System.
reacciones bioqumicas (reacciones enzimticas, Participaron en su creacin la Universidad de
modificaciones qumicas, digestin de protenas), Manchester, la Unidad de la Agencia de Proteccin
secuenciacin de aminocidos, secuenciacin de de la Salud con Servicio de Identificacin Molecular y
oligonucletidos, o determinacin de estructura de la empresa Waters Corporation. Apareci como una
protenas. tcnica que precisaba pruebas preliminares ya que
Una aplicacin de la espectrometra de masas requera una matriz diferente para microorganismos
MALDI-TOF de gran inters en microbiologa es la grampositivos y gramnegativos, conllevaba una
identificacin de microorganismos. La identificacin mnima preparacin de la muestra y un tiempo de
bacteriana basada en el perfil de protenas obtenido secado (1 h) antes de aadir matriz. Precisaba una
mediante la espectrometra de masas MALDI-TOF lectura mnima de 4 pocillos de la tarjeta por
fue ya propuesta hace varias dcadas. Sin embargo, muestra a identificar. La versin comercial empleada
slo recientemente ha empezado a usarse como un proporcionaba escasa reproducibilidad de la tcnica
mtodo rpido y fiable para la identificacin ya que existan diferencias bajo distintas condiciones
bacteriana. En un principio se realizaron estudios de cultivo.
parciales sobre su eficacia para la identificacin de Los sistemas ms extendidos en la actualidad son
determinados microorganismos en condiciones MALDI Biotyper y AXIMA@SARAMIS (Tabla 3).
controladas. Actualmente, cada vez aparecen ms Utilizan una tcnica rpida y sencilla que no precisa
trabajos que han estudiado su eficacia en la pruebas preliminares, con mnima preparacin de la
identificacin de aislamientos clnicos de bacterias muestra y lectura e interpretacin inmediata. Las
grampositivas y gramnegativas de diversos orgenes bases de datos estn en constante actualizacin con
directamente desde los medios de cultivo habituales ms de 3.500 entradas. Realizan la identificacin de
y sin condiciones especiales, como mtodo de rutina. bacterias (grampositivas, gramnegativas, anaerobios,
4.2.6. Plataformas comerciales de espectrometra no-fermentadores, micobacterias), levaduras y
de masas MALDI-TOF para identificacin hongos. Ambas tienen la posibilidad de incluir
microbiana. Desde la descripcin original del nuevas referencias de cepas por el usuario. Permite
sistema, se han desarrollado varios sistemas que el anlisis simultneo de 48 96 muestras en una
son capaces de realizar la identificacin de bacterias hora dando los primeros resultados en minutos.
enteras, sin necesidad de largos procedimientos Destaca la reproducibilidad de la tcnica. Al basarse
previos (extraccin protenas, digestin, purificacin, en la medida de protenas ribosmicas presentes de
etc.). forma abundante no presenta diferencias en el
Se basan en la deteccin de protenas espectro obtenido bajo distintas condiciones de
ribosmicas S y L (2.000 a 20.000 Da). Se asume cultivo. Se pueden usar para diagnstico clnico por
que el 80-90% de las seales del espectro de la su marcado IVD y CE.
bacteria son protenas ribosmicas. Las Los dos sistemas presentan un procedimiento
caractersticas principales de estos sistemas son las diferente en el anlisis del espectro. En el sistema
siguientes: MALDI Biotyper, la base de datos est formada por
- Sin procedimiento previo de extraccin. Se utiliza entradas que corresponden al espectro promedio (de
directamente una colonia bacteriana. al menos 24 espectros de alta calidad) de un
- Comparan perfil o huella espectral desconocida microorganismo concreto (genero, especie y cepa).
frente a las de bacterias conocidas. Figuran cepas de varias colecciones ya que la
- Comparacin de espectros generados con bases compaa tiene colaboraciones por todo el mundo.
de datos previas. Por el contrario, en el sistema SARAMIS, para la
- Rapidez de la tcnica (aprox. 90 generacin de un superespectro se necesitan al
microorganismos / hora) menos de 15 a 20 aislados diferentes
- Identificacin a nivel de gnero y especie, en representativos de una especie de diferentes
ocasiones subespecies.
21
localizaciones (hospitales, centros de referencia y
cultivos de cepas de colecciones).
