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T.P.
T P N 5
Pruebas Bioqumicas
q

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Especie bacteriana: coleccin

l i de d cepas que comparten
t propiedades
i d d estables
t bl y difieren
difi
significativamente de otros grupos de cepas.

Asociacin DNA-DNA (>70%)

Porcentaje de similitud rRNA 16S (>97%)

IDENTIFICACION DE UN MICROORGANISMO

Pruebas bioqumicas: Ensayos que ponen de manifiesto caractersticas metablicas

de los microorganismos.

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Catalasa
Oxidasa
Hidrlisis de almidn
Motilidad
Sensibilidad a antibiticos

IMViC
Pruebas bioqumicas para la
Agar Hierro-Dos azcares de Kligler identificacin de
API 20E enterobacterias

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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)

Vibrio
Aeromonas
Pseudomonas

Escherichia coli

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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)

Se utiliza un donor de
electrones artificial (tetrametil-
(tetrametil
p-fenilenediamina).

Reaccin + Reaccin -
Vibrio Enterobacterias
Aeromonas
Pseudomonas

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Prueba de la Catalasa

Perxido
i de hidrgeno
i Compuesto producido en pequeas cantidades
durante la respiracin aerbica. Su produccin
est mediada por flavoprotenas.

Radical hidroxilo Radical libre altamente reactivo. Agente

oxidante capaz de atacar cualquier molcula
orgnica presente en la clula.

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Prueba de la Catalasa

Enzimas que actan sobre Catalasa

los derivados txicos del
Enzimas que destruyen el perxido de
oxgeno:
hidrgeno.
Peroxidasa

Superxido dismutasa Enzima que destruye el anin

superxido
p ( )).

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Prueba de la Catalasa
- +

Reaccin + Bacillus
Aerobios estrictos o Staphylococcus
Ensayo: facultativos
Enterobacterias
Se toman bacterias de un cultivo
slido y se esparcen con ansa sobre
una gota de perxido de hidrgeno
30%.

Reaccin - Clostridium
S
Streptococcus
Anaerobios estrictos o
microaerfilos Lactobacillus

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Hidrlisis de almidn

amilasa: Enzima qque hidroliza los enlaces (1-4)

-amilasa: ( )
de polmeros de glucosa.

- +
Reaccin +
(Halo transparente)

Agregado de B ill
Bacillus
Lugol

Agar - almidn

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Motilidad
Se detecta la presencia de flagelo bacteriano.

Se cultivan las bacterias por puncin en

placas de agar blando.

Se observa migracin como un halo desde

el punto de siembra.

Bacterias mviles Bacterias no mviles

Pseudomonas Staphylococcus
Bacillus
Enterobacter
Vibrio

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Sensibilidad a antibiticos

Mecanismos de accin
Inhibicin de la sntesis de la pared (Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina,
Cefalosporinas, Vancomicina, etc.)

Inhibicin de la sntesis de protenas (Streptomicina, Gentamicina,

Cloranfenicol, Tetraciclina, etc.)

Inhibicin de la snteis de cidos nuclicos (Ciprofloxacina, Rifampicina, etc.)

Disrupcin de la membrana (Polimixina B)

Antagonistas metablicos (Sulfonamida, Trimetoprima)

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Sensibilidad a antibiticos

MIC (concentracin inhibitoria mnima)

Anlisis de
sensibilidad a
MLC (concentracin letal mnima)
antibiticos

Anlisis de difusin en agar

(sistema de discos)

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Sensibilidad a antibiticos
Metodologa de trabajo:
Se crecen cultivos en medio lquido.

Se mezcla el cultivo con agar blando (0,7%) y se vuelca sobre una placa de agar nutritivo.

Se depositan discos con diferentes antibiticos.

Se mide el diametro del halo de inhibicin.

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Pruebas bioquimicas para la

identificacin de Enterobacterias
Cocobacilos Gram negativos
Aerobios facultativos (Catalasa positivos)
Fermentadores de Glucosa
Oxidasa negativos

1) IMViC
a)) Prueba del Indol
b) Rojo Metilo
c) Voges Proskauer
d) Prueba del citrato

2) Agar Hierro Dos Azcares de Kligler

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1)) IMViC
a) Prueba del Indol
Indol: Subproducto de la degradacin del aminocido Triptofano
por la enzima triptofanasa.

