Regeneracin de la planta a partir del callo derivado del brote axilar

en el ame blanco (Dioscorea rotundata)

Resumen Dioscorea rotundata, comnmente conocido como ame blanco,

es un importante cultivo alimentario bsico ampliamente cultivado en frica
Occidental y proporciona seguridad alimentaria a millones de personas. Las
mejoras genticas de este cultivo utilizando las herramientas biotecnolgicas
avanzadas se han visto obstaculizadas hasta ahora por la naturaleza
recalcitrante de la regeneracin a travs de la embriognesis somtica. Por lo
tanto, hemos desarrollado un sistema eficaz y reproducible para la
regeneracin de plantas a travs de la embriognesis somtica. En el medio
Murashige y Skoog (MS) suplementado con diversas auxinas (2, 3, 4, 5, 6, 6, 7,
8, 4-D, NAA y picloram). Entre todos los explantes probados, los explantes de
yema axilar cultivados en medio MS suplementado con picloram (0,5 - 12 mg /
l) favorecieron la produccin de callos. Se consigui una proliferacin mxima
de callos (526 mg de peso fresco / explante) en medio MS suplementado con
picloram (0,5 mg / l), hidrolizado de casena (600 mg / l) y prolina (1 g / l). El
anlisis histolgico confirm que los callos embriognicos producidos en este
medio se mezclaron con callos no embriognicos. La transferencia de calos
sobre el medio basal MS suplementado con carbn activado (1%) cambi el
color del callo al prpura y promovi la produccin de embriones somticos (87
embriones / callos) as como brotes adventicios del brote. Adems, tras la
transferencia al medio MS suplementado con BAP (0,4 mg / l), los embriones
continuaron su diferenciacin y maduracin y germinaron en plntulas
completas. Los brotes de brotes adventicios produjeron brotes mltiples sobre
medio MS suplementado con BAP (0,4 mg / l). Las plntulas germinadas bien
desarrolladas se aclimataron en la casa de la pantalla con un 90% de
supervivencia. Los estudios histolgicos confirmaron que la regeneracin de D.
rotundata descrita aqu sigui vas de regeneracin duales. Los callos
embriognicos se regeneraron mediante el desarrollo de embriones somticos
y germinaron en plntulas completas, sin embargo los callos no embriognicos
se regeneraron a travs de organognesis y desarrollaron brotes mltiples. El
protocolo desarrollado tiene potencial para la hibridacin somtica, la
propagacin clonal masiva y las aplicaciones de transformacin gentica.

Palabras clave Dioscorea rotundata _ Embriognesis somtica _ Brote axilar _

Picloram _ Carbn activado

Introduccin

Yam (Dioscorea spp.) Es un importante alimento bsico para millones de personas en

frica, Amrica del Sur, Asia y los pases tropicales del Pacfico (FAO 2013). El cultivo
tiene gran importancia econmica y social en el frica subsahariana (Ile et al., 2006),
donde se produce ms del 95% del ame mundial (FAO, 2013). De las 600 especies de
Dioscorea conocidas, slo 10 de las 90 especies comestibles se cultivan
consistentemente para el consumo de alimentos (Nyaboga et al., 2014) y el complejo
de Dioscorea rotundata est entre los ms cultivados, especialmente en frica
Occidental (FAO 2013). Adems de su importancia como alimento bsico, el ame es
tambin una fuente de ingresos para las personas, particularmente en la regin costera
de frica Occidental (Asiedu y Sartie, 2010). Un nmero de especies de Dioscorea son
tambin la fuente de fito-compuestos que se utilizan en la produccin de
corticosteroides y tienen usos potenciales como excipientes en la industria
farmacutica (Poornima y Ravishankar, 2007; Okunlola y Odeku 2011). La produccin
de ame se ha visto limitada debido a varios factores abiticos y biticos que incluyen
enfermedades y plagas, material de siembra inadecuado, bajo potencial de
rendimiento y disminucin de la fertilidad del suelo (Adegaite et al., 2006). A pesar de
la vitalidad del ame, su mejoramiento gentico a travs de la cra convencional se ha
visto obstaculizado por el ciclo de reproduccin prolongado, la naturaleza diica y
errtica de la floracin, la mala fijacin de semillas, la poliploidia, la propagacin
vegetativa a travs de semillas de tubrculos y estacas de vid y antecedentes
genticos heterocigticos (Mignouna et al. 2008). Hasta ahora, la aplicacin de la
ingeniera gentica para desarrollar variedades mejoradas ha sido limitada por la
ausencia de protocolos eficientes para la regeneracin y la transformacin gentica. El
desarrollo de plantas transgnicas estables requiere un sistema de regeneracin
eficiente susceptible de transformacin gentica mediada por Agrobacterium y la
estabilidad de transgenes en condiciones de campo.

Se han reportado sistemas de regeneracin a travs de la organognesis directa de los

brotes para D. rotundata, D. cayenensis, Y D. alata (Adeniyi et al., 2008, Anike et al.,
2012). Recientemente se ha reportado la produccin de plantas transgnicas de D.
rotundata utilizando segmentos nodales (Nyaboga et al., 2014). Aunque la
micropropagacin de D. rotundata ha sido descrita (Adeniyi et al., 2008, Anike et al.,
2012), no hay ningn informe sobre la regeneracin a travs de la embriognesis
somtica que tiene muchas ventajas particularmente para la transformacin gentica,
ya que los embriones son de origen unicelular y evitar las probabilidades de
Quimerismo (Mariashibu et al., 2013). La induccin de embriones somticos utilizando
embriones zigticos como explantes fue descrita por primera vez en D. rotundata por
Osifo (1988), pero no se logr la regeneracin de plntulas completas a travs de
embriones somticos. Recientemente, Surez Padrn et al.
(2011) reportaron embriognesis somtica de D. rotundata utilizando explantes de
pecolo; Sin embargo, el informe carece de informacin sobre la eficiencia de la
induccin de callos embriognicos y detalles sobre las diferentes etapas del desarrollo
del embrin. De hecho, el progreso en la embriognesis somtica, especialmente para
las especies de ame, que incluyen D. rotundata, D. bulbifera, D. dumetorum, D.
esculenta, D. hispidia, D. japonicum y D. trifida, est restringido por recalcitrancia y
genotipo dependencia. Existen muy pocos informes sobre la embriognesis somtica
de otras especies de hilo alimentario, a saber, D. composita y D. cayenensis (Viana y
Mantell, 1989); D. opposita (Nagasawa y Finer 1989), y D. alata (Twyford y Mantell
1996, Belarmino y Gonzales 2008) que reportaron una baja eficiencia en la produccin
de embriones somticos y en el potencial de germinacin. La eficacia de la
embriognesis somtica no fue lo suficientemente alta para la transformacin
gentica, ya que la eficiencia de regeneracin se reduce normalmente
considerablemente despus de la infeccin por Agrobacterium. Adems, los protocolos
de embriognesis somtica reportados para estas especies no son aplicables a D.
rotundata debido al efecto genotpico; Por lo tanto los protocolos para la induccin de
callos, desarrollo y regeneracin de embriones somticos necesitan ser optimizados
para cada especie de ame.