Casa comercial
Waters Corporation Bruker Shimadzu
Software y base de Microbe Lynx System -MMU Maldi Biotyper SARAMIS
datos (Manchester Metropolitan (Bruker Daltonics ) (AnagnosTec GmbH)
University)
Espectrmetro de Micro MX Microflex Bruker Axima
masas
Identificacin Bacterias aerobias Bacterias, levaduras Bacterias, levaduras y
/anaerobias y hongos hongos filamentosos
filamentosos
Anlisis de espectro Espectro promedio Superespectro
Preparacin de la Si No No
muestra Secado de 1 h Secado inmediato Secado inmediato
Matriz Gram(+): solucin saturada 3 Solucin saturada de 2,5 cido dihidroxi-
mg/ml de 5-Cl-2-mercapto- cido -ciano-4- benzoico disuelto en
benzotizol (CMBT) disuelto hidroxi-cinnamico en una mezcla de
en agua:metanol: acetonitrilo 50% acetonitrilo- agua:etanol:acetonitrilo
(1:1:1) con 0,1% cido 2,5% cido (1:1:1) mix o de agua:
frmico y 0,01M 18-crown-6- trifluoroactico acetonitrilo (1:1) con
ter 0,03% de cido
Gram(-): el CMBT se trifluoroactico
sustituye por 14 mg/ml de - Aadir 1 l
ciano-4-hidroxi-cinnamico Aadir 0,3- 1 l
(CHCA)
Rapidez 96 muestras / 1,5 h 96 muestras / 1 h 380 / 5 h
26
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28
DOCUMENTO TCNICO
PNT-ID-01
MTODOS FENOTPICOS DE IDENTIFICACIN BACTERIANA
Asas desechables
Portas
6. PROCESAMIENTO
6.1. PROCEDIMIENTO
a) Depositar una colonia en un porta, preferiblemente
de un medio sin sangre ( si el medio es agar sangre
no debe tocarse el agar). Para bacterias anaerobias
exponer las colonias al aire 30 antes de realizar la
prueba.
b) Aadir una gota del reactivo.
c) Lectura en 10-20 segundos (si es necesario, usar
lupa)
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA
- Manual de bioseguridad
- Manual de instrucciones del producto
4. MUESTRAS
Colonias bacterianas crecidas en medio de cultivo
slido
5. REACTIVOS Y MATERIALES
Tiras de papel absorbente con una zona reactiva que
contiene dicloruro de N,N-dimetil-1,4-
fenilendiamonio 0,1mol;1-naftol 1,0 mol.
6. PROCESAMIENTO
6.1. PROCEDIMIENTO
Depositar una colonia en la zona reactiva de la tira y
frotar con el asa.
Interpretar el resultado al cabo de 10-30.
8. RESPONSABILIDADES
Personal tcnico: realizacin de la tcnica, control y
conservacin de las muestras y reactivos.
Personal facultativo: supervisin de la tcnica,
resolucin de problemas y consultas. Validacin de
resultados.
4. MUESTRAS
Colonias de estreptococos beta-hemolticas crecidas
en medio de agar sangre o en medio CNA en cultivo
reciente (18-24 h).
Muestra de hemocultivo en el que se observan cocos
grampositivos en cadenas.
5. REACTIVOS Y MATERIALES
Disco de 0,04 U de bacitracina
Pinzas estriles
Asas de plstico desechables
Placas de agar con 5% de sangre de carnero
6. PROCESAMIENTO
6.1. PROCEDIMIENTO
Sembrar en agar con 5% de sangre de carnero y
colocar el disco en el centro con pinzas estriles
presionando para que el disco quede adherido al
agar.
Incubar a 35 2C, 5% CO2 18-24h.
PNT-ID-02
MTODOS MOLECULARES DE IDENTIFICACIN BACTERIANA
2+
1. PROPSITO Y ALCANCE - Taq polimerasa (comprobar que el Mg est
Descripcin de la metodologa necesaria para el incorporado a la solucin tampn). Pueden
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anlisis del ARNr 16S y de otros genes utilizados como sustituirse los ddNTPs, la taq, el Mg , y el buffer por
diana en la identificacin molecular bacteriana. reactivos comerciales que incluyen a todos estos
TM
Este procedimiento, basado en la reaccin en cadena reactivos, como por ejemplo, el PureTaq Ready-
de la polimerasa (PCR) y secuenciacin, es aplicable a la To-Go PCR Beads (Amersham BioSciences)
mayora de aislamientos bacterianos de origen clnico. - Cebadores (directo y reverso)
Sin embargo, puede suceder que segn la especie - Agarosa
bacteriana o el aislamiento en cuestin, sea necesario - Bromuro de etidio, concentracin 0,5 mg/L.
