El uso de un medio adecuado, adecuado e industrial es tan importante como el

Despliegue de un microorganismo adecuado en microbiologa industrial. A menos

que el medio sea adecuado, no importa cun innatamente productivo sea el
organismo, no ser posible aprovechar los potenciales industriales completos del
organismo. De hecho, no slo se puede reducir la produccin del producto
deseado sino tambin producir materiales txicos. Los medios lquidos se emplean
generalmente en la industria porque requieren menos espacio, son ms
susceptibles a los procesos de ingeniera y eliminan el coste de proporcionar agar
y otros agentes slidos.

4.1 LOS REQUISITOS NUTRITIVOS BSICOS DE LOS MEDIOS

INDUSTRIALES

Todos los medios microbiolgicos, ya sean industriales o de laboratorio, deben

satisfacer las necesidades del organismo en trminos de carbono, nitrgeno,
minerales, factores de crecimiento y agua. Adems, no deben contener materiales
que sean inhibidores del crecimiento. Idealmente, sera esencial realizar un
anlisis completo del organismo que se va a cultivar, a fin de decidir cunto de los
diversos elementos deben aadirse al medio. Sin embargo, se dispone de cifras
aproximadas para los tres grupos principales de organismos heterotrficos
generalmente cultivados a escala industrial y pueden utilizarse en tales clculos
(Tabla 4.1).

Los requerimientos de carbono o energa se satisfacen usualmente a partir de

carbohidratos, especialmente (en experimentos de laboratorio) de glucosa. Debe
tenerse en cuenta que algunos organismos pueden utilizar carbohidratos ms
complejos tales como almidn o celulosa. Adems, las fuentes de energa no
necesitan limitarse a hidratos de carbono, sino que pueden incluir hidrocarburos,
alcoholes o incluso cidos orgnicos. El uso de estos ltimos sustratos como
fuentes de energa se considera en los Captulos 15 y 16 donde se discuten las
producciones de protena y levadura de una sola clula. Al componer un medio
industrial, el contenido de carbono debe ser adecuado para la produccin de
clulas. Para la mayora de los organismos, el peso del organismo producido a
partir de un peso dado de carbohidratos (conocido como la constante de
rendimiento) en condiciones aerobias es aproximadamente 0,5 g de clulas secas
por gramo de glucosa. Esto significa que los carbohidratos son al menos dos
veces el peso esperado de las clulas y debe ponerse como glucosa o su
compuesto equivalente.

El nitrgeno se encuentra en protenas incluyendo enzimas as como en cidos

nucleicos por lo tanto es un elemento clave en la clula. La mayora de las clulas
usaran amonaco u otras sales de nitrgeno. La cantidad de nitrgeno a aadir en
una fermentacin puede calcularse a partir de la masa celular esperada y de la
composicin media de los microorganismos utilizados. Para las bacterias, el
contenido medio de N es del 12,5%. Por lo tanto, para producir 5 g de clulas
bacterianas por litro se necesitaran alrededor de 625 mg de N (Tabla 4.1).

Debe aadirse cualquier compuesto de nitrgeno que el organismo no pueda

sintetizar. Los minerales forman porciones componentes de algunas enzimas en la
clula y deben estar presentes en el medio. Los principales elementos minerales
necesarios incluyen P, S, Mg y Fe. Los elementos de rastreo requeridos incluyen
manganeso, boro, zinc, cobre y molibdeno.

Los factores de crecimiento incluyen vitaminas, aminocidos y nucletidos y deben

agregarse al medio si el organismo no puede fabricarlos.

Bajo condiciones de laboratorio, es posible satisfacer el requerimiento del

organismo mediante el uso de productos qumicos purificados, ya que el
crecimiento microbiano generalmente se limita generalmente a unos pocos litros.
Sin embargo, a escala industrial, el volumen de la fermentacin podra ser del
orden de miles de litros. Por lo tanto, los productos qumicos puros no se utilizan
generalmente debido a su alto gasto, a menos que el coste del material acabado
justifique su uso. Los productos qumicos puros se utilizan sin embargo cuando los
medios industriales se estn desarrollando en el laboratorio. Los resultados de
tales estudios se utilizan en la composicin del medio industrial final, que se hace
generalmente con materias primas no purificadas. Los materiales extraos
presentes en estas materias primas no purificadas no siempre son una desventaja
y pueden ser responsables de la propiedad final y distintiva del producto. As,
aunque el alcohol parece ser el material deseado para la mayora de los
bebedores de cerveza, los otros materiales extraos a la maltosa (de la que las
levaduras fermentan el alcohol) ayudan a conferir a la cerveza su sabor distintivo
(Captulo 12).

CRITERIOS PARA LA ELECCIN DE MATERIAS PRIMAS UTILIZADAS EN

MEDIOS INDUSTRIALES

Al decidir las materias primas que se utilizarn en la produccin de determinados

productos utilizando microorganismos designados, debern tenerse en cuenta los
siguientes factores.

(A) Coste del material

Cuanto ms baratas sean las materias primas, ms competitivo ser el
precio de venta del producto final. No importa, por lo tanto, cun adecuadas
son las materias primas nutrientes, normalmente no se emplearn en un
proceso industrial si su costo es tan alto que el precio de venta del producto
final no es econmico. Por lo tanto, aunque la lactosa es ms adecuada
que la glucosa en algunos procesos (por ejemplo, la produccin de
penicilina) debido a la lentitud de su utilizacin, se suele reemplazar por la
glucosa ms barata. Cuando se utiliza, la glucosa se aade slo en
pequeas cantidades intermitentemente con el fin de desacelerar la
produccin de cido. Debido a estas consideraciones econmicas, las
materias primas utilizadas en muchos medios industriales suelen ser
residuos de otros procesos. El licor de maceracin de maz y la melaza
son, por ejemplo, productos de desecho de las industrias de almidn y
azcar, respectivamente. Se discutirn ms detalladamente a continuacin.
(B) Disponibilidad pronta de la materia prima
La materia prima debe estar fcilmente disponible para no detener la
produccin. Si es de temporada o importado, entonces debe ser posible
almacenarlo por un perodo razonable. Muchos establecimientos
industriales mantienen grandes existencias de sus materias primas para
este propsito. Las grandes existencias ayudan a superar el creciente costo
de las materias primas; Sin embargo grandes existencias significan que el
dinero que podra haber encontrado uso en otro lugar se gasta en la
construccin de grandes almacenes o almacenes y en asegurar que las
materias primas no son atacadas durante el almacenamiento por
microorganismos, roedores, insectos, etc. No siempre es fcil darse cuenta
de que el material utilizado debe ser capaz de almacenamiento a largo
plazo sin deterioro concomitante de la calidad.

