CUESTIONARIO

1. Qu se requiere para la separacin de enzimas

extracelulares?
La separacin de la biomasa con el sobrenadante de la fermentacin, no es
necesaria la lisis celular
2. Qu inconvenientes podra presentar usar detergentes para
la extraccin enzimtica?
El uso de detergentes puede provocar la desnaturalizacin total de las
protenas, y adems se los debe remover despus de la extraccin.
3. En qu se diferencia los mtodos de extraccin enzimtica:
inhibicin de pared celular y lisis inducible?
La inhibicin de la pared celular consiste en agregar sustancias que alteren
la permeabilidad de la pared celular, en cambio en la autolisis se expone a
las clulas a soluciones concentradas con sales y/o tratamiento radioactivo
que puede inducir dicha lisis.
4. Cul cree usted que es el mtodo de extraccin qumica
enzimtica ms efectivo y por qu?
El mtodo ms efectivo de extraccin qumica enzimtica es el tratamiento
osmtico; este aprovecha el principio del osmosis para provocar la lisis
celular y por tanto la salida de la enzima. Consiste en exponerla a una
solucin de 1.4% de sucrosa ; este es el mtodo ms utilizado a nivel de
laboratorio.
5. Mencione 3 aspectos importantes a considerar antes de
realizar una extraccin enzimtica
1. Seleccin de la fuente correcta
2. Disponibilidad
3. Localizacin de la enzima
6. Explique en qu consiste el mtodo de extraccin fsica de
homogenizacin
La homogenizacin es una tcnica mecnica ampliamente adoptada para
interrumpir la pared celular y la membrana celular. Antiguamente se
utilizaba un simple mortero y pistilo donde la presin manual poda crear
lisis celular. Normalmente se usa almina, arena para dicho proceso, junto
con un tubo de tefln o cualquier material inerte de 30-40cm de largo y una
mquina que proviene la presin.
7. Cules pueden ser las localizaciones de una enzima con
respecto a la clula, cul es la diferencia en su extraccin?

Las enzimas pueden ser extracelulares o intracelulares, a las extracelulares

se las puede extraer por mtodos ms sencillos como centrifugacin con las
enzimas intracelulares se requieren mtodos ms elaborados debido a que
primero se necesita romper la pared celular.
 8. Cul es el principio que rige el mtodo de choque osmtico?

La presencia de un fenmeno llamado presin osmtica creada debido a la

presencia equitativa de solutos dentro y fuera de la clula, al colocar a la
clula en soluciones isotnicas o hipertnicas produce lisis.

9. Explique los criterios del mtodo lisozima-EDTA y del mtodo

del lcali.
a Cul es ms viable para la extraccin enzimtica?

La lisozima cataliza de forma especfica, la hidrlisis de enlaces B-1,4-

glucosdicos presentes en los mucopptidos de las paredes celulares de las
bacterias. Las bacterias Gram-positivas son las que presentan mayor
sensibilidad a la lisozima.
La ruptura final de la envoltura celular, depende de la presin osmtica del
medio de suspensin una vez que se ha digerido la pared.
En las Gram-negativas la ruptura de la pared celular se consigue con
lisozima y la adicin de EDTA, que acta como agente quelante de iones
metlicos, origina generalmente la lisis celular.

El mtodo del lcali es un mtodo sencillo de aplicar.

Por ejemplo, la enzima teraputica L-asparaginasa puede liberarse
por tratamiento de
Erwinia chrysanthemi a un pH alcalino entre 11.0 y 12.5, durante 20
minutos.

El xito del tratamiento depende de la estabilidad en lcali del producto a

obtener. El elevado pH puede inactivar las proteasas y este mtodo tambin
es valioso en la inactivacin lisis microorganismos manipulados por
ingeniera gentica.
El mtodo ms viable a usar es el mtodo del lcali, ya que ha sido utilizado
con considerable xito para la extraccin de protenas
bacterianas a pequea y gran escala adems que es fcil de realizarlo y
barato.
Por otro lado, el mtodo de lisozima y EDTA no se puede utilizar para
extracciones a gran escala por el costo alto de la lisozima.

10. Por qu el mtodo de extraccin enzimtica, trituracin

o agitacin con abrasivos es usado ms en clulas vegetales?
Se usa ms en clulas vegetales ya que contienen pared celular estructura
muy resistente, la friccin y tensin rompen la misma (Castillo, 2005).
11. Escriba un ejemplo de solvente isotnico para realizar
la homogenizacin mecnica
Sacarosa 0,25%, NaCl 0,9%
12. Explique un mtodo qumico de extraccin enzimtica y
de un ejemplo de enzima al que lo aplicara.
La lisis con solventes orgnicos se produce al someter a la clula a un medio
hipotnico, ocasionando dao en la membrana celular. Se utiliza para la
extraccin de enzimas hidrolticas y protenas ligadas al periplasma en
bacterias
13. Elabore una escala de menor a mayor dificultad
para la extraccin de enzimas con cinco organismos.