Dioscorea rotundata, comnmente conocida como ame blanco, es nativa de frica y

est entre las especies cultivadas ms importantes. Tambin es uno de los ms
productivos y tiene un alto potencial de exportacin dondequiera que se cultive (Klu et
al., 2005). Sin embargo, no est disponible un sistema de regeneracin eficaz a travs
de la embriognesis somtica. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar
un protocolo para la regeneracin a travs de la embriognesis somtica, que se puede
utilizar para la hibridacin somtica, la produccin de semillas y la transformacin
gentica. Por lo tanto, el presente estudio fue diseado para desarrollar eficiente
sistema de regeneracin de plantas a travs de la embriognesis somtica en D.
rotundata.

materiales y mtodos

Material vegetal

Las plntulas in vitro de D. rotundata nmero de acceso TDr 2436 se obtuvieron del
Instituto Internacional de Agricultura Tropical (IITA), Ibadan, Nigeria. La adhesin se
mantuvo in vitro y se multiplic a travs de cortes nodales en medio bsico de ame
(YBM) que contena sales y vitaminas de medio Murashige y Skoog (MS), 0,05 mg / l de
6-bencilaminopurina (BAP), 0,02 mg / l de cido naftalenoactico (NAA) , 25 mg / l de
cido ascrbico, 30 g / l de sacarosa, y 2,4 g / l de gelrita, segn se describe por
Nyaboga et al. (2014) (figura 1a). Se extirparon seis tipos de explante (hoja inmadura,
ndulo, entrenudo del tallo, raz, pecolo y capullo axilar) para determinar la induccin
del callo. Para los explantes de yemas axilares, se colocaron segmentos de tallo nodal
excisados de plntulas de 4-8 semanas de edad en medio MS suplementado con BAP (1
mg / l) durante 3 das para inducir brotes axilares (figura 1b). Despus de 3 das, los
brotes axilares se aislaron con una aguja estril bajo el microscopio y se utilizaron
como explantes para la induccin del callo (Figura 1c).

Efecto de las auxinas en diferentes explantes para la induccin del callo

Se cultivaron los seis diferentes explantes (hoja inmadura, nodo, entrenudo del tallo,
segmento de raz, peciolo y brote axilar) en medio MS suplementado con diversas
auxinas (2,4-D, NAA, picloram, Tabla 1) a diferentes concentraciones de 0,5 A 9,0 mg / l
para determinar su efecto sobre la induccin del callo. Se cultivaron diez explantes en
cada placa de Petri de 90 mm y se probaron un total de 100 explantes para cada
tratamiento; El experimento se repiti dos veces. Todos los cultivos se incubaron en
oscuridad completa a 25 2C. Los explantes que producen estructura embrionaria
somtica directa (DSLS) y el nmero de DSLS / explante se registraron despus de 4
semanas de cultivo. El porcentaje de DSLS se calcul como el nmero de explantes
mostrando induccin DSLS / nmero total de explantes cultivados 1009. La induccin
de callo y el tipo de callo tambin se registraron despus de 8 semanas de cultivo.

Fig. 1 Efecto de auxinas en explantes de diferentes tipos para la induccin de callos

embriognicos. A Plantas cultivadas in vitro de D. rotundata (barra 0,2 cm); B induccin
de brotes axilares de segmentos de tallo nodal en medio MS suplementado con BAP (1
mg / l, bar 0,5 cm); C imagen microscpica de brote axilar de 3 das crecido (barra 1
mm); D, e DSLS y callos de hojas inmaduras en 2,4-D (0,5 mg / l) despus de 8
semanas de cultivo (bar 1 cm); F DSLS a partir de explantes de pecolo en 2,4-D (0,5
mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (bar 1 cm); G de explantes de yemas axilares
en 2,4-D (0,5 mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (bar 1 cm); H explantes de tallo
nodal en 2,4-D (0,5 mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (bar 1 cm); I explantes de
raz en 2,4-D (0,5 mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (bar 1 cm); J hoja inmadura
en NAA (0,5 mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (barra 1 cm); K explantes de
pecolo en NAA (0,5 mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (Bar 1 cm); L de explantes
de yemas axilares en NAA (0,5 mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (bar 1 cm);
Explantes tubulares nodales en NAA (0,5 mg / l) que producen brotes y races despus
de 8 semanas de cultivo (bar 1 cm); N explantes de raz produciendo races peludas a
NAA (0,5 mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (bar 1 cm). O explantes de yemas
axilares produciendo callos blanco amarillento en picloram (9 mg / l) despus de 8
semanas de cultivo (bar 1 mm). (Figura de color en lnea)
Efecto de las concentraciones de picloram suplementadas con sulfato de
cobre en la induccin del callo

Basndose en la respuesta de los diferentes explantes cultivados en medio MS

suplementado con diferentes auxinas, se seleccionaron picloram y explantes de yemas
axilares para otros experimentos. Los explantes de brotes axilares se cultivaron en
medio MS suplementado con 0,318 mg / l de sulfato de cobre, sacarosa al 2% y
diferentes concentraciones de picloram (de 0,5 a 16 mg / l, Tabla 2) para probar el
efecto sobre la induccin del DSLS y la produccin de callo . Se cultivaron diez
explantes en cada placa de Petri de 90 mm y se probaron un total de 100 explantes
para cada tratamiento; Los experimentos se repitieron dos veces. Todos los cultivos se
incubaron en oscuridad completa a 25 2C. El porcentaje de explantes que muestran
induccin de DSLS y el nmero de DSLS / explante se registraron despus de 4
semanas de cultivo. El peso fresco de calli se registr despus de 8 semanas de cultivo.