C) Gastos de transporte
La proximidad de la industria usuaria al lugar de produccin de las materias
primas es un factor de gran importancia, ya que el coste de las materias
primas y del material acabado y, por tanto, su competitividad en el
mercado, pueden verse afectados por los costes de transporte. Cuanto ms
prxima sea la fuente de la materia prima al punto de uso, ms adecuada
ser para el uso, si todas las dems condiciones son satisfactorias.

D) Facilidad de eliminacin de los residuos resultantes de las materias

primas
La eliminacin de residuos industriales se controla rigurosamente en
muchos pases. Los materiales de desecho suelen ser utilizados como
materias primas para otras industrias. As, los granos usados de las
fbricas de cerveza se pueden utilizar como alimento para animales. Sin
embargo, en algunos casos no se puede utilizar ms para los residuos de
una industria. Su disposicin especialmente donde la intervencin
reguladora del gobierno es rgida podra ser costosa. Al elegir una materia
prima por lo tanto, el costo, si existe, de tratar sus residuos debe ser
considerado.
E) Uniformidad en la calidad de la materia prima y facilidad de
normalizacin
La calidad de la materia prima en trminos de su composicin debe ser
razonablemente constante para asegurar la uniformidad de calidad en el
producto final y la satisfaccin del cliente y sus expectativas. En los casos
en que los productores son abundantes, normalmente compiten para
asegurar el mantenimiento del requisito de calidad constante exigido por el
usuario. Por lo tanto, en la industria de la cerveza hay informacin
disponible sobre la calidad de la malta de cebada antes de ser comprada.
Esto se debe a que existe un gran nmero de productores de malta de
cebada y los productores intentan satisfacer las necesidades especiales de
la industria cervecera, su principal cliente. Por otra parte, la melaza, que es
una fuente importante de nutrientes para los microorganismos industriales,
es un producto de la industria azucarera, donde se considera como un
producto de desecho. La industria azucarera no se preocupa tanto por la
constancia de la calidad de la melaza como por la de la azcar. Por lo
tanto, cada lote de melaza debe ser analizado qumicamente antes de ser
utilizado en una industria de fermentacin con el fin de determinar cunto
de los diversos nutrientes debe ser aadido. Una materia prima con
extremos de variabilidad en la calidad es claramente indeseable ya que se
necesitan costes adicionales, no slo para el anlisis de la materia prima,
sino tambin para los nutrientes que pueden ser necesarios para alcanzar
la calidad habitual y esperada en el medio.
F) Composicin qumica adecuada del medio
Como se ha discutido ya, el medio debe tener cantidades adecuadas de
carbono, nitrgeno, minerales y vitaminas en las cantidades y proporciones
apropiadas necesarias para la produccin ptima del producto en cuestin.
Las exigencias de los microorganismos tambin deben cumplirse en
trminos de los compuestos que pueden utilizar. As, la mayora de las
levaduras utilizan azcares de hexosa, mientras que slo unos pocos
utilizarn lactosa; La celulosa no es atacada fcilmente y es utilizada
solamente por un nmero limitado de organismos. Algunos organismos
crecen mejor en uno u otro sustrato. Los hongos, por ejemplo, crecen
fcilmente en el licor de maz, mientras que los actinomicetos crecen ms
fcilmente en la torta de soja.
G) Presencia de precursores pertinentes
La materia prima debe contener los precursores necesarios para la sntesis
del producto acabado. Los precursores a menudo estimulan la produccin
de metabolitos secundarios aumentando la cantidad de un metabolito
limitante, induciendo una enzima biosinttica o ambas. Estos son
generalmente aminocidos, pero otras molculas pequeas tambin
funcionan como inductores. La naturaleza del producto acabado en muchos
casos depende en cierta medida de los componentes del medio. Por lo
tanto, las cervezas oscuras, como la cerveza negra, son producidas por la
malta de cebada caramelizada (o sobre-tostada) que introducen el color
oscuro en estas cervezas. De manera similar para la penicilina G a
producir, el medio debe contener un compuesto de fenilo. El licor de maz
que es el componente estndar del medio de penicilina contiene
precursores de fenilo necesarios para la penicilina G. Otros precursores
son el cobalto en los medios para la produccin de vitamina B12 y el cloro
para los antibiticos que contienen cloro, la clortetraciclina y la
griseofulvina.
H) Satisfaccin de las necesidades de crecimiento y produccin de los
microorganismos
Muchos organismos industriales tienen dos fases de crecimiento en el
cultivo por lotes: la fase de crecimiento, o la trofofase, y la fase de
produccin, o la idiofasa. En la primera fase, la multiplicacin celular tiene
lugar rpidamente, con poca o ninguna produccin del material deseado.
Es en la segunda fase que tiene lugar la produccin del material,
generalmente sin multiplicacin de clulas y siguiendo la elaboracin de
nuevas enzimas. A menudo estas dos fases requieren diferentes nutrientes
o diferentes proporciones de los mismos nutrientes. El medio debe ser
completo y ser capaz de satisfacer estos requisitos. Por ejemplo, altos
niveles de glucosa y fosfato inhiben la aparicin de la idiofasa en la
produccin de una serie de metabolitos secundarios de importancia
industrial. Los niveles de los componentes aadidos deben ser tales que no
afecten negativamente a la produccin. La relacin de trofofaseidiofase y
los metabolitos secundarios se discuten en detalle en el Captulo 5.
 ALGUNAS MATERIAS PRIMAS UTILIZADAS EN COMPUESTOS DE
MEDIOS INDUSTRIALES

