Universidad del Valle de Mxico

Campus Monterrey Norte

Qumico Farmacutico Biotecnologo

Laboratorio de Biotecnologa de Alimentos

Practica #1: Produccin de vino tinto

Maestro: Jos David Melgoza De la Fuente

Ricardo Pacheco Guevara

Matricula: 870020667
Objetivo

Elaborar vino tinto por fermentacin usando una cepa de Saccharomyces cerevisae.

Fundamento

El pigmento rojo responsable del color de los vinos tintos debe ser extrado de la cascara de
la uva, antes de separarla del mosto. Por lo tanto, despus de la trituracin, se mantienen
juntos el mosto y los residuos de fruto, a esta mezcla se le llama macerado.

Los pigmentos se logran disolver por calentamiento controlado o con la ayuda de alcohol
proveniente de la fermentacin. Los mtodos de extraccin del color permiten que junto
con las sustancias generadoras del color se disuelvan los taninos. Estos compuestos le
proporcionan al vino tinto su sabor peculiar, aunque, su presencia no debe ser muy alta,
pues tienen mayor aceptacin los vinos suaves, por su baja astringencia. Sin embargo, el
aumento en la temperatura necesario para lograr la disolucin de los colorantes hace, a la
vez, que la fermentacin ocurra ms rpidamente y, por lo tanto, la concentracin de
taninos no se eleva a valores perjudiciales. La temperatura ptima para la fermentacin de
los vinos tintos se encuentra entre 20 C y 27C.

El fruto triturado es menos denso que el mosto, y se acumula en la parte superior del tanque
que formando el sombrero o la capa flotante. Si este sombrero no se pone en contacto con
el lquido, se produce poca extraccin del color. Posteriormente el mosto separado de los
residuos, se inocula con la levadura y se fermenta con la levadura. En la aplicacin, la
fermentacin del macerado se lleva a cabo en recipientes abiertos o cerrados. La
fermentacin cerrada, en esta el macerado se vierte en un tonel cerrado a travs de un
pequeo agujero, que luego se cierra. Tres o cuatro veces al da, se quita el cierre del
agujero y se introduce una cuchara de madera para agitar. El CO 2 que se forma desplaza el
aire y, su constante produccin, asegura que la atmosfera sobre el macerado siempre sea de
ese gas.

Materiales/Reactivos

1 Matraz Erlenmeyer 1 Plancha de 1 Vaso de precipitado 1 bote de

de 250 mL calentamiento de 500 mL metabisulfito de
potasio
1 Matraz Erlenmeyer 1 Mechero Bunsen 3 Kg de uva negra (1 Acido sulfrico
de 1000 mL L de jugo de uva concentrado
1 Matraz Erlenmeyer 1 Tela de asbesto Extracto de levadura Fenol al 80%
de 125 mL
1 Vaso de 10 Pipetas de 10 mL Solucin de NaOH al Acido ctrico
precipitados de 1000 0.1 N
mL
1 Esptula 1 Matraz de aforacin Solucin de NH4OH
 de 100 mL fenolftalena al 2%
1 Vidrio de reloj 10 tubos de 13x100 Pipeta de 10 mL
mm
1 Agitador 1 Pipeta volumtrica Bureta
de 10 mL
1 Termmetro 1 Vaso de precipitado Matraz de 125 mL
de 250 mL

Procedimiento

Preparacin del mosto

Pesar los 3 Kg de la uva entera y madura que no estn deterioradas, eliminar los tallos y
racimos para obtener el jugo y aadir 3 g por litro de extracto de levadura.

Ajustar el pH con acido ctrico o NH4OH a 4.5 y transferir 50 mL a dos matraces

erlenmeyer de 250 mL para llevar a cabo el escalamiento.

Pasteurizar todos los matraces a 10 libras por minutos, enfriar y determinar la

concentracin de azucares totales en el matraz fermentador por el mtodo de fenol-sulfrico
a tiempo 0 es decir antes de inocular.