Efecto de los aditivos nitrogenados orgnicos sobre la induccin del callo

En base a la respuesta de los brotes axilares cultivados en diferentes concentraciones

de picloram, se seleccionaron cuatro concentraciones diferentes (0,5, 1,5, 7 y 12 mg / l)
de picloram para probar el efecto de los aditivos nitrogenados orgnicos en la
induccin de embriones somticos directos ) Y el callo. Los explantes de brotes axilares
se ensayaron en medio MS suplementado con diferentes concentraciones de picloram
(0,5, 1,5, 7 y 12 mg / l) en combinacin con hidrolizado de casena (600 mg / l) y
prolina (1 g / l). Se utilizaron un total de 100 explantes para cada concentracin y los
experimentos se repitieron dos veces. Los cultivos se incubaron en la oscuridad a 25
2C.

Efecto del carbn activado en la induccin indirecta de embriones somticos

Cals de ocho semanas de edad obtenido en medio MS suplementado con diferentes

concentraciones (0,5, 1,5, 7 y 12 mg / l) de picloram en combinacin con hidrolizado de
casena (600 mg / l) y prolina (1 g / l) fueron aspticamente Transferido en medio basal
MS aumentado con diferentes concentraciones (0, 0.2 y 1%) de carbn activado para la
induccin de embriones somticos indirectos. Los cultivos se incubaron durante 6
semanas a 25 2C con fotoperodo de 16 h con una densidad de flujo de fotones
(PFD) de 50 lmol m-2 s-1 proporcionada por una lmpara fluorescente blanca fra. La
respuesta a la induccin indirecta del embrin somtico y el nmero de embriones /
callos somticos indirectos se registraron despus de 6 semanas de cultivo.

Regeneracin de plantas

Los callos se transfirieron al medio basal MS o medio MS suplementado con

concentraciones de BAP (0,4,
1 mg / l) para inducir la germinacin de los embriones. Los embriones germinados bien
desarrollados se separaron de los grupos de callo y se cultivaron individualmente para
el desarrollo adecuado de la rfaga y la raz en YBM. Se registr el nmero de plntulas
germinadas / agrupamiento de callos. Las plntulas completas se retiraron de los tubos
de cultivo, se lavaron con agua estril para retirar el agar unido transferido a grnulos
de turba y se cubrieron con bolsas de polietileno Durante 4 semanas para mantener la
humedad. Las plantas aclimatizadas se transfirieron entonces a macetas que contenan
suelo y estircol en la proporcin de 1: 1 y se mantuvieron en la casa de tamiz para
crecimiento adicional.

Anlisis histolgico
El anlisis histolgico se realiz siguiendo el mtodo de Filonova et al. (2000)
con ligeras modificaciones. Los tejidos vegetales en diferentes etapas de
embriognesis somtica se fijaron en la solucin de formalina, cido actico y
alcohol que contena 5 ml de etanol al 96%, 10 ml de formaldehdo al 37% y 5
ml de cido actico, ajustado a 100 ml de volumen Con agua destilada y se
almacen a 10C durante 48 horas. Despus de la fijacin, las muestras se
deshidrataron mediante cambios sucesivos en etanol a diferentes
concentraciones (30-100% v / v). Despus de la deshidratacin, las muestras
se embebieron en resina Technovit 7100 (Kulzer Alemania). Se cortaron
secciones en serie (5 lm) en un microtomo rotatorio (Leica RM 2155, EE.UU.),
se montaron en portaobjetos citolgicos de vidrio y se tieron con azul de
toluidina al 0,05% durante 4 min.

Fotomicrografa Se observaron y fotografiaron diferentes etapas de

diferenciacin de embriones somticos utilizando un microscopio Nikon Stereo
equipado con el sistema de cmaras digitales DS-Fi1-U2 (100-240 V, Nikon,
Japn) de Nikon que consista en el paquete de software de elementos NIS. Las
secciones histolgicas se observaron y fotografiaron utilizando el microscopio
ptico (Coslab, India) equipado con un sistema de cmara digital que consista
en el software de anlisis de imgenes optika vision lite 2.1.

anlisis estadstico

Se utiliz un diseo completamente al azar para todos los tratamientos. Todos

los experimentos se repitieron dos veces con tres repeticiones para cada
tratamiento de 100 explantes. Los datos se analizaron estadsticamente
mediante anlisis de varianza (ANOVA) y se presentaron como la media error
estndar (SE). Las medias se separaron utilizando las pruebas de rango
mltiple de Duncan y se determin la significancia a un nivel del 5% utilizando
SPSS versin 11.5.

Resultados y discusin

El desarrollo de un sistema de regeneracin eficiente y reproducible a travs de la

embriognesis somtica es un prerrequisito para la rpida propagacin clonal en masa,
la transformacin gentica y la produccin artificial de semillas para genotipos de
hilados de importancia econmica. Sin embargo, el establecimiento de un sistema de
regeneracin de plantas a travs de la embriognesis somtica para la mayora de las
especies ha sido muy difcil debido a la pobre respuesta en las manipulaciones de
cultivos de tejidos (Twyford y Mantell 1996). Aunque se ha logrado cierto progreso en la
propagacin in vitro de D. rotundata utilizando el cultivo de meristemas (Adeniyi et al.,
2008, Anike et al., 2012), no se ha reportado ningn protocolo eficiente para la
regeneracin a travs de la embriognesis somtica. Por lo tanto, este estudio se llev
a cabo para establecer un eficiente y robusto sistema de regeneracin de plantas a
travs de la embriognesis somtica de D. rotundata. Se optimizaron varios factores
crticos, como el efecto de diferentes explantes, auxinas, aditivos nitrogenados
orgnicos y carbn activado.

Efecto de las auxinas en diferentes explantes para la induccin del callo

La regeneracin de especies comestibles de ame a travs de la embriognesis

somtica est hasta ahora limitada a pocos informes (Osifo 1988, Nagasawa y Finer
1989, Viana y Mantell 1989, Twyford y Mantell 1996, Belarmino y Gonzales 2008). La
seleccin de los explantes apropiados es un paso crtico para la induccin del callo y la
embriognesis somtica para cualquier especie de planta, particularmente las
monocotiledneas donde las clulas se diferencian rpidamente, seguidas por la
prdida de capacidad mittica y morfogentica (Krishnaraj y Vasil 1995). En el ame,
se han utilizado puntas de meristemos, ndulos axilares y pecolos para la
organognesis y regeneracin (Borges et al., 2004, Anike et al., 2012). Explantes como
embriones zigticos en D. rotundata, D. composita y D. cayenensis (Osifo 1988; Viana y
Mantell 1989); Segmentos de tallo en D. opposita (Nagasawa y Finer 1989); Segmentos
de raz y segmentos de tallo nodal en D. alata (Twyford y Mantell 1996, Belarmino y
Gonzales 2008) han demostrado inducir embriones somticos de especies comestibles
de ame. En base a estos informes anteriores, diferentes explantes fueron probados en
este estudio por su potencial para la embriognesis somtica mediante la aplicacin de
auxinas adecuadas.