Tabla 4.1Composicin media de microorganismos (% peso seco)

Revisin bibliogrfica
OPTIMIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS PARA
MICROORGANISMOS,
UNA VALIOSA ESTRATEGIA PARA LA PRODUCCIN
DE BIOPREPARADOS DE INTERS AGRCOLA
Gretel Gmez
RESUMEN. Los medios de cultivo constituyen el micromundo
de los microorganismos en condiciones de laboratorio, intentando
simular su hbitat natural en relacin con la satisfaccin
de sus ms vitales necesidades como ser vivo. El diseo de un
medio de cultivo responde a las exigencias del microorganismo
en cuestin y a la finalidad que se persigue con su multiplicacin;
por tanto, la seleccin y la concentracion adecuada de
los nutrientes es un factor de vital importancia. Sin embargo, el
empleo de una apropiada metodologa es lo que hace posible
la obtencin de un medio de cultivo ptimo, ya sea para el
crecimiento y/o la produccin de metabolitos por parte del
microorganismo. Existen numerosos mtodos y diseos de
optimizacin con dismiles caractersticas, ventajas y limitaciones
que determinan su empleo en las diversas ramas de la
investigacin. Se abordaron en el trabajo los diseos factoriales
completos y fraccionados, el Plackett Burman, el Box-Behnken
y el uniforme. La optimizacin de los componentes del medio y
de las condiciones ambientales garantiza notables incrementos
en los rendimientos de los procesos fermentativos de forma
rpida y econmica. Por tanto, esta revisin pretende abordar
los principios y mtodos de optimizacion, as como caracterizar
y ejemplificar la aplicacion de los diseos ms usados
en la optimizacin de medios de cultivos, con el fin de extender
su uso a la biotecnologa agrcola.

INTRODUCCIN
Los microorganismos necesitan
de condiciones bioqumicas y
biofsicas apropiadas para su desarrollo.
El principal objetivo de los
medios de cultivos es crear un ambiente
adecuado para el crecimiento,
simulando las condiciones lo ms
cercanas posibles a las naturales,
asegurando as el apropiado funcionamiento
de la maquinaria enzimtica
de los microorganismos (1), lo cual
implica un adecuado balance de los
componentes. Teniendo en cuenta
los requerimientos de cada microorganismo
en particular y de los fines
del investigador, se ha desarrollado
una gran variedad de medios de cultivo
con diferentes propsitos y usos.
El xito del diseo y la formulacin
de medios de cultivo para procesos
microbianos, est muy relacionado
con la aplicacin de conocimientos
bsicos acerca de los microorganismos
y sustratos.
Para el desarrollo de un medio
de cultivo es necesario seleccionar
adecuadamente los componentes a
usar. Esto incluye la seleccin del
tipo y la concentracin de los diferentes
nutrientes, como son: fuente
de carbono, energa, nitrgeno, fsforo,
factores de crecimiento, entre
otros, tambin de condiciones tales
como concentracin de oxgeno, temperatura
y pH (2).

Los estudios relacionados con

el diseo de nuevos medios de cultivo
para la obtencin de biopreparados
con fines agrcolas han sido numerosos.
Sin embargo, el empleo de
una apropiada metodologa estadstica
es lo que hace posible la obtencin
de un medio de cultivo ptimo,
ya sea para el crecimiento o la produccin
de metabolitos por parte del
microorganismo. En los procesos
fermentativos microbianos, es necesaria
la optimizacin del medio de
cultivo y las condiciones ambientales,
para explotar completamente el
potencial de las cepas seleccionadas
(3). De esta forma se garantiza
que el proceso sea lo ms econmico
y productivo posible.
Existen numerosos mtodos y
diseos estadsticos, que son aplicados
con xito en la optimizacin
de sistemas en diversas reas de la
investigacin, entre las que se encuentra
la microbiologa. No obstante,
el adecuado y extensivo uso de
estas herramientas estadsticas en
todas las vertientes de esta rama es
an una limitacin; por tanto, se pretende
abordar en este material los principios
y mtodos de optimizacion, as
como caracterizar y ejemplificar los
diseos ms usados en la
optimizacin de medios de cultivos
para microorganismos, con la finalidad
de extender su empleo a la
biotecnologa agrcola.

FORMULACIN Y OPTIMIZACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCIN:

Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los componentes, en 1)

medios sintticos o medios qumicamente definidos, y 2) medios complejos en cuya composicin
intervienen sustancias de origen animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura,
macerado de maz, harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya
mencionadas, pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable

No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los nutrientes que
pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes categoras de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estn representados por
las fuentes de C, N, S, P, K y Mg; b) Micronutrientes o elementos trazas representados por las
sales de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o
microgramos por litro; y c) Factores de crecimiento, que estn constituidos generalmente por
componentes orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados ni
metabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin metablica
especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no saturados, etc..

La formulacin tiene que ver con los aspectos cuantitativos de los medios, es decir debe
establecer las concentraciones de cada componente a ser utilizadas. Una primera aproximacin
con respecto a las cantidades a utilizar de las diversas fuentes lo da el conocimiento de la
composicin de biomasa del microorganismo a ser empleado. Una composicin elemental y
tpica de la biomasa es (en % de peso seco): Carbono, 46-48; Nitrgeno, 7-12; Fsforo, 1-3;
Azufre, 0.5-1.0; Mg, 0.5-1%. Es decir, que si queremos formular un medio para producir una
determinada cantidad de biomasa debemos proveer las distintas fuentes que aseguren como
mnimo las cantidades de elementos que deben ser suministrados.