TM
realizar modificaciones. Alternativas menos txicas [GelRed Nucleic Acid
Gel Stain, a concentracin 0,3ml/L (Biotium)]
2. FUNDAMENTO - Marcador de peso molecular X (0,07-12,2 kpb) y/o de
La tcnica de identificacin mediante el ARNr 16S se 100 bp
basa en la utilizacin de cebadores universales - EDTA
diseados en diferentes zonas conservadas en - Azul de bromofenol (necesario para el aumento de la
bacterias, que permiten amplificar regiones variables densidad en la carga del producto de PCR en el gel
caractersticas de gnero y de especie. En ocasiones de electroforesis e indicador de la posicin del frente)
para el estudio del ARNr 16S o de otros genes tiles en - Lisozima
la identificacin a nivel de gnero, especie, subespecie, - Proteinasa K
genovariedades, serotipos, etc, es necesaria la - ARNasa
utilizacin de cebadores especficos. Tras la obtencin - SDS
de un nico producto de PCR (amplicn) se realizar la - Cloruro de magnesio
secuenciacin con idnticos o distintos cebadores de la - Cloruro de potasio
amplificacin. - cido actico glacial
La comparacin de las secuencias obtenidas con las - Fenol
disponibles en diferentes bases de datos y su - Cloroformo
interpretacin, permite la identificar el microorganismo. - Cloroformo-alcohol isoamilco
- Acetato amnico
El procedimiento consta de las siguientes etapas: - Etanol absoluto
- Extraccin del ADN cromosmico - Sistema comercializado de extraccin de ADN
- Amplificacin del ARNr 16S (rrs) u otros genes diana cromosmico. [QIAamp DNA Mini Kit, (Quiagen)] o
- Reaccin de secuenciacin similares
- Anlisis de las secuencias - Sistema comercializado de purificacin del producto
de PCR o de la banda de agarosa. [GFX PCR DNA
3. DOCUMENTOS DE CONSULTA and gel band purification kit (Amersham
- Manual de bioseguridad. Biosciences)], [ExoSAP-IT (usb, Affymetrix)] o
- Manuales de funcionamiento correspondientes a los similares
aparatos utilizados en este procedimiento. - Reactivos de secuenciacin, BigDye Terminator
- Bibliografa correspondiente a cada gen diana para la (Applied Biosystems), o el correspondiente al
identificacin molecular y al gnero/especie bacteriano/a secuenciador utilizado.
a estudiar.
6. APARATOS Y MATERIALES
4. MUESTRAS 6.1. APARATOS
Cultivo bacteriano puro crecido en medios de agar - Termociclador de tubos eppendorf de 0,5 o 0,2 ml
sangre, en medios generales o en medios - Vortex
enriquecidos. Es necesaria la ausencia de - Microcentrfuga para tubos eppendorf
contaminacin. - Balanza electrnica
En las ocasiones que se requiera, esta tcnica puede - Fuente y cubeta de electroforesis. Molde, peine
aplicarse sobre muestra directa sin realizar cultivo - Analizador de imgenes o en su defecto,
previo. Segn la universalidad o especificidad de los transiluminador de luz ultravioleta y cmara de
cebadores utilizados, ser necesario o no proceder a fotos
partir de muestra clnica con origen estril o con la - Termobloque o bao de ebullicin
presencia de una infeccin monomicrobiana. - Secuenciador ABI Prism 377(Perkin-Elmer, Applied
Biosystems Division, Foster City, CA) o similar
5. MEDIOS DE CULTIVO, REACTIVOS Y
PRODUCTOS 6.2. MATERIALES
- Medio de cultivo de agar sangre o medios sintticos - Asas bacteriolgicas
de crecimiento - Tubos eppendorf de 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml
- Medio de cultivo lquido Luria-Bertani (LB) - Pipetas de volumen variable y puntas estriles
- Agua destilada estril - Gradillas o soporte de tubos eppendorf
- Dinucletidos (ddNTPs) - Guantes de nitrilo
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Concentracin
Cantidad para 25 L de
Reactivos comercial ms Concentracin final
reaccin
frecuente
Agua destilada o
(16,5 X) L
1
desionizada estril
Buffer estndar de PCR 10 mM Tris-HCl + 50 mM
10X 2,5 L
KCl
MgCl2 15 mM 2,5 L 1,5 mM
Mezcla de dNTPs (dATP, 200 M de cada dNTP
10 mM 0,5 L
dCTP, dGTP, dTTP)
2
Cebador 5 M 1 L 100 nM
3
ADN Taq polimerasa 5 u/L 1 L 5 unidades
Volumen Final (25 X) L
X = L de ADN molde; Secuencias en las tablas 2 y 3; Una unidad se define como la cantidad de
1 2 3
enzima que es capaz de incorporar 10 nmol de dNTP en un material acido-insoluble en 30 minutos a 75C.