Los explantes de diferentes tipos de D. rotundata cultivados en medio MS que contena

diversas concentraciones de auxinas mostraron respuestas diferenciales a la induccin
del callo, dependiendo del tipo y concentracin de auxinas (Tabla 1). MS medio
desprovisto de auxinas no mostrar la induccin de callos (Tabla 1]. Todos los explantes
probados mostraron una mejor respuesta para la induccin del callo en el medio
suplementado con diferentes concentraciones de 2,4-D y picloram en comparacin con
NAA (Tabla 1). Diferentes tipos de callos fueron producidos a partir de diferentes tipos
de explantes y auxinas probados (Fig. 1). DSLS se observaron durante las primeras 4
semanas de cultivo y posterior formacin de callos se observ despus de 8 semanas
de cultivo en el mismo medio. Los explantes inmaduros de hoja y pecolo produjeron
DSLS con eficacias de 32,3 y 41,6%, despus de 4 semanas de cultivo en medio MS
que contena 0,5 mg / l de 2,4-D (Tabla 1, figura 1d-f). Sin embargo, no se obtuvo callo
a partir de los explantes de yemas axilares en todas las concentraciones de 2,4-D
ensayadas (Fig. 1g). Los explantes nodales produjeron calos en medio MS que contena
0,5 mg / l de 2,4-D (Tabla 1, Figura 1h). Los segmentos internodales del vstago y los
explantes de raz dieron como resultado una frecuencia ms baja (18,3 y 25,6%) de
DSLS y callos en medio MS que contena 2,4 mg de 2,4 mg (Tabla 1, Figura 1i).
Concentraciones de 2,4-D ms de 0,5 mg / l result en la disminucin de la eficiencia
de la induccin de callos de todos los explantes probados (Tabla 1].

Las Auxinas se consideran un factor importante que evoca la competencia

embriognica en los tejidos somticos para inducir somticas

Embriognesis (Feher et al., 2003, Gaj 2004). Sin embargo, los explantes de diferentes
tipos responden de manera diferente a las diversas auxinas. En el presente estudio,
explantes como brotes axilares y ndulos cultivados con picloram mostraron una mejor
respuesta para la induccin del callo que con el 2,4-D. Entre los explantes probados, los
brotes y ndulos axilares produjeron la respuesta mxima para la induccin de callos
en comparacin con el pecolo, la hoja inmadura, el entrenudo del tallo y los explantes
de raz (Tabla 1). Un fenmeno similar ha sido reportado para D. alata por Belarmino y
Gonzales (2008). Sin embargo, Nagasawa y Finer (1989) informaron de la induccin de
callos embriognicos de segmentos de vstago internodales en un medio que contena
2,4-D. Osifo (1988) utiliz embriones zigticos para la induccin de callos
embriognicos en un medio suplementado con NAA en D. rotundata. En este estudio, la
NAA en todas las concentraciones produjo callos acuosos con brotes y / o races
adventicias en todos los explantes probados (Fig. 1j-m). Sin embargo, los segmentos de
raz no produjeron callos, pero formaron races peludas a concentraciones menores
(0,5-3 mg / l) de NAA (Figura 1n). Las diferencias reportadas en este estudio de los
informes anteriores podran deberse a los diferentes cultivares de ame. Los resultados
anteriores muestran que diversos tipos de explantes varan en su respuesta a
diferentes auxinas en el medio, lo que sugiere que el tipo de explante es un factor
importante en la evocacin de la embriognesis somtica, segn lo informado por
Lincy et al. (2009). En este estudio, los callos obtenidos de diferentes explantes fueron
sometidos a nuevas pruebas de diferenciacin de embriones somticos en diferentes
medios suplementados con diferentes citoquininas. Todos los callos produjeron races
en lugar de germinacin de embriones somticos. Basndose en los resultados
observados para la induccin del callo (Figura 1o), se escogieron explantes de yemas
axilares y picloram Para experimentos adicionales.

Efecto de diferentes concentraciones de picloram suplementado con sulfato

de cobre sobre la induccin del callo

Varios factores son crticos para la induccin de callos embriognicos incluyendo tipo y
edad de explantes, medio de cultivo, concentracin y combinacin de reguladores de
crecimiento de plantas (Prakash y Gurumurthi 2010). En el presente estudio, se
encontr que el tamao y la edad de los explantes axilares del brote eran crticos para
la induccin de callos en D. rotundata. Los brotes axilares de 0,1 mm de tamao
(Figura 1c) aislados de explantes nodales cultivados en medio MS suplementado con
BAP (1 mg / l) durante 3 das (Figura 1b) produjeron callos mientras que los brotes
axilares aislados despus de 4-5 das post- Resultaron en estructuras compactas no
organizadas y mostraron una pobre respuesta para la induccin del callo.

En este estudio se examin el efecto de diferentes concentraciones de picloram en

combinacin con sulfato de cobre. La Tabla 2 demuestra la influencia de diferentes
concentraciones de picloram en medio MS suplementado con 0,318 mg / l de sulfato de
cobre para la induccin de callos a partir de explantes de yemas axilares. Se ha
reportado que el sulfato de cobre induce callos embriognicos en varios cultivos como
la yuca y el sorgo (Nirwan y Kothari 2003, Feitosa et al., 2007).