Pueden ocurrir situaciones en las cuales sea imperativo la optimizacin de los medios de cultivo.
Entre ellas podemos mencionar las siguientes: 1) No existencia de informacin respecto a
coeficientes de rendimiento de macro y micro elementos para el cultivo del microorganismo
determinado. 2) Existencia de limitaciones nutricionales ocultas, especialmente de
microelementos y factores de crecimiento. 3) Uso de medios de cultivo conteniendo elementos
en exceso respecto de los requerimientos nutricionales del microorganismo en cuestin, que
pueden causar inhibicin del crecimiento. 4) Ensayo de sustancias estimulantes, activadoras e
inhibidoras del crecimiento y formacin del producto. 5) Empleo de fuentes nutricionales no
convencionales. La metodologa ms elemental consiste en realizar experimentos, en los cuales
se vara la concentracin del componente a ensayar mantenindose constante las
concentraciones de los dems ingredientes. Para organismos aerobios generalmente se utiliza
como sistema de cultivo erlen meyers agitados. En este caso, se analiza el efecto de la variable
escogida sobre la velocidad de crecimiento y la concentracin de biomasa obtenida.

Los medios de cultivo se clasifican en qumicamente definidos y complejos,

dependiendo de si su composicin es conocida o no. Es necesario un balance de
componentes elementales para proporcionar los nutrientes requeridos para obtener la
biomasa. Los microorganismos requieren para su crecimiento una fuente de energa y
una de carbono, en la mayora de las fermentaciones industriales una misma fuente
provee ambas, es necesario que la fuente de materia contenga todos los elementos
constitutivos de la masa celular en las proporciones requeridas para la composicin
interna del organismo (H2, C, S, P, Mg, Mn,Ca^e,Co,Zn,Cu,Mo). La
composicin celular depende del tipo de microorganismo, por ejemplo bacterias,
levaduras y hongos caen en el siguiente rango; carbn 45-55%, nitrgeno 6-14%,
potasio 0.5 - 2%, fsforo 1-3%, magnesio 0.1-1%, azufre 0.02-1%, calcio 1% (% en
peso seco). Tambin estn presentes minerales menores tales como cobre 0.1- 10 mg,
fierro 1 - 1 0 mg, zinc 1 mg y manganeso 0 - 5 mg. La formulacin del medio de cultivo
debe considerar todos los elementos antes mencionados adems de otros necesarios para
la produccin de metabolitos especiales (antibiticos, enzimas, etc.). Los constituyentes
se clasifican en grupos del A - D; el grupo "A" contiene todos los nutrientes necesarios
excepto nitrgeno (Glucosa, KH2P04, MgS04.7H20, CaCl2, Fe2(S04)3, ZnS04. 7H20,
CUSO4.7H2O, MnSO< .HjO), el grupo "B" provee nitrgeno en forma de ion amonio,
que es metabolizado por la mayora de los microorganismos y el anin fosfato provee
alguna capacidad buffer ((NH+hHjPO^ (Nl^HPCU). La funcin del grupo "C" un
quelato cuya formula general es C^HsNajO?. 2H2O, proporciona el ion metal en
solucin, este tambin causa efectos txicos sobre todo cuando el inoculo es pequeo.
La propiedad buffer de los componentes del grupo "D" es necesaria para mantener el
PH (NajHPCU, KH2PO4).
Los estudios cinticos son necesarios para entender el comportamiento de
cualquier fermentacin y consisten en la estimacin de las velocidades de sntesis
celular, formacin de productos y efectos del medio ambiente sobre stas velocidades.
El crecimiento unicelular de un cultivo esttico a nivel matraz o fermentado!", limitan
por la cantidad de substrato inicialmente, puede ser expresado en trminos de la
concentracin celular X, la del substrato limitante S y la del inhibidor I. En la cintica
tambin deben considerarse las condiciones de temperatura, fuerza inica y pH, que se
establecen al principio de la fermentacin y estas varan durante su transcurso a menos
que se controlen estrictamente, esto puede contribuir notablemente en el crecimiento
celular y los metabolitos secundarios que se produzcan (4,56,73,86).
Cuando a un microorganismo se le proporcionan los nutrientes necesarios y
las condiciones ambientales ptimas, realiza un conjunto de reacciones metablicas, las
clulas crecen y/o producen algunos metabolitos de inters. La conversin de substrato a
biomasa determina el rendimiento del crecimiento celular, generalmente cuanto ms
oxidado esta el substrato menor es el rendimiento (56,73).
En un cultivo microbiano se presentan diferentes fases de crecimiento: I Lag o de
retardo, aceleracin del crecimiento, m crecimiento exponencial, IV desaceleracin,
V estacionara y VI declinacin; estas fases reflejan cambios en la biomasa y en el
medio ambiente. Despus de un periodo lag el crecimiento ocurre a la mxima
 velocidad y finalmente cesa, como resultado del balance entre los siguientes factores:
carencia de un nutriente, acumulacin de un producto inhibitorio o algn cambio
fisicoqumico en el medio ambiente (56,73,86)
Cuando el crecimiento de un cultivo est limitado por la cantidad inicial de
substrato, la curva de crecimiento puede expresarse en trminos de parmetros de
crecimiento; la ecuacin de Monod describe la relacin entre la velocidad especifica de
crecimiento n y la concentracin del nutriente limitante S, en el cultivo.
dx ,, "jazl
Ecuacin de Monod : = fjx A* x. +5
dt
La concentracin celular X, se puede determinar por diferentes mtodos: el
nmero de clulas y la masa celular, dependiendo de las caractersticas fsicas de los
microorganismos, principalmente su tamao. Para microorganismos miceliales se
determina por peso seco (56,73, 86).
En la fermentacin se estudian los efectos de los siguientes factores: velocidad de
agitacin, aereacin, pH y temperatura; en muchos casos los instrumentos estn
conectados a una computadora y estudiar la dinmica de los cultivos. Un proceso de
fermentacin, comprende, adems de las reacciones bioqumicas efectuadas por un
microorganismo y/o por enzimas, las caractersticas fsicas y de operacin del recipiente
donde se va a realizar el proceso y las operaciones que se efectan antes y despus de
la fermentacin. El escalamiento de procesos es una tarea interdisciplinaria que requiere
del uso combinado e integrado de conceptos y mtodos de Ingeniera Qumica y
Fisiologa Microbiana. ( 14,16,73,89).