Preparacin del inoculo

A partir de un cultivo de Saccharomyces cerevisae se inoculan dos matraces de 250 mL

conteniendo 50 mL de mosto pasteurizado. Incubar por agitacin a 200 rpm a 35C por 24
horas.

Fermentacin

Transferir el contenido de los dos matraces al matraz de produccin que contiene 950 mL
de mosto. Incubar a 24C durante 3-5 das posteriormente se coloca en refrigeracin a 4C
para que sedimenten los slidos.

Tomar una muestra de 10 mL cada 48 horas por 30 das y determinar:

1. pH
2. Acidez Total
3. Observacin microscpica con azul de lactofenol o azul algodn
4. Observacin de muestra por tincin Gram
5. Siembra en Agar Saboraud Dextrosa
6. Azucares reductores por el mtodo del acido 3,5-Dinitrosalicilico
7. Propiedades organolpticas del producto apariencia, color, olor y sabor

1. pH
 Esta prueba se realiza usando un potencimetro previamente calibrado o usando
tiras de pH.
2. Acidez total
La acidez total es la suma de los cidos valorables cuando este es llevado a pH 7,
segn O.I.V o pH 8.2, segn A.O.A.C.
Procedimiento
Pipetear 10 mL de vino y verterlos a un matraz
Aadir unas gotas de fenolftalena
Valoracin
Aadir gotas de NaOH hasta que vire a color verdoso en tintos rosados y a
rosa en blancos.
Anotar el volumen gastado de NaOH 0.2 N
Expresin de los resultados
Usando NaOH N/4.9
Si llamamos V al volumen de sosa gastada en la neutralizacin, tendremos que:
Acidez total g/L en acido sulfrico= V
Acidez total g/L en acido tartrico= V * 1.53
Usando NaOH N/10
Si llamamos V al volumen de sosa gastada en la neutralizacin, tendremos que:
Acidez total g/L en acido sulfrico= V * 0.49
Acidez total g/L en acido tartrico= V * 0.75
Acidez total en mEq/L= V * 10
3. Observacin microscpica con azul de lactofenol o azul algodn
a) Colocar una gota de azul de lactofenol o azul algodn
b) Agregar una muestra de mosto y colocar el cubreobjetos cuidando de no dejar
burbujas
c) Observar la preparacin en 10 X y 40 X
4. Observacin microscpica de tincin al Gram
a) Colocar una muestra de mosto en un portaobjetos y dejar secar al aire
b) Fijar la muestra con calor
c) Preparar la muestra para tincin al Gram
d) Dejar secar
e) Observar en microscopio usando una gota de aceite de inmersin y usando el
objetivo de 100X
5. Determinacin de Azucares fermentables
i. Preparacin de la curva estndar
De una solucin de glucosa 10 mM preparar estndares de la siguiente
manera:

Solucin de glucosa (mL) Agua destilada (mL)

1 9
2 8
3 7
4 6
5 5
6 4
 7 3
8 2
9 1
0 1 (blanco)

a. De cada muestra diluida tomar una alcuota de 1 mL y aadir 1 mL de

acido 3,5-dinitrosalicilico, calentar a ebullicin por 5 minutos, en un
bao con agua despus del tiempo transcurrido pasar a bao de hielo y
llevar a un volumen de 10 mL con agua destilada fra.
b. Leer a 540 nm, graficar para sacar la pendiente.
ii. Determinacin de azucares fermentables
Realizar diluciones de 1:10 y 1:100, posteriormente tomar 1 mL de la
muestra y realizar los mismos que en a. y b. Reportar los resultados de
azucares en mg/mL.
Maduracin y Clarificacin
Para llevar a cabo la clarificacin adicionar 1 ppm de metabisulfito de potasio
llenado un envase mbar dejando un espacio aproximadamente de 1cm y mantener a
una temperatura de entre 10C y 13C por 3 meses.