En el presente estudio, los explantes de yemas axilares que producen DSLS y callos
fueron marcadamente influenciados por las concentraciones de picloram utilizadas
(Tabla 2). Se encontr que el porcentaje de explantes (64,6%) productores de DSLS y el
nmero de DSLS / explante (12,3 DSLS / explante) era mximo en medio MS
suplementado con 12 mg / l de picloram. Sin embargo, la induccin y proliferacin
mxima del callo se logr a 0,5 y 1,5 mg / l de picloram con un peso fresco de 222 y
207 mg / callo, respectivamente (Tabla 2). Las estructuras globulares compactas
podran ser el resultado de altas concentraciones de picloram, mientras que la
proliferacin de callos es mxima a la menor concentracin debido a la rpida divisin
de las clulas. A concentraciones ms bajas (0,5 y 1,5 mg / l) de picloram, la mayora
de los callos eran suaves, compactos, amarillentos y embriognicos, adems de
algunos tipos de lana de algodn blanco o amarillento de callos no embriognicos (Fig.
2a, segundo). A concentraciones de 3-16 mg / l de picloram, los callos eran duros,
compactos y amarillentos con estructuras globulares (Fig. 2c, d). Tambin se
observaron estructuras compactas blancas en concentraciones tanto mayores como
menores de picloram. El cultivo prolongado de callos en el mismo medio con
concentraciones ms altas (12 mg / l o ms) de picloram durante 8 semanas dio como
resultado el dorado de los callos y la exudacin de las secreciones mucosas. En este
estudio, se ha indicado claramente que el picloram tiene el potencial para la induccin
de callos. Estos resultados fueron similares a los de Belarmino y Gonzales (2008) que
revelaron que el picloram es esencial para la induccin del callo y la embriognesis
somtica en el ame. El picloram se ha empleado con xito en la induccin de callos
embriognicos friables en cultivos de races y tubrculos, especialmente la yuca, la
batata y el ame (Nyaboga et al., 2013, Belarmino y Gonzales 2008). El sulfato de
cobre utilizado en la combinacin de medios con auxinas crea condiciones de estrs
oxidativo que promueven tanto la divisin celular como la formacin de clulas
embriognicas, segn lo informado por Pasternak et al. (2002).

El calo producido en picloram se transfiri al medio basal MS y al medio MS

suplementado con diferentes citocininas para regeneracin subsiguiente y maduracin
del embrin, pero todas las races produjeron callos en lugar de germinacin en las
plntulas (figura 2e-g). El callo derivado de un medio que contiene alta concentracin
de picloram produjo ms races en comparacin con el callo derivado de las bajas
concentraciones de picloram. Este resultado indica que el picloram puede tener un
efecto inhibitorio sobre la diferenciacin y maduracin de los embriones somticos.
Basndose en la alta capacidad de respuesta de los explantes para el DSLS y la
induccin de callos, se compararon concentraciones inferiores (0,5 y 1,5 mg / l) y
mayores (7 y 12 mg / l) de picloram en otros experimentos en combinacin con aditivos
orgnicos.

fig. 2 Efecto de diferentes medios que contienen diversas concentraciones de picloram y

suplementado con sulfato de cobre para la induccin del callo de los explantes de la yema axilar. A, b
Callos amarillentos suaves y compactos junto con estructuras blancas derivadas de picloram (0,5 mg /
l) despus de 8 semanas de cultivo (bar 1 y 1 mm, respectivamente); C callos compactos compactos
derivados de picloram (12 mg / l) despus de 8 semanas de cultivo (bar 1 cm); D imagen microscpica
del callo derivado del picloram (12 mg / l, bar 1 mm); E callos derivados de picloram (12 mg / l)
formaron races en medio basal de MS y medio MS suplementado con BAP (1 mg / l; bar 1 cm); F, g
formacin de ms races en medio MS suplementado con GA3 (1 mg / l; bar 1 cm); H se detuvo la
formacin de races en medio MS Suplementado con medio de carbn activado (1%) despus de 6
semanas de cultivo (barra 1 cm); I germinacin de callos derivados de picloram (12 mg / l) en medio
MS suplementado con BAP (0,4 mg / l) antes de la subcultura en medio MS suplementado con medio
de carbn activado durante 6 semanas de cultivo (bar 1 cm). (Figura de color en lnea).

Efecto del hidrolizado de casena y prolina en combinacin con picloram en la

induccin del callo

Los aditivos orgnicos, tales como el hidrolizado de casena, son nutrientes complejos
que contienen una mezcla de hasta 18 aminocidos y pueden contener algn factor
promotor del crecimiento desconocido (Gray y Conger 1985, George et al., 2008). En la
presente investigacin, se aadi una combinacin de hidrolizado de casena y prolina
a medio MS que contena picloram a diversas concentraciones (0,5, 1,5, 7 y 12 mg / l)
para determinar su efecto sobre la produccin de callos. Los callos translcidos, lisos y
blancos lechosos se desarrollaron despus de 8 semanas de cultivo en todas las
concentraciones de picloram suplementado con hidrolizado de casena y prolina (Fig.
3a-d). El porcentaje de explantes que producen callo vari con diferentes
concentraciones de picloram (Tabla 3). Se obtuvo un mximo de embrin somtico
directo de color blanco lechoso (DSE) a partir de picloram (12 mg / l) suplementado con
hidrolizado de casena y prolina con 19,6 embriones / explante despus de 4 semanas
de cultivo. Sin embargo, la proliferacin de callos fue baja en esta concentracin,
produciendo 348,3 mg de peso fresco despus de 8 semanas de cultivo. La
proliferacin de callos (526,6 mg) fue mayor en medio MS suplementado con picloram
(0,5 mg / l) suplementado con hidrolizado de casena y prolina despus de 8 semanas
de cultivo. El anlisis histolgico del callo producido con picloram (0,5 mg / l)
suplementado con hidrolizado de casena y prolina confirm la produccin de DSE
despus de 4 semanas de cultivo (Figura 4b) y la proliferacin de callos embriognicos
y no embriognicos despus de 8 semanas de cultivo (Fig. 4c).

En el presente estudio, se observ una interaccin significativa entre la induccin del

callo y las concentraciones de picloram. La proliferacin de callos disminuy
gradualmente con el aumento de las concentraciones de picloram (Tabla 3). Los callos
translcidos, lisos, de color blanco lechoso fueron dominantes en el medio
suplementado con hidrolizado de casena y prolina en comparacin con los resultados
del medio sin estos aditivos. Sin embargo, tambin se observaron estructuras
compactas blancas opacas sobre picloram (0,5 mg / l) despus de 6 semanas de cultivo
(Fig. 3a). La adicin de hidrolizado de casena solo al medio MS que contiene picloram
indujo la formacin de una capa de estructuras globulares pero no hubo proliferacin
de callos eficiente (datos no mostrados). Sin embargo, la adicin de prolina sola al
medio MS que contiene picloram no indujo la formacin de embriones globulares
translcidos (datos no mostrados). Es la combinacin de hidrolizado de casena y
prolina que dio como resultado un aumento significativo del nmero de DSE y la
proliferacin de callos como se indica por el peso fresco, en comparacin con el medio
MS que contiene picloram y desprovisto de hidrolizado de casena y prolina (Tablas 2,
3). Estos resultados sugieren que la combinacin de hidrolizado de casena y prolina es
esencial en la induccin y proliferacin de callo para D. rotundata (Tabla 3). Osifo
(1988) observ la induccin de embriones somticos en medio MS suplementado con
NAA y hidrolizado de casena (1 g / l) utilizando embriones zigticos como explantes en
D. rotundata en condiciones de luz y se obtuvieron callos blancos cremosos suaves con
un promedio de 4,5 embriones / Explant. Takamori et al. (2015) hicieron observaciones
similares en especies de Urochloa usando picloram y casein hidrolizado para obtener
callos embriognicos. La adicin de hidrolizado de casena y prolina al medio aument
la formacin de callos embriognicos en Allium cepa, Triticum aestivum y Oryza sativa
(Khaleda y Al-Forkan, 2006) y Ramakrishnan et al. La presencia de aminocidos en el
medio de cultivo es una fuente de NH4 \ alpha. Su suplemento a concentraciones
ptimas puede aumentar el nivel de nitrgeno reducido, que estimula la induccin y el
desarrollo del embrin somtico (Ramakrishnan et al., 2013).