1. EXPLICACION DE TRABAJOS PRACTICOS -2007

MICROBIOLOGIA GENERAL- BIOQUIMICA

MEDIOS DE CULTIVO

INTRODUCCION

Las bacterias son organismos muy verstiles. Presentan un

gran potencial en su capacidad de utilizar disitntas fuentes de
alimentos, desde sustancias inorgnicas hasta materias orgnicas
sumamente complejas. Muchas especies han aprendido a crecer
en una amplia diversidad de nichos ecolgicos con temperatura,
acidez o tensiones de oxgeno extremas.
 Es muy difcil estudiar microorganismos en forma individual; lo
ms prctico es trabajar con poblaciones de los mismos. Para
lograr estas poblaciones es necesario disponer de un medio
artificial que brinde a los microorganismos todos los
requerimientos nutricionales para desarrollarse. Este ambiente
artificial se denomina MEDIO DE CULTIVO.

* MEDIO DE CULTIVO es toda preparacin artificial, slida,

semislida o lquida que suministra al microorganismo cada una
de las sustancias fundamentales, una fuente de energa y
condiciones ambientales adecuadas para la sntesis y
mantenimiento de su protoplasma.

CULTIVOS: son las poblaciones de microorganismos que

se obtienen en los medios de cultivo.
Los cultivos pueden ser:
a) puros o axnicos, cuando la poblacin est constituida
por una nica clase de microorganismos.
b) mixtos, cuando la poblacin est constituida por ms de
una clase de microorganismos.

En la actualidad, la mayora de los grmenes patgenos se

pueden cultivar fuera de su hbitat natural. Ciertos parsitos
obligados como las Rickettsias, nunca han podido cultivarse en
medios artificiales; requieren clulas vivas, cultivos de tejidos o
embriones de pollo.

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS SEGN LA FUENTE

DE ENERGIA Y CARBONO QUE UTILIZAN
Al disear un medio de cultivo es importante conocer los
requerimientos de energa y carbono de las especies a cultivar.
 - Fuente de energia, puede ser:
- luz: energa luminosa que se
convierte en energa qumica. Los microorganismos que utilizan
esta fuente de energa se denominan fototrofos.
- reacciones de oxido-reduccin a
partir de compuestos qumicos inorgnicos u orgnicos. Los
microorganismos que utilizan esta fuente de energa se
denominan quimiotrofos.

Todos los organismos requieren una fuente de energa para

obtener ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno
de los siguientes metabolismos:

- respiracin aerobia: aceptor final de electrones O2

- respiracin anaerobia: aceptores finales de electrones: NO3-,
SO4=, CO2, fumarato
- fermentacin: conjunto de reacciones donde compuestos
orgnicos sirven como donadores y receptores de
electrones. Se produce ATP por fosforilacin a nivel de
sustrato.
- Fotosntesis

- Fuente de carbono, puede ser:

- CO2: los microorganismos que
utilizan esta fuente de carbono se denominan autotrofos.
- compuestos orgnicos carbonados
(azcares, aminocidos, cidos grasos, etc). Los microorganismos
que utilizan estas fuentes de carbono se denominan heterotrofos.

De la combinacin de estas categoras surge la sig. clasificacin

de microorganismos:
Fuente de energa Fuente de carbono Categora
Ejemplos

Luz CO2 Fotoautotrofos Algas,

cianobacterias

acetato Fotoheterotrofos
Alg. bacterias

Reacciones CO2 Quimiolitotrofos

Bacterias oxidantes de
de xido-reduccin
H2, del azufre, de Fe2+
compuestos orgnicos
Quimioorganotrofos Hongos, bacterias

Fotoautotrofos = fotolitotrofos
Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos

COMPOSICION QUIMICA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cuando se disea la frmula del medio de cultivo, es necesario

conocer en qu categora est incluido el microorganismo a
cultivar para elegir acertadamente los componentes del medio:
generalmente compuestos inorgnicos para microorganismos
fototrofos y quimiolitotrofos, y orgnicos para quimioorganotrofos.

Un medio de cultivo est integrado por:

