Evaluacion de Metodos de Micropropagacion Vegetativa de Arandanos - Desbloqueado

UNIVERSIDAD DE TALCA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA DE AGRONOMIA
EVALUACION DE METODOS DE MICROPROPAGACION VEGETATIVA DE
ARÁNDANOS in vitro (Vaccinium corymbosum)
MEMORIA DE TITULO
MARÍA DE LA PAZ TAPIA SALAS
TALCA – CHILE
2009
APROBACIÓN
Profesor Guía: Ing. Agr., M.S., PhD. Jorge Retamales Aranda

Profesor Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad de Talca
Profesor Informante: Ing. Agr., PhD. Rolando García González

Profesor Auxilia Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales
Universidad Católica del Maule
RESUMEN
El arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) es un frutal menor perenne,
considerado dentro del grupo de los berries y que ha alcanzado una gran importancia para la
agricultura de nuestro país. Los campos en Chile se han plantado principalmente con plantas
de dudosa calidad genética y fitosanitaria lo que pudiera comprometer el futuro de este
importante fruto de exportación. Las técnicas de cultivo de tejidos pueden contribuir al
desarrollo de plantaciones más seguras tanto por su calidad genética como fitosanitaria. Los
objetivos de este proyecto de tesis están enfocados en establecer una metodología de
micropropagación in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum), para producir
plantas de alta calidad genética y fitosanitaria mediante la evaluación de protocolos de
desinfección y establecimiento al cultivo in vitro.
Para desarrollar un protocolo de micropropagación homogéneo en variedades de arándanos
se determinó que el mejor procedimiento para la desinfección y el establecimiento de arándano
consistió en desinfectar brotes jóvenes con etanol al 70% por 30 segundos e Hipoclorito de
Sodio al 0,1% más HgCl2 al 0,01%.
Los segmentos nodales establecidos sobre medio WPM suplementado con 2-iP a 4 mgL-1
produjeron los mayores niveles de brotación y calidad de los brotes. Se estableció que el
cultivo de segmentos nodales de brotes in vitro en medio WPM generó los mayores porcentajes
de brotación en todas las variedades, suplementando con 4 mgL-1 de 2-iP. La tasa máxima de
multiplicación se obtuvo a las seis semanas. El procedimiento descrito permite propagar de
manera eficiente esta especie y estará disponible para uso público y privado.
ABSTRACT
Highbush blueberries (Vaccinium corymbosum) have become a very important horticultural
species. In Chile, most of the current blueberry orchards have been planted with plants
produced with low quality regulations for their genetic properties or under low phytosanitary
standards. Tissue culture approaches can be useful to develop planting material with high
genetic and phytosanitary quality by propagating selected plant material in relatively short
period. In this study a protocol for plant micropropagation was established for different blueberry
cultivars by testing several conditions for in vitro establishment and organogenesis from nodal
explants. The highest efficiency for plant establishment and shoot formation into in vitro
conditions was obtained by washing young shoots from nursery plants with ethanol 70% for 30
seconds, Sodium Chlorine 0,1%, HgCl2 al 0,01%. Those explants cultivated on WPM
suplemented with 2-iP a 4 mgL-1 yielded the highest shoot emission and physiological quality of
the shoots. For the micropropagation step it was determined that the best propagation rate was
obtained when nodal segments from six weeks in vitro plants where cultivated on WPM
suplemented with 4 mgL-1 of 2-iP. The propagation efficiency depended on the genotype but a
standard protocolo was established by managing the interaction between basal medium and
plant growth regulators. It was established that blueberry reach its highgest propagation rate in
the six week after planting in the studied media.