Observaciones

Curva de calibracin

Tubo Abs
1 0.052
2 0.098
3 0.171
4 0.200
5 0.281
6 0.323
7 0.354
8 0.344
9 0.392
Blanco 0.012
Toma de muestras

Muestra 1 17 de febrero
Muestra 2 20 de febrero
Muestra 3 24 de febrero
Muestra 4 27 de febrero
Muestra 5 3 de marzo
Muestra 6 6 de marzo
Muestra 7 10 de marzo
Muestra 8 17 de marzo
Muestra 9 20 de marzo
Muestra 10 24 de marzo
Muestra 11 27 de marzo
Muestra 12 31 de marzo

Toma de pH y Lectura de grados Brix

Muestra 1 Muestra 4 Muestra 7 Muestra 10

Grados Brix: 6 Grados Brix: 5.3 Grados Brix: 6.2-6.3 Grados Brix: 6
pH: 4 pH: 4 pH: 4 pH: 4
Muestra 2 Muestra 5 Muestra 8 Muestra 11
Grados Brix: 6 Grados Brix: 5.3-5.5 Grados Brix: 5.8 Grados Brix: 6.5
pH: 4 pH: 4 pH: 4 pH: 4
Muestra 3 Muestra 6 Muestra 9 Muestra 12
Grados Brix: 5.1 Grados Brix: 5.9 Grados Brix: 6.7-6.8 Grados Brix: 6
pH: 4 pH: 4 pH: 4 pH: 4

Determinacin de grado alcohlico del matraz fermentador

Das transcurridos Grados Brix Alcohol probable

4 6 3.54
7 6 3.54
11 5.1 2.95
14 5.3 3.06
18 5.3-5.5 3.24
21 5.9 3.42
24 6.2-6.3 3.54
31 5.8 3.42
34 6.7-6.8 3.7
38 6 3.54
41 6.5 3.7
45 6 3.54

Acidez total

Muestra Volumen gastado de NaOH

4 2.7 mL con NaOH 0.2 N
6 4.5 mL con NaOH 0.2 N
9 7 mL con NaOH 0.1 N
12 7.2 mL con NaOH 0.1 N

Determinacin de azucares fermentables

1:10

Muestra Abs
1 0.143
2 0.067
3 0.045
4 0.067
5 0.109
6 0.068
7 0.106
8 0.145
9 0.065
10 0.088
11 0.056
12 0.059

1:100

Muestra Abs
1 - 0.007
2 0.003
3 -0.009
4 -0.005
5 0.047
6 0.006
7 0.020
8 0.028
9 0.014
10 N/A
11 N/A
12 N/A
Se ilustran imgenes de la levadura tomadas del matraz fermentador, la figura 1
corresponde a 14 das despus de la inoculacin con levadura, mientras que la figura 2
corresponde a 31 das despus de la inoculacin con levadura.
 Figura 2
Figura 1
Resultados

Se procedi a la accin de fermentacin por parte de la levadura en la cual converta los

azucares disponibles para la formacin de alcohol etlico a bajas concentraciones y algunos
cidos orgnicos tambin.

El producto obtenido de la fermentacin se observo que posea aroma alcohlico y con una
aroma ligero a uva. De la cual posea un tono rosceo con coloracin marrn, por la
presencia de taninos. Por ltimo, se observ un cambio en la levadura, la figura 1 muestra
la levadura joven y la figura 2 muestra una levadura ms vieja.

Curva de calibracin

mg de
glucosa Abs
1.8 0.052
3.6 0.098
5.4 0.171
7.2 0.2
9 0.281
10.8 0.323
12.6 0.354
14.4 0.344
16.2 0.392
Curva de calibracion usando el metodo del acido 3,5-dinitrosalicilico
0.45
0.4 f(x) = 0.02x + 0.03
0.35 R = 0.95
0.3
0.25

Absorbancia
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mg de glucosa

pH en el matraz fermentador
4.5
4
3.5
3
2.5
2
pH

1.5
1
0.5
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Dias

Grado alcoholico
4
3.5
3
Alcohol probable

2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Dias
 mg de azucares fermentables en matraz fermentador
60
50

Azucares reductores (mg)

40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Dias

Para la cuantificacin de azucares reductores totales, se utiliz un Factor de dilucin 10:1.