fig. 3) embriognesis somtica y regeneracin de plantas en D. rotundata TDr 2346. un

callo derivado de picloram (0,5 mg / l) suplementado con hidrolizado de casena (600
mg / l) y prolina (1 g / l) despus de 8 semanas de cultivo. La flecha azul indica el callo
blanco lechoso. La flecha roja indica estructuras hinchadas blancas (barra 1 cm); B, c
imagen microscpica del callo derivado de picloram (0,5 mg / l) suplementado con
hidrolizado de casena (600 mg / l) y prolina (1 g / l, bar 1 mm); D imagen microscpica
de DSE blanco lechoso derivado de picloram (0,5 mg / l) suplementado con hidrolizado
de casena (600 mg / l) y prolina (1 g / l, bar 1 mm); E calus derivados de picloram (0,5
mg / l) suplementado con hidrolizado de casena (600 mg / l) y prolina (1 g / l) prpura
en medio MS suplementado con carbn activado (1%) despus de 6 semanas de cultivo
Mm); F induccin de embriones indirectos en la superficie del callo prpura en medio
MS suplementado con BAP (0,4 mg / l; bar 1 mm); G vista de cerca de los embriones
somticos (barra 1 mm); H desarrollo de embriones somticos: la flecha indica la
apertura de los embriones somticos al final de la primera subcultura en medio MS
suplementado con BAP (0,4 mg / l, bar 1 mm); I continuacin de la maduracin de los
embriones mediante la formacin de collares cotilednicos (barra 1 mm); J embriones
somticos en forma de copa (barra 1 mm); K germinacin de embriones somticos de
los collares despus de la segunda subcultura en medio MS suplementado con BAP (0,4
mg / l, bar 1 mm); L, m vista clara de los collares cotiledonarios y tipo de germinacin
de gancho (barra 1 mm); N, o germinacin de callo en medio MS suplementado con
BAP (0,4 mg / l) despus de la tercera subcultura (bar 1 cm); P germinacin de callos
compactos duros derivados de picloram (12 mg / l, bar 1 cm); Q plntula
completamente desarrollada con brotes y races en medio YBM despus de la cuarta
subcultura (barra 1 cm); R aclimatacin de plantas en bolsas de polietileno durante 4
semanas (bar 1 cm); S, t plantas endurecidas en la casa de la pantalla (barra de 1 cm).
(Figura de color en lnea)

Efecto del carbn activado en la induccin indirecta de embriones somticos

En este estudio, los callos derivados del picloram en combinacin con el hidrolizado de
casena y prolina, subcultivados en el medio basal o citocinina (BAP, GA3) modificaron
el medio no apoyan la maduracin y germinacin del embrin, pero producen races
adventicias en lugar de embriones que germinan en plntulas (Figura 2e-g). Esto podra
deberse al efecto de los desequilibrios exgenos o endgenos de la auxina en callam
de yam, que podran haber causado la formacin de races y la falta de desarrollo de
embriones y la posterior germinacin en el medio basal MS y en el medio MS
suplementado con BAP. Por lo tanto, se evalu el efecto de diferentes concentraciones
de carbn activado (0,2 y 1%) en la induccin de embriones somticos secundarios,
diferenciacin y maduracin de embriones somticos procedentes de callos
embriognicos derivados de medios con diferentes concentraciones (0,5, 1,5, 7, 12
mg / L) de picloram (Tabla 3). La transferencia de callos a medio MS que contiene
carbn activado (1%) durante 6 semanas indujo la formacin y desarrollo de embriones
somticos. Dependiendo de las concentraciones de carbn activado y picloram, los
callos produjeron antoci- ninas e indujeron la formacin de embriones somticos
indirectos (Tabla 4, Fig. 3e-h). Hubo una interaccin significativa entre diferentes
concentraciones de carbn activado y callos derivados de diferentes concentraciones
de picloram sobre antocinina y frecuencia de induccin de embriones somticos (Tabla
4, Fig. 3e-g). El calli derivado de concentraciones ms bajas (0,5 y 1,5 mg / l) de
picloram mostr una coloracin ms prpura en medio MS suplementado con carbn
activado al 1% en comparacin con callos derivados de mayores concentraciones (7 y
12 mg / l) de picloram. Estos calos prpuras de 0,5 y 1,5 mg / l de picloram condujeron
a la produccin de una alta frecuencia de embriones somticos (70,6 y 63,3%,
respectivamente) en medio MS suplementado con 1% de carbn activado (Tabla 4, Fig.
3e-h ). El nmero de embriones / callos somticos producidos a 0,5 y 1,5 mg / l de
picloram fue de 87,3 y 72,3, respectivamente. Los callos derivados de las
concentraciones de picloram de 7 a 12 mg / l produjeron una frecuencia baja (38 y
24,6%, respectivamente) de embriones somticos (Tabla 4, Fig. 3p). La baja frecuencia
de embriones somticos formados a partir de callos derivados de concentraciones ms
altas de picloram podra deberse a los callos compactos, que contenan pocos pro-
embriones que no proliferaron en medio picloram modificado con hidrolizado de
casena y prolina. Se encontr que el medio MS suplementado con carbn activado al
1% era ptimo para inducir la coloracin prpura, lo que condujo a una produccin
mxima de embriones somticos en comparacin con el 0,2% de carbn activado
(Tabla 4). Los callos derivados de todas las concentraciones de picloram no proliferaron
cuando se cultivaron en medio MS carente de carbn activado (Tabla 4). El callo al
transferir al medio MS suplementado con carbn activado tambin produjo primordios
de brotes adventicios, lo que fue confirmado por histologa (Fig. 4f). Estos resultados
sugieren que el carbn activado absorbe el picloram de los medios de comunicacin
eficientemente y promueve la induccin de embriones somticos, as como brotes de
brotes adventicios. En la mayora de los casos, la auxina se requiere para la induccin
de la embriognesis somtica, pero es inhibitoria para la maduracin de los embriones
somticos. En general, la diferenciacin de embriones somticos de calos ocurre en la
ausencia completa de auxinas (Zimmerman 1993). Los resultados del presente estudio
muestran que la eliminacin de picloram y la inclusin de carbn activado en medio MS
son cruciales para la induccin del embrin somtico indirecto. Esto confirma los
resultados de Jimnez (2001) que postularon que la eliminacin de auxinas result en
la inactivacin de varios genes para la activacin del programa embriognico. Por lo
tanto, los callos en el medio enriquecido con auxina no podran ser capaces de
sintetizar todos los productos gnicos necesarios para completar la etapa globular de la
embriognesis. Se sugiere que los callos necesitan una cierta cantidad de picloram
para formar embriones somticos y el carbn activado es importante para absorber el
exceso. Tambin se ha informado que el carbn activado ayuda a la induccin,
maduracin o germinacin de embriones somticos al absorber metabolitos txicos en
varias especies de cultivos (Thomas 2008). En Ocotea catharinensis, una especie de
rbol forestal, la induccin de embriones somticos ocurri slo en el medio basal MS
suplementado con 0,03 g / l de carbn activo en la oscuridad (Moura-Costa et al.,
1993).