INDICE
I. INTRODUCCION 1
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4
2.1. Descripción de la especie 4

2.1.1. Botánica 4
2.1.2. Propagación de arándanos 5
2.2. Cultivo de tejidos vegetales 6

2.2.1. Desinfección, introducción, establecimiento de material vegetal al
cultivo in vitro. 8
2.3. Micropropagación vegetativa in Vitro 9

2.3.1. Ventajas 11
2.3.2. Desventajas 11
2.4. Efecto del medio de cultivo sobre la eficiencia en la micropropagación de

plantas. 12
2.5. Rol de los reguladores del crecimiento en la micropropagación in vitro de

especies vegetales. 14
2.6. Cultivo in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum). 16
III. MATERIALES Y METODOS 18

3.1. Material vegetal 18
3.1.1. Material vegetal para ensayo de desinfección y brotación. 18
3.1.2. Material Vegetal para ensayo de multiplicación. 18
3.2. Desinfección, introducción y establecimiento in vitro del cv. Brigitta a partir de

segmentos nodales. 18
3.3. Criterios de Evaluación y diseño del experimento de tratamientos desinfectantes. 20
3.4. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de

arándanos de arbusto alto cv. Brigitta durante el establecimiento in vitro. 20
3.4.1. Diseño experimental y criterios de evaluación. 21
3.5. Efecto de los medios basales y reguladores del crecimiento sobre la tasa de
multiplicación de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) cultivados in vitro. 21
3.5.1 Criterios de evaluación y diseño del experimento de tratamiento de
multiplicación. 22
3.6. Efecto de la posición de los explantes sobre la tasa de multiplicación en plantas

in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum). 23
3.6.1 Criterios de evaluación y diseño del experimento.
23
3.7. Análisis Estadístico. 23
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 24
4.1. Efecto de desinfectantes sobre el establecimiento al cultivo in vitro de

segmentos nodales del cv. Brigitta. 24
4.2. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de

arándanos de arbusto alto cv. Brigitta durante el establecimiento in vitro. 26
4.3. Efecto de la interacción de dos medios basales (WPM y MS) y diferentes

concentraciones de Citoquininas/Auxinas, sobre la tasa de multiplicación de plantas de
arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum). 27
4.4. Efecto de la posición de explantes de arándanos de arbusto alto (Vaccinium

corymbosum) de los cv. Elliott y Bluecrop sobre medio basal WPM suplementado con 2-iP
(5mg L-1). 33
4.5. Evolución temporal de la tasa de multiplicación en Vacciunium corymbosum cv.

Bluecrop, OŃeal y Elliott. 34
V. CONCLUSIONES 38
VI. BIBLIOGRAFIA 39
INDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Tratamientos utilizados para la desinfección de explantes de arándanos de

arbusto alto cv. Brigitta. 19
Cuadro 2. Tratamientos con reguladores de crecimiento para establecimiento y brotación

de arándanos de arbusto alto cv. Brigitta. 21
Cuadro 3. Tratamientos de multiplicación para los cv. Elliot, Bluecrop y OŃeil. 22
Cuadro 4. Efecto de tratamientos desinfectantes sobre la tasa de desinfección, la tasa de

oxidación y tasa de brotación en arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta a los 21 días
desde introducción. 25
Cuadro 5. Efecto de reguladores del crecimiento sobre la tasa de brotación y aparición

de hoja en arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta a los 14 días desde introducción. 27
Cuadro 6. Efecto de la interacción de dos medios de cultivo WPM y MS y 6 tratamientos

con reguladores de crecimiento sobre la tasa de multiplicación de plantas de arándano
de arbusto alto in vitro, después de 6 semanas de cultivar las plantas. 28
Cuadro 7. Efecto de medios de cultivo basales sobre la tasa de multiplicación en

arándanos de arbusto alto. (Vaccinium corymbosum) después de 6 semanas de cultivar
las plantas. 32
Cuadro 8. Efecto de la posición horizontal y vertical de plantas de arándanos (Vaccinium

corymbosum), después de 6 semanas de cultivar las plantas. 33
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de

arbusto alto del cv. OŃeal en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos
de reguladores del crecimiento. 34

arbusto alto del cv. Elliott en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos
de reguladores del crecimiento. 35

arbusto alto del cv. Bluecrop en medio basal MS y WPM con sus respectivos
tratamientos de reguladores del crecimiento. 36
INDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1. Análisis del efecto de la interacción entre medios de cultivo y variedades de arándanos de
arbusto alto sobre la tasa de multiplicación in vitro. 28
Gráfico 2. . Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de

arándanos de arbusto Alto, Bluecrop, Elliott y OŃeal en medio basal WPM. 29
Gráfico 3. Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de