Con ayuda de la ecuacin y= 0.024x+0.0305 se determin la cantidad de azucares
reductores totales en el matraz fermentador, dilucin 1:10 y dilucin 1:100, ilustrados en la
siguiente tabla.

Das Matraz 1:10 (mg) 1:100 (mg)

transcurrido fermentado
s r (mg)
4 46.875 4.6875 0.4687
7 15.2083 1.5208 0.1520
11 6.0416 0.6041 0.0604
14 15.2083 1.5208 0.1520
18 32.7083 3.2708 0.3270
21 15.625 1.5625 0.1562
24 31.4583 3.1458 0.3145
31 47.7083 4.7708 0.4770
34 14.375 1.4375 0.4375
38 23.9583 2.39583 0.2395
41 10.625 1.0625 0.1062
45 11.875 1.1875 0.1187
 mEq/L Vs Tiempo
100

80

60
mEq/L

40

20

0
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Dias

Para la cuantificacin de acidez del vino expresada en mEq/L, se utiliz la ecuacin mEq/L
= (V NaOH) * (N NaOH) * 1000/m. Siendo V NaOH el volumen utilizado de NaOH, N
NaOH es la normalidad del NaOH y m el volumen de alcuota del vino, siendo en este
caso 10 mL. Con ayuda de la siguiente tabla se ilustra los mEq/L calculados a partir de la
ecuacin antes mencionada.

Das transcurridos mEq/L

14 54
21 90
34 70
45 72

Acido tartarico Vs Tiempo

8
7
6
g/L de acido tartarico

5
4
3
2
1
0
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Dias
Para la cuantificacin de acidez del vino expresada en g/L de acido tartrico, se utiliz la
ecuacin g/L = (V NaOH) * (N NaOH) *0.075* 1000/m. Siendo V NaOH el volumen
utilizado de NaOH, N NaOH es la normalidad del NaOH y m el volumen de alcuota
del vino, siendo en este caso 10 mL. Con ayuda de la siguiente tabla se ilustra los g/L de
acido tartrico calculados a partir de la ecuacin antes mencionada.

Das transcurridos g/L de acido tartrico

14 4.05
21 6.75
34 5.25
45 5.4
Propiedades organolpticas del vino

Das Color Olor Sabor Textura

transcurridos
4 Rosa Inodoro Uva Sin apariencia
grumosa
7 Rosa Inodoro Uva muy Sin apariencia
ligeramente grumosa
acida
11 Rosa Ligeramente Uva Presencia ligera
ligeramente aroma ligeramente de slidos
oscuro alcohlico acida
14 Rosa Ligeramente Uva Presencia ligera
ligeramente aroma ligeramente de slidos
oscuro alcohlico acida
18 Rosa oscuro Aroma Uva con sabor Turbio
alcohlico acido
21 Rosa oscuro Aroma Uva con sabor Turbio
alcohlico acido
24 Rosa oscuro Aroma Uva con sabor Turbio
alcohlico acido
31 Rosa con Aroma Uva con sabor Turbio
tonalidad de alcohlico acido
marrn
34 Rosa con Aroma Uva con sabor Turbio
tonalidad de alcohlico acido
marrn
38 Rosa con Aroma Uva con sabor Turbio
tonalidad de alcohlico acido
marrn
41 Rosa con Aroma Uva con muy Turbio
tonalidad de alcohlico sabor acido
 marrn
45 Rosa con Aroma Uva con muy Turbio
tonalidad de alcohlico sabor acido
marrn

Discusin

En base a los resultados obtenidos de la grafica de pH Vs Tiempo, se puede observar que el

pH se mantuvo siempre constante, lo que puede significar que no existi contaminacin por
parte de bacterias u hongos, permitiendo el crecimiento de la levadura, adems se
realizaron distintas observaciones microscpicas para observar algn indicio de
contaminacin bacteriana.

El resultado obtenido gracias a la lectura de los grados Brix, para determinar el grado
alcohlico del matraz fermentador denota que se da la constante produccin de alcohol por
el metabolismo anaerbico de la levadura implementada, la perdida de alcohol se puede
deber a la volatilizacin del alcohol por una agitacin vigorosa.