A partir del presente estudio, se ha confirmado que el picloram es esencial para la

embriognesis somtica en D. Rotundata, aunque la retirada de picloram y la inclusin
de carbn activado son necesarios para la proliferacin y maduracin de embriones
somticos de callos. La inclusin del carbn activado al 1% para los callos derivados de
picloram puede haber creado una respuesta al estrs que sintetiz antocianinas en los
callos y los volvi morados, lo que condujo a la formacin de embriones somticos
(Malabadi y van Staden 2006). Lo'pez-Pe'rez et al. (2005) informaron que el carbn
activado mejor la embriognesis somtica, la formacin de brotes, Y la recuperacin
de plantas, y ayud en la prevencin de embriones somticos anormales en cultivares
de vid. Se ha informado de estudios previos en otros cultivos que el carbn activado
reduce las concentraciones de sal y hormona de crecimiento del medio y disminuye
sustancialmente los niveles de cidos fenilacticos y p-hidroxibenzoicos que inhiben la
embriognesis somtica (Bhansali y Singh 2000). Absorbe el 5-hidroximetil furfural, un
inhibidor formado por la degradacin de la sacarosa durante el autoclave, as como el
Cantidad de auxinas y citoquininas (Weatherhead et al., 1978). El carbn activado
tambin absorbe ciertos quelatos de hierro que impiden la transicin de embriones
globulares y en forma de corazn (Bhansali y Singh 2000). Por lo tanto, en D.
rotundata, el uso de carbn activado podra haber absorbido y eliminado varios tipos
de inhibidores que habran impedido la induccin y el desarrollo del embrin somtico.

Fig. 4 Histologa de la embriognesis somtica en D. rotundata. Una vista en seccin LS

(longitudinal) de la yema axilar de 3 das con apical Porcin (flechas); B LS del explante
de la yema axilar que contiene la induccin directa del embrin somtico en la pocin
apical (flechas); Cts (Transversal) del callo que muestra el grupo de clulas
embriognicas (flechas rojas) y no embriognicas (flechas blancas); D TS de callos
embriognicos que muestran induccin de embriones somticos y granos de almidn
(flechas); E mayor vista de la ampliacin de los granos de almidn (flechas); F TS de
callo que muestra induccin adventicia del brote (flechas); G embrin somtico maduro
que muestra el meristema apical del brote (flecha roja) y el meristema apical de la raz
(flecha blanca); H mayor vista de aumento del meristema apical de la raz; I mostrando
germinacin de plntula. Barra de escala 200 lm (a, b, g e i), 150 lm (dy f) 100 lm (c y
h), 50 lm (e). (Figura de color en lnea)Germination of somatic embryos, plant
regeneration and acclimatization

Los embriones somticos maduros derivados de callos prpura se tornaron verdes y

continuaron su maduracin cuando se transfirieron a un medio MS sin hormona de
crecimiento o se suplementaron con BAP (0,4 mg / l, Tabla 5, Fig. 3i-m). El primer signo
de maduracin fue la formacin del collar cotiledonario inicial de los embriones
globulares en la superficie de los callos prpura despus de 4 semanas de cultivo
(Figura 3h). Se observ maduracin con apertura gradual del collar cotiledonar (Fig. 3i,
j). Hojas pequeas comenzaron a emerger de la abertura del collar (Fig. 3j, k) y
germinaron despus de la transferencia a medios frescos suplementados con BAP (0,4
mg / l). Se observ el tipo de germinacin de los collares (Fig. 3l, m). Se observ un
mayor nmero de collares cotilednicos en medio MS suplementado con 0,4 mg / l de
BAP en comparacin con 1 mg / l de BAP (Tabla 5). Los callos Derivados de las
concentraciones ms bajas de picloram (0,5 y 1,5 mg / l) mostraron los collares
cotiledonarios mximos en comparacin con los callos derivados de las
concentraciones ms altas de picloram (7 y 12 mg / l). Esto puede deberse al efecto de
mayores concentraciones de picloram, que produjeron estructuras globulares
compactas y callos de este tipo no se volvieron morados tras ser transferidos al medio
que contiene carbn activado. Las estructuras compactas opacas, observadas con
picloram (0,5 mg / l), germinaron con baja frecuencia en medio MS suplementado con
BAP (0,4 mg / l).