arándanos de arbusto Alto, Bluecrop, Elliott y OŃeal en medio basal MS. 30
I. INTRODUCCION
El arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) es un frutal menor perenne de gran
importancia comercial para Chile, considerado dentro del grupo de los berries (Buzeta, 1997). La
mayoría de los países productores de este fruto se encuentran en el hemisferio norte. Estados Unidos, el
principal mercado para la fruta producida en Chile, no solo es el mayor productor mundial sino que
también consume el 50% de fruta fresca, congelada o procesada. Si bien Chile es una fuente de
abastecimiento en contraestación de arándanos, es necesario destacar que Argentina, Nueva Zelanda,
Australia, Perú y Sudáfrica aparecen como fuertes competidores para los exportadores chilenos en el
corto y mediano plazo (Alcaíno, 2008).
En Chile el cultivo del arándano a escala comercial comenzó alrededor del año 1985, fecha
desde la cual el cultivo ha crecido en forma sostenida tanto en superficie como en volumen de
producción. Este desarrollo ha sido impulsado tanto por la alta demanda en el mercado norteamericano
como por la alta rentabilidad y difusión de su consumo en otros mercados del hemisferio norte (Dastres,
2008).
En la actualidad la superficie nacional cultivada con arándanos se estima en 10.700 ha, con un
volumen de exportación en la temporada 2007/08 cercana a las 30.195 T, observándose un crecimiento
del 42% con respecto a la temporada 2006/07 (Alcaíno, 2008; Rosas, 2008).
El crecimiento sostenido de la demanda no solo ha elevado las exportaciones, sino también ha
incrementado las exigencias de calidad en los mercados de destino. Por esta razon, los productores han
debido perfeccionar sus manejos agrícolas y prácticas productivas, lo que ha creado la necesidad de
optimizar los procesos de producción con tecnologías de alto nivel que permitan solucionar problemas
precisos de propagación y saneamiento de plantas. La biotecnología proporciona herramientas para
hacer frente a dichas necesidades, a través de la micropropagación que es una de las técnicas de mayor
desarrollo en la actualidad en el campo del cultivo de tejidos vegetales.
El cultivo in vitro se ha convertido en un método práctico y rentable que resuelve muchos de los
inconvenientes que presentan los productores de Chile, como por ejemplo: la escasez de material
vegetal de ciertas variedades y su consecuente alto costo de adquisición, la alta probabilidad de
1
obtener material vegetal enfermo y la heterogeneidad de plantas. Se ha demostrado que plantas de
arándanos de arbusto bajo (Vaccinium angustifolium) propagadas in vitro tienen un crecimiento de tallos
más largos y vigorosos con un mayor número de hojas que plantas multiplicadas por estacas (Debnath,
2005).
En líneas generales, las aplicaciones del cultivo in vitro con fines de investigación o comerciales
pueden concentrarse en tres ámbitos: mejoramiento genético, producción de plantas libres de
enfermedades y propagación vegetativa (Gravina et al., 1995).
La importancia del arándano como fruta de consumo en varios mercados ha impulsado el
desarrollo de proyectos de investigación en el campo del cultivo in vitro, la micropropagación y la
ingeniería genética (Rowland y Ogden, 1992; Cao et al., 1998; Cao et al., 2003). Se han establecido
protocolos de multiplicación a partir de brotes vegetativos en medio basal Woody Plant (WPM) (Lloyd y
McCown, 1980) con diferentes modificaciones en su composición nutricional (Cao et al., 2003). A su
vez, se ha evaluado la respuesta morfogénica de la especie ante la presencia de diferentes tipos de
citoquininas (Ostroloucká et al., 2004; Meiners et al., 2007). Estos estudios han concluido que en
arándanos las citoquininas, especialmente la zeatina tiene un efecto fisiológico más importante que las
auxinas para inducir la diferenciación de los brotes (Abdelnour-Esquivel, 1991; Ostroloucká et al., 2004).
La influencia del genotipo en la respuesta morfogénica ha sido evidenciada para esta especie y se ha
demostrado que existe interacción entre los reguladores del crecimiento y la variedad (Ostroloucká et
al., 2004; Debnath, 2005). Estas evidencias indican que las tasas de multiplicación en condiciones in
vitro pueden ser variables y dependientes de las condiciones de cultivo en las que se manejen las