1. Elementos energticos y constitutivos:

a) Macroelementos (g/l):
Fuente de carbono: puede ser CO2 compuestos
carbonados orgnicos. Se utilizan en la construccin de
innumerables molculas necesarias para la clula. Los
hidratos de carbono se consideran fuente de carbono y
energa por excelencia en los quimioorganotrofos. Los
ms comunes son:
- hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;
- pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;
- disacridos como lactosa, sacarosa, maltosa;
- trisacridos como rafinosa;
- polisacridos como almidn, glucgeno;
- alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y
- glucsidos como salicina, y esculina.
Fuente de nitrgeno: muchos organismos son autotrofos
respecto de la fuente de nitrgeno y pueden crecer
utilizando molculas sencillas como NO 3-, NH3 N2. El
nitrgeno es metabolizado para proveer protenas, cidos
nucleicos y polmeros de pared. Otros microorganismos
pueden incorporar nitrgeno en forma de aminocidos,
bases pricas o pirimdicas.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos,
el aporte de nitrgeno es realizado por las peptonas,
que son los productos de la hidrlisis cida o enzimtica
de protenas de origen animal o vegetal (carne, soja,
casena, gelatina, harina de maz y girasol). Esos
productos de hidrlisis pueden tener longitud variable,
desde aminocidos, hasta dipptidos, tripptidos,
polipptidos, albumosas, proteosas.
 La hidrlisis cida puede ser realizada con HCl H 2SO4 y
presenta las siguientes desventajas:
- el triptofano se destruye
- se pierde el 10% de vitaminas presentes
- desaparecen casi completamente los polipptidos
Se prefiere la hidrlisis enzimtica que emplea diferentes
proteasas actuando a pH especficos, ej. papana a pH
6.5, tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.
Las peptonas son fuente de nitrgeno y, en ausencia de
hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo,
cumplen la funcin de fuente de carbono y energa.
Aportan vitaminas del grupo B, trazas de metales y
fosfatos que dan carcter buffer al medio.
Las peptonas de origen vegetal pueden aportar
carbohidratos fermentables.
Fuente de fsforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o
potasio que tambin confieren poder buffer al medio de
cultivo (pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al
medio de cultivo, el aporte de P es realizado por los
glicerofosfolpidos de la yema. El fsforo se incorpora a
cidos nucleicos, fosfolpidos, polmeros de membrana,
ATP, y sustancias de reserva (grnulos de volutina)
Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o
metionina. En la clula se incorpora a aminocidos y
diferentes coenzimas.
Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y
magnesio se adicionan como sales inorgnicas. Son
cationes que estabilizan macromolculas aninicas. K +
acta como coenzima y estabilizador de RNA. Mg 2+ se
integra a colorofila en organismos fotosintticos. Ca 2+
abunda en esporas como dipicolinato de calcio.
Fuente de sodio: sodio contribuira a equilibrar la presin
osmtica del medio extracelular. Es un catin requerido
por bacterias haloflicas. Se suele suministrar como NaCl.
 b) Microelementos o trazas (mg ug/ml): suelen estar
naturalmente presentes como contaminantes de los
macroelementos.
* Frecuentemente esenciales:
Mn: estimula el crecimiento, favorece la esporulacin.
Fe: cofactor de enzimas para la funcin respiratoria en
citocromos, catalasa y flavoprotenas. En adecuada
concentracin favorece la sntesis de toxina diftrica.
Co: interviene en la sntesis de vitamina B 12.
Cu: presente en oxidasa terminal de la cadena
respiratoria.
Esenciales en casos especiales: B, Al, Si, V, As, Se, Mo,
Sn, Be, F, etc.
Inhibidores del crecimiento: Au, Ag, Cd, Cr, Pb, y
cualquier microelemento a concentracin mayor que 10 -4
M puede resultar txico para el desarrollo de los
microorganismos.

2. Factores de crecimiento
Son compuestos orgnicos especficos requeridos en muy
bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por
la clula que los necesita. Por esta razn, deben ser
agregados al medio de cultivo. Ej.: principalmente
vitaminas del grupo B, algunos aminocidos, purinas,
pirimidinas, cidos grasos. Hay ejemplos clsicos como los
factores X y V (porfirinas) de la sangre requeridos por la
bacteria Haemophilus influenzae para crecer. El suero fetal
bovino, que aporta numerosos factores de crecimiento, es
imprescindible para el cultivo de clulas animales.
Cmo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La
capacidad de sintetizar un compuesto esencial est
relacionada con una secuencia de reacciones catalizadas
por enzimas que se completa satisfactoriamente. Cuando
 por alteraciones genticas, alguna enzima de la secuencia
no puede ser sintetizada, la serie de reacciones se bloquea
en algn paso y no finaliza con xito. El compuesto que por
esta razn dej de sintetizarse, se convierte en un factor
de crecimiento.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los
factores de crecimiento pueden ser aportados por diversos
extractos:
-Extracto de carne: su funcin es ser complemento
vitamnico de las peptonas. Pero tambin aporta sustancias
nitrogenadas como: aminocidos, bases pricas y
pirimdicas, cidos orgnicos, creatina, xantina,
hipoxantina, cido rico, urea, y sustancias no nitrogenadas
como glucgeno, fosfatos de hexosas, cido lctico, sales
inorgnicas.
La calidad de este tipo de extracto vara con la carne
empleada, el tiempo y la temperatura de extraccin.
-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis
de las clulas de levadura. Su funcin es ser suplemento
vitamnico de las peptonas, pero tambin aporta mezclas
de aminocidos y pptidos, y carbohidratos.
-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto
de levadura ya que posee adecuado contenido de
vitaminas, carbohidratos y aminocidos. Es el extracto
soluble en agua de la malta de cebada.

3. Agentes solidificantes
Su agregado al medio de cultivo es opcional.
El ms usado:
- el agar, es un polisacrido cido derivado de algas
marinas, formado principalmente por galactosa con un
grupo sulfato cada 10 a 50 restos. Suele contener
sustancias nutritivas en pequeas concentraciones, y por
 esto no puede ser utilizado en medios de composicin
qumica estrictamente definida destinados a autotrofos. Se
usa sin problemas en medios de cultivo complejos para
quimioorganotrofos.
Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia slida
normal, al 0.2-0.3% en medios semislidos o blandos, al 5%
en medios de consistencia muy firme para detener el
crecimiento de grmenes muy mviles, y al 0% cuando se
preparan medios lquidos (caldos).
Sus caractersticas:
- Funde a 80-100C y permanece lquido hasta 50-55C.
- A 45-55C se pueden agregar suspensiones de clulas sin
afectar la viabilidad (supervivencia) de las mismas.
- Permanece slido a 37C, temperatura de incubacin de la
mayora de las bacterias patgenas del hombre.
- No es txico para las bacterias, ni es degradado por stas.
- Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias
(poblaciones de microorganismos derivadas de una nica
clula), lo que resulta imposible en medios lquidos!
- Es transparente, lo que facilita la visualizacin de las
colonias.
- Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para
permitir la difusin de los nutrientes del medio de cultivo en
todas direcciones, y suficientemente cerrada segn la
concentracin empleada- para impedir la movilidad de los
microorganismos.