Por parte de los azucares totales empleados en el matraz fermentador, se puede observar
que empieza con una gran cantidad de azucares que estarn disponibles para el desarrollo
de la levadura y, adems de la produccin de alcohol etlico en condiciones anaerobias. A lo
largo del proceso se logra observar que la cantidad de azucares reductores aumenta, y en el
siguiente punto disminuye, siendo una seal que la levadura posee enzimas que le permiten
desdoblar algunos polisacridos y disacridos, para transformarlos en monosacridos, y as
poder ser utilizados por ella misma, primero realiza ese proceso de degradar los
polisacridos y transformarlos en monosacridos, en este proceso los azucares reductores
aumentan, y mientras la levadura se va replicando, los azucares reductores disminuyen,
adems que constantemente se va produciendo alcohol etlico.

Por parte de los resultados de acidez, se logra observar un ascenso en la presencia cidos
presentes como acido tartrico, mlico, lctico, succnico, actico. Como se observa en las
dos primeras tomas de muestra, se observa que ascienden por el consumo de azucares
reductores, del cual adems de la generacin de alcohol etlico, tambin se generan
productos que proporcionan acidez al matraz fermentador. Para el tercer punto de esa
grafica, se observa que disminuye ligeramente la acidez, se puede deber al aumento de
azucares reductores presentes en el matraz fermentador, o tambin que el titulante
empleado no haya sido preparado a la concentracin deseada de 0.1 N, posteriormente se
logra observar que vuelve a aumentar los valores de acidez total en el matraz fermentador.

Comparacin con Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-199-SCFI-2015, "Bebidas

alcohlicas-denominacin, especificaciones fisicoqumicas, informacin comercial y
mtodos de prueba"
Segn la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-199-SCFI-2015, reporta los rangos de
contenido alcohlico permitido, en la siguiente tabla.

MINIMO MAXIMO

Contenido Alcohlico a 20C (% Alc. Vol.) 8,0 16,0 -18,0

Tomando en cuenta el ultimo valor de la grado alcohlico probable, denota un 3.54% del
cual este es un valor que est por debajo del rango que reporta la Norma Oficial Mexicana
PROY-NOM-199-SCFI-2015.

Segn la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-199-SCFI-2015, reporta los rangos de

azucares reductores permitidos, en la siguiente tabla.

CONTENIDO DE
CLASE
AZCARES (g/L)

"Seco" menos de 4

"Semi-seco" de 4.1 a 12

"Semidulce" de 12.1 a 50

"Dulce" Ms de 50.

Tomando en cuenta el ultimo valor de azucares reductores obtenido a 45 das de

inoculacin, denota un valor de 11.875 mg, con esta informacin se puede inferir que el
vino obtenido, se denomina Vino seco.

Segn la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-199-SCFI-2015, reporta los rangos de

acidez total reportados en g/L de acido tartrico, en la siguiente tabla.

Limite mnimo Lmite mximo

 (g/L) (g/L)

Acidez Total (como cido tartrico en g/l) 3,5 8,0 y 9,0 para vinos
espumosos.

Tomando en cuenta los valores obtenidos a lo largo de las determinaciones de acidez,

despus de 21 das despus de la inoculacin, est dentro del rango que segn reporta la
Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-199-SCFI-2015.

Conclusin

La produccin biotecnolgica de vino, por medio del uso de una levadura, es un proceso
que usa la fermentacin de azucares para la transformacin de ellos en alcohol etlico y
cidos orgnicos. Adems este proceso puede ser mejorado con mejores sustratos,
condiciones ms controladas, adems del uso de una levadura genticamente modificada
para la mayor produccin de contenido alcohlico en menor tiempo posible, estos factores
pueden ser mayormente implementados en el sector industrial.

Bibliografa

Hernndez, A. Microbiologa Industrial. 1 ed. Ed. Universidad Estatal a Distancia. Costa

Rica.2003. pp. 141-142.

http://www.dof.gob.mx/normasOficiales/5933/seeco2a12_C/seeco2a12_C.html