diferentes variedades, lo que afectaría el desarrollo comercial de estos protocolos.
En Chile el estado de la tecnología para la propagación masiva de arándanos a escala
comercial se encuentra aún en desarrollo y bajo la regulación de las empresas que la explotan, por lo
que se hace necesario establecer protocolos eficientes y flexibles para el uso público. Por estas
razones, y basados en la hipótesis de que ”la respuesta morfogénica en arándanos de arbusto alto
podría ser inducida de manera homogénea en diferentes variedades para su uso público y comercial
mediante el manejo de la composición nutritiva del medio basal y el uso de reguladores del
crecimiento”, se han establecido los siguientes objetivos de trabajo.
2
OBJETIVO GENERAL
Establecer una metodología de micropropagación in vitro de arándanos de arbusto alto
(Vaccinium corymbosum), para producir plantas de alta calidad genética y fitosanitaria para uso público
y comercial.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Establecer un protocolo de desinfección y establecimiento al cultivo in vitro a partir de plantas
de arándanos de arbusto alto.
• Homogenizar la tasa de multiplicación en plantas de arándanos de arbusto alto
micropropagadas, mediante el manejo de la composición del medio de cultivo basal, el tipo y las
interacciones de los reguladores del crecimiento a diferentes concentraciones en el medio de
cultivo.
3
II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
2.1. Descripción de la especie
El arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum L.) pertenece a la familia Ericaceae,
subfamilia Vacciniaceae, subgénero Cyanococcus (Pritts y Hancock, 1992). Fue introducido a Chile en
la década de los 70 por el Istituto de Investigación Agropecuaria-INIA, pero su plantación a escala
comercial con destino a la exportación comenzó alrededor del año 1985. Las mayores áreas de
producción se encuentran entre la VII y la IX Región (Asoex, 2001).
Existen dos tipos principales de arándanos de arbusto alto, los del Sur y Norte, y se clasifican
de acuerdo a sus requerimientos específicos de horas de frío. Los del Sur requieren menos de 600
horas de frío y los del Norte de 750-1000 horas de frío a temperaturas menores de 7º C (Hancock,
1991).
2.1.1. Botánica
Es una planta de lento desarrollo vegetativo que crece naturalmente en el sotobosque de Norte
América. Se desarrolla en zonas de veranos templados con suelos ricos en materia orgánica y pH bajo,
entre 4,5 y 5,5 (Eck, 1988). Su sistema radical compuesto de finas raicillas, es superficial, fibroso y de
poca extensión. Carece de pelos radicales, por lo que su capacidad de absorción es mucho menor que
el de otras especies. La mayor parte de sus raíces se concentra dentro de los primeros 25 cm, en el
área dentro de la línea de goteo del arbusto, aunque pueden extenderse hasta 2 m desde el tallo
(Buzeta, 1997).
Sus hojas son simples, de bordes aserrados y se distribuyen en forma alterna a lo largo de la
ramilla. Su tamaño puede variar de 1 a 8 cm de largo y la forma varía de ovada a lanceolada.
El arándano de arbusto alto presenta una pigmentación rojiza bien marcada en sus hojas
durante el otoño. La floración es en racimos, generalmente axilares, pero pueden ser terminales en
algunas ocasiones (Buzeta, 1997).
4
El fruto es una falsa baya esférica. Dependiendo del cultivar puede variar en tamaño (0,7 a 1,5
cm de diámetro) y en color (desde azul claro hasta azul oscuro). La epidermis del fruto del arándano
alto es delgada, característica que probablemente le otorga una menor vida de poscosecha que la
especie “ojo de conejo” (Vaccinium ashei).
2.1.2. Propagación de arándanos
La propagación de esta especie puede realizarse por semillas, hijuelos, enraizamiento de
estacas o mediante cultivo de tejidos (Noé et al., 1998; Cao et al., 2003; Ostrolucká et al., 2004;
Meiners et al., 2007). La propagación por semilla sólo se utiliza para mejoramiento genético, ya que los
arándanos son especies altamente heterocigotas; por tanto, la descendencia no conserva las
características de los padres (Buzeta, 1997).
La propagación por estacas es una de las técnicas más utilizadas para la propagación
comercial de arándanos en Estados Unidos (Buzeta, 1997). Esta es la técnica de propagación más fácil