Otros solidificantes:
- Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa
intensamente para fines especficos en Inmunologa y
Biologa Molecular.
- Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de
cultivo para autotrofos, cuando debe excluirse materia
orgnica del medio de cultivo.
- Gelatina: es una protena obtenida por hidrlisis del
colgeno. Fue el primer solidificante usado en
Microbiologa, pero es degradado por la mayora de las
 bacterias (lo comen, por lo que el medio inicialmente slido
termina convertido en medio lquido) y la temperatura de
incubacin no puede ser mayor a 22C (es el punto de
fusin) con lo que cultivos slidos a temperaturas ms altas
resultan inviables.
- Albmina de huevo, suero: a 80C estas protenas coagulan
y solidifican el medio de cultivo.

4. Agua
El agua representa una altsima proporcin (80-90%) del
peso total de una clula y es fundamental para la
realizacin de todos los procesos metablicos, funciones
enzimticas, solvatacin de materiales orgnicos e
inorgnicos, donacin de electrones para organismos
fotosintticos. Los medios de cultivo se preparan en el
laboratorio con agua destilada lo que estandariza su
composicin y asegura la ausencia de iones como Ca 2+ y
Mg2+ que pueden precipitar con fosfatos o generar
reacciones indeseables.

CONDICIONES FISICAS DE UN MEDIO DE CULTIVO

An cuando las condiciones qumicas del medio de cultivo

estn cubiertas, el crecimiento y desarrollo de los
microorganismos no tendr lugar si se desconocen las siguientes
condiciones fsicas:

- temperatura: cada especie tiene su temperatura ptima de

crecimiento.
* mesfilos: 35-37C
* psicrfilos: 15-20C
* termfilos: 50-60C
-presin osmtica: la mayora de las bacterias crece en 0.1 a 1%
NaCl. Las halfilas requieren concentraciones superiores.
-presencia de oxgeno: segn sus requerimientos de O2 las
bacterias se clasifican en:
* aerobios estrictas: requieren oxgeno para crecer.
Metabolismo respiratorio.
* microaerfilos: necesitan bajas tensiones de O 2 y
una atm enriquecida en CO2. Pueden
realizar respiracin aerobia.
*anaerobios obligados: el O2 les resulta txico.
Crecen en medios muy reducidos (sin O2).
Metabolismo fermentativo.
* anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de
O2 (metabolismo fermentativo) y
cuando son expuestos al O2 no
mueren.
*anaerobios facultativos: pueden crecer en
condiciones aerobias (metabolismo respiratorio)
como anaerobias (metabolismo
fermentativo).

-humedad: todas bacterias necesitan un ambiente mucho ms

hmedo para su desarrollo que los hongos. En condiciones
ambientales adversas, algunas especies producen estructuras de
resistencia a la desecacin llamadas esporas que permanecen
viables durante tiempo prolongado hasta que el ambiente sea
propicio para la germinacin. Producen esporas los gneros
Clostridium (ej. C. tetani,, C. botulinum), Bacillus (ej. B. cereus, B.
subtilis), Sporosarcina, entre otros.
- luz: es importante para los microorganismos fotosintticos.
-pH: la mayora de las bacterias crece en medio neutro o
ligeramente alcalino (7 7.6). Excepciones son los lactobacilos
(pH 5, acidfilos), Vibrio cholerae (pH 8.6,). Los hongos crecen a
pH menor que 7.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

a) Por su consistencia (esto depende de la inclusin o no de un

agente solidificante)

-lquidos (no permiten el aislamiento de

colonias)
-slidos (permiten el aislamiento y observacin
de colonias)

b) Por su origen (esto depende de que la frmula se pueda

describir qumicamente con precisin)

-sintticos: estrictamente definidos desde el

punto de vista qumico, generalmente
se usan para cultivar fototrofos y
quimiolitotrofos.
-naturales o complejos: se preparan a partir de
sustancias naturales de origen ani-
mal o vegetal de composicin
qumica no rigurosamente
constante: leche, suero,
macerado de maz, peptonas, ex
 tractos de carne, levadura. Son
aptos para el cultivo de
quimioorganotrofos. Son los
que prepararemos y usaremos
en el Laboratorio de
Microbiologa.
c) Por su composicin:
- comunes: incluyen una frmula nutritiva bsica que
permite el crecimiento de microorganismos poco exigentes.
- enriquecidos: mejoran su calidad nutritiva por el
agregado de componentes muy ricos
como leche, sangre, huevo, lquido asctico, extracto
proteico de cianobacterias. Se utilizan en el cultivo de
bacterias exigentes.