Reaccin Reaccin +
Cultivar la bacteria en caldo de peptonas
Formacin de una fase Formacin de una fase
(alto contenido de Triptofano ) por 48 h.
orgnica amarilla orgnica roja
Agregar al cultivo cinco gotas de reactivo
de Kovacs (dimetilaminobenzaldehdo).

El reactivo de Kovacs reacciona con el

indol dando un producto de color rojo.
Salmonella E. coli
Enterobacter Proteus
Klebsiella

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Fermentacion:

Tipos de Fermentacin

1) Lctica
2) Alcohlica
3) Propinica
4) Butilengliclica
5) cido Mixta
6) Aceto-Butrica

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F
Fermentacin
t i Butilengliclica
B til li li

Enterobacter
Serratia
Erwinia
Bacillus

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Fermentacin cido

Mixta

Escherichia, Salmonella,
Proteus, etc.

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1)) IMViC
b) Rojo de Metilo

Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de realizar

f
fermentacin
i cido-mixta.
id i

Rojo de Metilo: Indicador de pH que vira al rojo por debajo de 4,3

Se inocula medio RM
RM-VP
VP Reaccin Reaccin +
(Amarillo) (Rojo)
Incubacin 48h a 37C

Se agregan 3 gotas de Rojo de

Metilo 0,1%.

Enterobacter E. coli
Klebsiella

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1)) IMViC
c) Voges Proskauer

Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de producir

acetilmetilcarbinol
il il bi l (acetona)
( ) a partir
i de
d la
l frementacin
f i butilengliclica
b il li li de d la
l
glucosa.

Se inocula medio RM-VP

Reaccin Reaccin +
Incubacin 48h a 37C

Se agregan 0,6 ml de reactivo de Barrit

(
(-naftol,
f l vira
i all rojo
j all reaccionar
i con la
l
acetona) y 0,2 ml de KOH 40%.

E. coli Enterobacter
Klebsiella

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1)) IMViC
d) Prueba del Citrato
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de utilizar
citrato como nica fuente de carbono.
carbono

Estriar agar citrato de Simmons (contiene Azul de

b
bromotimol
ti l como indicador
i di d de
d pH).
H)
Incubacin 48h a 37C
Reaccin Reaccin +
Sin cambio (medio de Crecimiento y viraje al
color verde). azul (la eliminacin del
citrato alcaliniza el
medio).

E. coli Salmonella
Shigella
g Enterobacter
Klebsiella

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1)) IMViC

I M V C
_ _
Escherichia coli + +
_ _
Proteus mirabilis + +
_ _
Salmonella + +
_ _
Enterobacter + +
_ _
Kl b i ll
Klebsiella + +

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2)) Agar
g Hierro-Dos azcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.

Peptona de
d carne A partir del consumo de peptonas se libera NH3 produciendo
una alcalinizacin del medio.
Lactosa y Glucosa La fermentacin de estos sustratos produce compuestos
(10:1) cidos.

Tiosulfato de sodio.
Citrato de hierro y amonio. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de
hidrgeno, el cual reacciona con la sal de hierro
produciendo sulfuro de hierro (precipitado negro) .

Rojo fenol Vira al amarillo en medio cido.

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2)) Agar
g Hierro-Dos azcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.

Se inocula el medio por

puncin y estra en
superficie.
superficie

Incubacin 24h a 37C

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2)) Agar
g Hierro-Dos azcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.

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API 20E

Sistema ppara la identificacin rpida

p de enterobacterias.

Dispositivo plstico con tubos que contienen medios deshidratados.

Se inocula cada minitubo con una suspensin del microorganismo a analizar y se

incuba 24 hs a 37C en una atmsfera hmeda.
Al cada resultado se le asigna un cdigo que da como resultado un nmero de 7
cifras q
que se compara
p con tablas o bases de datos para
p la identificacin de la
especie..

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API 20E

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