1. Clulas animales
2. Bacterias Gram Negativas
3. Clulas vegetales
4. Bacterias Gram Positivas
5. Endoesporas

14. Qu enzimas son ms fciles de aislar las

extracelulares o intracelulares?

Independientemente de la fuente de tejido, es decir, plantas o

animales, las enzimas extracelulares son ms fciles de
recolectar. Su recoleccin generalmente no requiere la
destruccin de los tejidos y por lo tanto se reducen los gastos y
tiempo requerido para procesos tales como homogeneizacin o
cualquier otro tipo de procesos.
15. Cul es la clasificacin general de los mtodos de
extraccin enzimtica
 Homogenizaci
n mecnica

Homogenizaci
n snica
Mtodos fsicos
Desintegracin
trmica

Cavitacin
hidrodinmica

Extraccin de Alclisis
enzimas
intracelulares
Extraccin
enzimtica
Extraccin de Detergentes
enzimas
extracelulares
Mtodos Solventes
qumicos orgnicos

Agentes
quelantes

Soluciones
hipotnicas

Adicin de
Mtodos enzimas
biolgicos

16. Cual es la diferencia entre cillaza slida y cillaza

lquida?
La cizalla lquida consiste en pasar suspensiones de clulas a alta
presin a travs de un pequeo orificio que comunica con una cmara a
presin atmosfrica. Se aplicara bacterias Gram negativas los cuales son
microorganismos menos robustos en cambio la cizalla slida consiste en
congelar una pasta de clulas por debajo de -20C, para hacerla pasar a
alta presin a travs de un pequeo orifico.

17. Como actan la lisozima y el EDTA en bacterias gram

negativas y gram positivas.
La lisozima es producida a partir de la clara de huevo de la gallina,
cataliza la hidrlisis de enlaces - 1,4-glucisidcos de los mucopptidos
de las paredes celulares de las bacterias. Las bacterias gram-positivas
tienen mayor sensibilidad a la lisozima. Pero la ruptura final de la
envoltura celular una vez que se ha digerido la pared, depende de la
presin osmtica del medio de suspensin. En las bacterias gram-
negativas para la ruptura de la pared celular adems de la lisozima se
requiere de EDTA que origina la lisis celular actuando como agente
quelante de iones metlicos.

18. En que difiere el mtodo de retencin qumica de enlace

covalentes con el mtodo de retencin fsica por
microencapsulado de soporte poroso.
En la retencin qumica se enlaza covalentemente la enzima con un
soporte insoluble natural o sinttico. El enlace se da entre algn grupo
funcional reactivo de la enzima (amino, Cis-tiol, Tir-hidroxil o His-
imidazol) y el soporte previamente activado, generalmente recubierto
con grupos funcionales orgnicos en la superficie (Monocapastiol auto
ensambladas, oro, CNBr-Sepharosa, etc.).

Mientras que en el microencapsulado de soporte poroso, las partculas

porosas (esferas de slice con nanoporos, micropartculas de CaCO3, etc.)
son puestas en suspensin con la enzima por un tiempo dado (aprox. 40
min), atrapan la enzima en su interior y permiten el paso de sustratos y
productos. Sin embargo ambos son muy estables a cambios de
temperatura y ph.
19. Qu rol cumple la Polifenoloxidasa y a que se debe su
importancia?
La PFO permite la catlisis de reacciones de hidroxilacin y oxidacin de
monofenoles a a o-quinonas (difenolasa, catecolasa). La PFO es una
enzima distribuida naturalmente en plantas, interviene en el
pardeamiento enzimtico o degradacin de los colores en frutas y
vegetales. Normalmente acta en el momento de la muerte celular
programada, en el cual las vacuolas que contienen la PFO se rompen,
liberndola e iniciando el oscurecimiento. Est presente tambin cuando
se destruyen los tejidos vegetales en el momento de la cosecha y al
procesado primario, secado y procesado secundario en la poscosecha.
20. En que se fundamentan los mtodos de extraccin
enzimtica?
Se fundamentan en el rompimiento de la clula para liberar sus
componentes, entre los cuales se encuentran las enzimas, las cuales son
aisladas posteriormente, mediante la aplicacin de mtodos acordes a la
naturaleza de la enzima. Por ejemplo se puede aprovechar las
caractersticas hidrofbicas/hidroflicas de una enzima para separarla por
solubilidad.
21. Cmo se puede evaluar la actividad cataltica de la
Polifenol oxidasa?

La PFO tiene un rango amplio de actividad con sustratos di y tri

hidroxifenlicos como 4-metilcatecol, catecol, DL-DOPA, dopamina,
resorcinol, cido cafico y pirogalol. La constante de Michaelis-
Menten Km y la mxima velocidad V max pueden ser
determinadas para estos sustratos, con ensayos de
espectrofotometra de masas usando la concentracin del sustrato
en funcin del tiempo. Se valora la K cat con cada sustrato y la
K cat
eficiencia cataltica de la enzima con cada sustrato Km .