d) Por su funcin:
- Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que
sembrados con poblaciones mixtas de microorganismos,
favorecen la multiplicacin de ciertos grupos e inhiben el
desarrollo de las especies restantes. Para funcionar de esta
manera incluyen compuestos qumicos especficos o requieren
condiciones fsicas especiales (temperatura, pH).
Ej.: agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de Vibrio
cholerae tolerante a pH alto e inhibe otros microorganismos
presentes en la misma muestra; caldo selenito contiene selenito
de sodio que favorece la proliferacin de especies como
Salmonella y Shigella pero inhibe otras enterobacterias; caldo EC
a 44.5C, una temperatura que favorece a Escherichia coli y no a
otras bacterias.
- Medios selectivos: son medios slidos que de manera
parecida a los anteriores, permiten el desarrollo de ciertos
microorganismos e impiden el desarrollo de otros. La selectividad
se logra alterando las condiciones fsicas del medio de cultivo o
agregando compuestos qumicos inhibidores. Ej:
- cambiando pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus,
un gnero implicado en la produccin de yogur, se puede agregar
cido actico a los medios de cultivo para obtener un pH final de
5.4, totalmente inadecuado para muchas bacterias
acompaantes.
- altas concentraciones osmticas: en agar manitol salado con
una concentracin de NaCl de 7.5% muy pocas bacterias pueden
crecer, salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl,
como Staphylococcus aureus
- agregando antispticos: colorantes como verde brillante,
cristal violeta y eosina, se utilizan para inhibir grmenes Gram
positivos mientras los Gram negativos desarrollan sin dificultad.
Las sales biliares se usan con el mismo propsito.
- agregando antibiticos: en Ingeniera Gentica es prctica
rutinaria la inclusin de antibiticos (ampicilina, tetraciclina) en
los medios de cultivo para poner en evidencia la presencia de
bacterias genticamente manipuladas. Estas clulas son
resistentes a uno o ms antibiticos y pueden desarrollar en un
medio que los incluye, mientras las clulas acompaantes,
sensibles a los antibiticos, no pueden crecer. En Microbiologa
Clnica, se usan antibiticos de espectro de accin reducido que
inhiben o destruyen microorganismos cuyo estudio no interesa, a
la vez que no afectan los grmenes que se estn investigando.

-Medios diferenciales: permiten demostrar caractersticas

metablicas de un determinado grupo de microorganismos. Por
ej.: puede el germen A utilizar glucosa por una va fermentativa?
Si agregamos glucosa a un medio de cultivo slido y un indicador
de pH que indique por cambio de color si el azcar ha sido
fermentado o no, estaremos analizando una caracterstica
metablica de A. Existen medios diferenciales donde se pueden
detectar varias caractersticas metablicas distintas. La clave es
incluir en la frmula del medio de cultivo a usar: , el sustrato
adecuado para la caracterstica metablica que se desea estudiar
y un sistema indicador que refleje por variacin de color u otro
fenmeno perceptible, los cambios que hayan tenido lugar. Las
pruebas bioqumicas que veremos en los Trabajos Prcticos son
claros ejemplos de medios de cultivo diferenciales.

-Medios de transporte: se usan cuando se transcurre cierto

tiempo entre la toma de una muestra y su procesamiento. Incluye
compuestos que aseguran la supervivencia de las clulas hasta
que sean sembradas en un medio de cultivo adecuado.

IMPORTANTE: un gran nmero de medios de cultivo tienen

funciones mixtas. Ej.: puede ser enriquecido porque lleva sangre y
selectivo porque incluye algn antibitico. Puede ser selectivo
porque incluye inhibidores y diferencial porque pone en evidencia
propiedades metablicas.

EJERCICIOS DE APLICACIN

1. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qu

componentes tendra en cuenta para disear un medio de
cultivo qumicamente definido o sinttico que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de energa:
- fuente de nitrgeno:

2. Para un microroganismo quimioorganotrofo qu componentes

tendra en cuenta para disear un medio de cultivo complejo o
qumicamente indefinido que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de nitrgeno:
 - fuente de energa:
3. En el Trabajo Prctico tendremos ocasin de preparar algunos
de los siguientes medios de cultivo:
a) Caldo nutritivo
Extracto de carne. 0.3 g a.1. Qu aporte realiza
cada componente?
Peptona de carne . 0.5 g a.2. Si no hay hidratos
de carbono, qu componente aporta C?
NaCl . 0.5 g a.3 Cul es la fuente
de energa en el medio de cultivo?
Agua destilada. 100 ml a.4. Clasifique este
medio por su consistencia, origen y composi-
pH: 7- 7.2 cin. Qu clase de
microorganismos segn fuente de C y
energa- creceran en l?
b) Agar nutritivo
Extracto de carne. 0.3 g b.1. Qu aporte realiza
cada componente?
Peptona de carne . 0.5 g b.2. Qu componente
aporta los factores de crecimiento?
NaCl . 0.5 g b.3 Cul es la fuente
de energa en el medio de cultivo?
Agar . 1.5 g b.4. Clasifique este
medio por su consistencia, origen y composi-
Agua destilada. 100 ml cin. Qu clase de
microorganismos segn fuente de C y
pH: 7 -7.2 energa- creceran en l?
c) Medio BW3
K2HPO4 ... 0.25 g c.1. Mencione fuente
de carbono y fuente de nitrgeno
CO2 burbujeo constantec.2 Cul sera la
fuente de energa?
MgSO4 ... 0.0375 g c.3. Por su consistencia y
su origen, cmo clasificara este medio?
Na2MoO4... 2.5 x 10-3 g c.4. Para qu clase de
grmenes segn fuente de C y de energa-
NaVO3 .. 1.24 x 10-4 g sera adecuado?
KNO3 . 1 g
Agua destilada 1000 ml

d) Cul de los siguientes componentes agregara a un medio de

cultivo comn para convertirlo en un medio enriquecido?
- agua destilada -penicilina -suero fetal
bovino -colorantes
- sangre de oveja -leche -extracto
proteico de cianobacterias
-sales biliares -antispticos -yema de huevo
-agar

e) Se desea propiciar el desarrollo de un grupo A de

microorganismos quimioorganotrofos, acidfilos y resistentes a
penicilina, incluidos en una poblacin mixta formada por los
grupos A, B y C. Los grupos B y C pertenecen a flora
acompaante.
e.1. Qu medio de cultivo sera ms adecuado para lograr ese
propsito? (marque la/s respuesta/s correcta/s)
- un medio de transporte - un medio enriquecido
-un medio de enriquecimiento - un medio selectivo
-un medio slo diferencial
e.2. Disee un medio de cultivo complejo semislido que incluya
una fuente de C, una fuente de energa, una fuente de N y
factores fsicos y/o qumicos que favorezcan slo el desarrollo del
grupo A.