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Gen / Cdigo
Secuencia 5-3 Referencia
cebador
ARNr 16S
536F (A,S) CAGCAGCCGCGGTAATAC
Fenollar y cols,
Rp2 (A,S) ACGGCTACCTTGTTACGACTT
2006
M13d (A, S) GTAAAACGACGGCCAG
M13r (A, s) CAGGAAACAGCTATGAC
ARNr 16S
5F(A,S) TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTC Simmon y cols,
1194R (A,S) ACGTCATCCCCACCTTCCTC 2006
810R (A, S) GGCGTGGACTTCCAGGGTATCT
ARNr 16S
Bosshard y cols,
BAK11w (A,S) AGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG
2004
BAK2 (A) GGACTAC(C/T/A)AGGGTATCTAAT
ARNr 16S
16SFa (A,S) GCTCAGATTGAACGCTGG Harris y cols,
16SFb (A,S) GCTCAGGAYGAACGCTGG 2003
16SR (A,S) TACTGCTGCCTCCCGTA
ARNr 16S
E8F (A,S) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
E9F (A,S) GAGTTTGATCCTGGCTCAG
E334F (A,S) CCAGACTCCTACGGGAGGCAGC
E341F (A, S) CCTACGGGIGGCIGCA
Baker y cols,
E786F (A, S) GATTAGATACCCTGGTAG
2003
E533R (A, S) TIACCGIIICTICTGGCAC
E926R (A, S) CCGICIATTIITTTIAGTTT
E939R (A, S) CTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC
E1115R (A, S) AGGGTTGCGCTCGTTG
E1541R (A, S) AAGGAGGTGATCCANCCRCA
ARNr 16S
Bosshard y cols,
8s_20 (A,S) AGAGTTTGATCMTGGCTCAG
2002
536a_18 (A,S) GTATTCCGCGGCTGCTG
ARN 16S
Drancourt y
fD1 (A,S) AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
cols, 2000
Rp2 (A,S) ACGGCTACCTTGTTACGACTT
F:iniciador; R: inverso; (A,S): amplificacin, secuenciacin;
R=A/G; W=A/T; S=C/G; Y=C/T; K=G/T; N=A/G/C/T.
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7.2.2. Purificacin de los productos amplificados: Tabla 5. Secuenciacin del producto de PCR
Aplicacin de sistemas comercializados de purificacin
del producto de PCR o de la banda de agarosa [GFX Temperatura Tiempo N de
PCR DNA and gel band purification kit (Amersham ciclos
Biosciences)], [ExoSAP-IT (usb, Affymetrix)] o similares. Desnaturalizacin 94C 3 min. 1
inicial
7.3. SECUENCIACIN DEL ARNr 16S (rrs) Y OTROS Desnaturalizacin 96C 10 seg.
GENES DIANA Secuenciacin 55C 4min 5 25
Las condiciones de secuenciacin y amplificacin se seg
optimizarn en cada laboratorio para cada juego de Conservacin 4C indefinido 1
cebadores. Para la secuenciacin de cada gen diana, se
prepara la pre-mezcla de secuenciacin con el primer Finalizada la reaccin de secuenciacin se proceder
directo y se prepara la pre-mezcla de secuenciacin con segn las indicaciones correspondientes del fabricante
el primer reverso. Los componentes de la pre-mezcla de del secuenciador automtico.
la PCR de secuenciacin se indican en tabla 4.
7.4. ANLISIS DE LAS SECUENCIAS
Tabla 4. Pre-mezcla de componentes de la PCR de Se edita el electroferograma o cromatograma de la
secuenciacin secuencia obtenida, y se analiza visualmente la
presencia de ruido, ambigedades, y limpieza de las
Concentracin Cantidad para seales. Optimizada la secuencia, a continuacin se
Reactivos comercial ms 10L de alinea con otras secuencias depositadas en bases de
frecuente reaccin datos de acceso pblico: GenBank
Agua destilada o (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), le BIBI
(6,5 X) L
1
desionizada estril (http://pbil.univ-lyon1.fr/bibi/), Ribosomal Database
Buffer mix de Project European Molecular Biology Laboratory
1 L (http://www.ebi.ac.uk/embl/), Smart Gene IDNS (http:
secuenciacin
Mix de //www. smartgene.ch), Ribosomal Differentiation of
1,5 L Medical Microorganisms (RIDOM) (http://www.
secuenciacin
2
Cebador 5 M 1 L ridom.com/), Ribosomal Data-base Project (RDP-II)
Volumen Final 10 L (http://rdp.cme.msu.edu/html/); o privado como el
MicroSeq.
X = L de PCR molde, 2-3 L segn intensidad de
1
2
ADN. Secuencias en la tabla 2.
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MASAS