y económica de aplicar; sin embargo, en Chile ha tenido una serie de complicaciones que repercuten en
un bajo y a veces nulo enraizamiento. Estos resultados negativos pueden tener relación con las
distintas capacidades naturales de enraizamiento que presentan las variedades de arándanos. Pese a
que se ha importado material para el enraizamiento, esta práctica ha presentado complicaciones
técnicas debido a variaciones climáticas entre los sitios donde se originaron y desarrollaron las variedas
importadas (Muñoz, 1991).
Dado los reconocidos beneficios para la salud por su consumo, la demanda de arándano se
mantiene en aumento no solo en el mercado norteamericano, sino también en mercados no
tradicionales para este fruto, como el europeo y el chino (Alcaíno, 2008; Dastres, 2008), lo que ha
estimulado a los productores agrícolas de Chile a mantener un ritmo creciente en el establecimiento de
nuevas plantaciones, existiendo un recambio varietal y de especie, reduciendo la importancia relativa de
ojo de conejo y aumentando la de arbusto alto. Dentro de arbusto alto se están incorporando nuevas
variedades tanto de alto como bajo requerimiento de frío (Retamales, 20081).
5
La propagación de plantas es una actividad comercial interesante, sin embargo, los métodos
convencionales de propagación vegetativa son incapaces de proporcionar las grandes cantidades
necesarias de plantas requeridas por los actuales programas de desarrollo del cultivo de esta especie.
Por ello se requieren alternativas de métodos de propagación que aseguren mayores volúmenes de
plantas pero también una mayor calidad fitosanitaria y seguridad con los genotipos que se
comercializan (Debnath, 2007).
Debido a lo anterior se han buscado diversos mecanismos biotecnológicos para la obtención de
material vegetal de forma rápida y eficiente, de manera de mejorar la disponibilidad de estos para los
productores (Thorpe, 2007). Así se ha llegado a la masificación del cultivo de tejidos vegetales
mediante la micropropagación in vitro.
2.2. Cultivo de tejidos vegetales
El cultivo de tejidos vegetales en condiciones de asepsia debe su origen a las ideas del
científico alemán del siglo XX Haberlandt. El período entre los años cuarenta y los años sesenta fue
marcado por el desarrollo de nuevas técnicas y la mejora de aquéllas que ya estaban en práctica
(Thorpe, 2007). En los años noventa hubo una expansión continua en la aplicación de tecnologías in
vitro, con el principal objetivo de aumentar el número de especies de plantas de interés comercial
posibles de someter a estas técnicas.
Los diversos cultivos celulares han seguido siendo una herramienta importante en el estudio de
áreas básicas de biología y bioquímica y han asumido la gran importancia en estudios de biología
molecular y biotecnología agrícola (Thorpe, 2007).
1
Comunicación personal
6
El cultivo de tejidos vegetales comienza desde el momento mismo que se selecciona una
especie, después de haber identificado el problema que se debe solucionar y los medios para hacerlo.
Las técnicas de cultivo de tejidos destinadas a la micropropagación, descansan sobre dos procesos
morfogénicos fundamentales: la organogénesis y la embriogénesis somática (García et al., 2007).
La organogénesis es la formación de órganos vegetales a partir de un determinado tejido para
formar plantas completas. Esta se caracteriza por ser polar, es decir sólo se emite un órgano aéreo o
una raíz y a partir de ella se regenera la planta completa. A su vez, la organogénesis puede ser directa,
si el brote organogénico se obtiene directamente a partir del explante, o indirecta, si el proceso
organogénico ocurre a partir de callos formados previamente en el explante inicial (Sugiyama, 1999;
Vijaya y Giri, 2003).
La embriogénesis somática, no es más que la obtención de embriones a partir de tejido
somático de la planta (cualquier tejido no sexual) para obtener una planta completa. A diferencia de la
organogénesis, este es un proceso polar donde se obtienen las estructuras aéreas de la planta y las
raíces a partir del embrión somático. También puede ser directa o indirecta, si el proceso ocurre a partir
del explante inicial o a partir de callos previamente inducidos. Consta de cuatro etapas fundamentales:
A) Inducción del callo; B) Formación y proliferación de embriones; C) Maduración de los embriones; D)