El presente estudio revel que BAP es eficaz en la germinacin de embriones

somticos, pero slo en una baja concentracin (Tabla 5]. A una mayor concentracin,
la frecuencia de induccin de los brotes se redujo significativamente. La mala
germinacin de los embriones es una limitacin importante asociada con la
embriognesis somtica en muchas plantas (Odutayo et al., 2005). La maduracin,
germinacin y conversin de embriones somticos en plntulas son etapas de
desarrollo embriognico post-somticas crticas para la regeneracin exitosa de la
planta. Se realizaron secuencias de observaciones en el desarrollo embrionario
somtico de D. floribunda (Ammirato 1984, Twyford y Mantell 1996). Ammirato (1984)
observ la formacin de un collar cotiledonario alrededor de la primera hoja primordial
en cada embrin somtico en D. floribunda. Osifo (1988) observ estructuras
cotilednicas en forma de abanico en la fase inicial de induccin del embrin somtico,
similar a los explantes zigticos de embriones de D. rotundata, que se desarrollaron en
plntulas. Adems, Twyford y Mantell (1996) tambin observaron el tipo de
germinacin del colgajo y del gancho cotilednicos en D. alata. En el presente estudio
se observaron los collares cotiledonarios y los tipos de germinacin en forma de
abanico y gancho (Fig. 3f-m). Los presentes resultados estn de acuerdo con los
informes anteriores descritos para la embriognesis somtica en las especies de ame.
Hasta donde sabemos, hasta ahora no ha habido representacin pictrica de la
induccin, desarrollo y germinacin de embriones somticos en D. rotundata. Este es el
primer reporte que documenta los collares cotiledonarios globulares, en forma de copa
o en forma de abanico y el tipo de germinacin de gancho en D. rotundata usando
imgenes del microscopio digital (Fig. 3). Los brotes adventicios tambin fueron
germinados de los grupos de callos a travs de la organognesis (Fig. 3n). Despus de
la germinacin, las plantas se separaron y se cultivaron en YBM para el alargamiento
adecuado de los brotes y el enraizamiento durante 4 semanas (Fig. 3q). Las plantas
germinadas se aclimataron con xito en pastillas de turba, se cubrieron con bolsas de
polietileno durante 4 semanas, se transfirieron al suelo y al estircol en una proporcin
de 1: 1 y se cubrieron con bolsas de polietileno durante 4 semanas. Las plantas se
aclimataron lentamente haciendo agujeros en las bolsas de polietileno y se liberaron al
medio ambiente con una tasa de supervivencia del 90% (Fig. 3r, s). No se observ
variacin morfolgica aparente entre las plntulas regeneradas y las plantas donantes
(Fig. 3t).

Anlisis histolgico

El examen histolgico de los materiales vegetales revel la ontogenia de la

embriognesis somtica y la organognesis en D. rotundata. Las regiones
apicales de la yema axilar con clulas meristemticas se divide en los
explantes iniciales cultivados para la induccin del callo (Fig. 4a). En las
primeras 4 semanas de cultivo, se observ la aparicin de embriones
somticos directos y la proliferacin de embriognicos y no embriognicos Calli
se observ en 8 semanas de cultivo (Fig. 4b, c). Los embriones directos, que
son de origen multicelular, Surgi en la regin apical proliferante externa de los
explantes de yemas axilares cultivadas en medio MS que contiene picloram
(0,5 mg / l) con hidrolizado de casena y prolina despus de 4 semanas de
cultivo (Figura 4b). Las clulas embriognicas tienen un ncleo prominente y
una pared celular delgada, lo que confirma la rpida divisin celular con
capacidad embriognica. Las protuberancias que surgieron en 4 semanas de
cultivo progresaron En callos que contienen clulas embriognicas (como se
indica mediante flechas rojas en la figura 4c). Tambin se observaron clulas
no embriognicas en 8 semanas de cultivo (como se indica mediante flechas
blancas en la Fig. 4c). En el presente estudio, la induccin y diferenciacin de
embriones somticos fueron asincrnicos en la superficie de los callos y se
observ una divisin sucesiva continua en todas las direcciones de los callos
embriognicos que contenan granos de almidn que dieron lugar a pequeas
estructuras globulares claramente de origen multicelular, Embriones somticos
indirectos (Fig. 4d, e). Viana y Mantell (1989) tambin demostraron estructuras
D. composita y D. cayenensis. Sus observaciones concluyeron que las
estructuras globulares fueron inducidas en la Perifricas como agregados
multicelulares compuestos por clulas meristemticas densamente
citoplsmicas. En general, los grupos de embriones somticos estn formados
por clulas meristemticas con un citoplasma denso, un ncleo grande y
muchos granos de almidn como se observa en el anlisis histolgico del callo
producido en medio MS que contiene picloram (0,5 mg / l) con hidrolizado de
casena y prolina despus de 8 semanas Del cultivo (figura 4d, e). La
acumulacin de granos de almidn en los embriones somticos proporciona
una fuente de energa para el Embriones en palma aceitera (Kanchanapoom y
Domyoas 1999). Las secciones histolgicas del presente estudio Demostr la
formacin de brotes adventicios de callo (Fig. 4f). Los embriones fueron
documentados con meristemos apicales de los disparos (flecha roja),
meristemos apicales de la raz (flecha blanca) conectados con los tejidos
vasculares (Fig. 4g, h) y posteriormente germinados en plntulas (Figura 4i).
Observaciones similares se hicieron en embriones somticos de Colocasia
esculentum durante la maduracin y germinacin y concluyeron que el
meristemo de rodaje y el meristema de raz estn conectados por tejidos
vasculares (Pradeep et al., 2009). Los estudios histolgicos demostraron que la
regeneracin de D. rotundata a travs del callo aqu informado es a travs de
la embriognesis somtica y la organognesis que conduce a la produccin de
brotes adventicios.

Conclusin

En el presente estudio, se estableci un protocolo de regeneracin de plantas eficiente

y fiable para D. rotundata. El mtodo desarrollado utilizando el brote axilar como
explante es ms simple y ms fiable, ya que las vides se propagan fcilmente in vitro
durante todo el ao, por lo que no hay limitacin a los explantes de partida. El medio
MS suplementado con 0,5 mg / l de picloram demostr ser ptimo para la induccin de
callos embriognicos. La adicin de aditivos nitrogenados orgnicos como el hidrolizado
de casena (600 mg / l) y la prolina (1 g / l) mejor la eficiencia de produccin de callos
embriognicos. El carbn activado (1%) desempe un papel Induciendo tanto brotes
adventicios brote y embrin somtico de induccin y maduracin. Los embriones
maduros y los brotes adventicios de brotes germinaron en medio MS suplementado con
BAP 0,4 mg / l. Los estudios histolgicos confirmaron que la regeneracin de D.
rotundata que se informa aqu es a travs de la embriognesis somtica y la
regeneracin adventicia de brotes. Los callos producidos en medio MS que contiene
picloram (0,5 mg / l) suplementado con hidrolizado de casena y prolina eran tanto
embriognicos como no embriognicos.
Los callos embriognicos mostraron desarrollo de embriones somticos y su
germinacin en plntulas completas, Sin embargo, los callos no embriognicos
desarrollaron brotes mltiples. El sistema de regeneracin informado aqu necesita una
mayor mejora con la seleccin de callos embriognicos en etapas tempranas con el fin
de evitar la produccin de brotes adventicios.