Germinación de los embriones. A su vez los embriones pueden pasar por tres formas en su desarrollo:
la globular, la de corazón y la de torpedo (Ammirato, 1983).
Cada una de las etapas de la embriogénesis somática, así como las diferentes fases de los
embriones varía según las especies y los genotipos con los que se trabaje (García, 2007).
El desarrollo de las técnicas de regeneración de plantas mediante organogénesis o
embriogénesis somática ha sido el pilar del desarrollo de las técnicas de propagación masiva de
plantas.
Usualmente, se dice que el Cultivo de Tejidos consta de cuatro fases, pero ese concepto limita
el uso de esta técnica a la propagación masiva y hoy se sabe que el cultivo de tejidos tiene mucho más
alcance como tecnología. Es por esto que se considera que es la propagación de plantas mediante
cultivo in vitro la que tiene cuatro fases fundamentales (George y Debergh, 2008). Existen diversas
7
fases secuenciales características del cultivo in vitro. Según Pierik (1990), estas son:
Acondicionamiento, establecimiento, multiplicación, enraizamiento y adaptación ex vitro.
2.2.1. Desinfección, introducción, establecimiento de material vegetal al cultivo in vitro.
La contaminación por hongos, bacterias y levaduras causa grandes pérdidas en la
micropropagación comercial de especies vegetales y en los trabajos de investigación. El control de la
contaminación in vitro es fundamental para aumentar la eficiencia de la micropropagación (Digonzelli et
al., 2005).
La contaminación biótica en cultivo de tejidos es causada por la entrada de patógenos u otros
microorganismos contaminantes sobre o al interior de los explantes utilizados para el cultivo in vitro.
Estos pueden ser microorganismos presentes en el ambiente que causen contaminaciones en
cualquiera de las etapas del cultivo de tejidos o microorganismos que se encuentren dentro de la planta
(Loyola y Vásquez, 2006).
Se habla de contaminación endógena, al existir infestación a nivel interno del explante y no
poder ser eliminados por desinfección externa mientras que es exógena cuando la infestación ocurre a
nivel externo del explante, lo que puede ser causado por contaminación ambiental, métodos de
esterilización ineficientes o asociado a manejo humano (Loyola y Vásquez, 2006).
Digonzelli et al. (2005) plantean que la contaminación microbiana puede tener dos orígenes:
a) Microorganismos que colonizan la superficie o el interior del explante (endófitos) y b) Fallas en los
procedimientos de laboratorio.
Los contaminantes más frecuentes in vitro son los hongos, bacterias y levaduras, denominados
“vitro patógenos”, que en muchos casos no son patógenos en condiciones de campo. Su efecto es muy
dañino, ya que compiten con el explanto por los nutrientes del medio y les producen daños directos e
indirectos por la colonización de sus tejidos o la eliminación al medio de metabolitos tóxicos (Digonzelli
et al. 2005)
Las bacterias son los contaminantes más comunes y ocasionan serios problemas porque
pueden ser sistémicas, así como difíciles de detectar y de eliminar. Estos microorganismos escapan a
8
los efectos de los esterilizantes superficiales y pueden ser inter o intracelulares. Entre los últimos, se
encuentran virus, viroides y muchos géneros bacterianos como: Agrobacterium, Bacillus,
Corynebacterium, Lactobacillus, Erwinia, Enterobacter. Su distribución puede ser localizada o sistémica,
por xilema o por floema (Leifert et al., 1994.)
Con el objeto de disminuir la carga de microorganismos contaminantes tanto exógenos como
endógenos del tejido que se utilizará para micropropagar, debiera iniciarse un adecuado programa de
aplicación de fungicidas y bactericidas en plantas madres antes de la extracción de los explantes
(Seemann y Barriga, 1993).
Los contaminantes bacterianos no se manifiestan en los primeros subcultivos, ya que la alta
presión osmótica, el pH y ciertas hormonas de los medios de cultivo, pueden inhibir su crecimiento.
Debido a este efecto inhibitorio, muchos microorganismos requieren un periodo de adaptación
a las nuevas condiciones antes de manifestar su presencia, esto se da por lo general en la fase de
multiplicación.
2.3. Micropropagación vegetativa in vitro
La micropropagación in vitro es una técnica de multiplicación que consiste en un procedimiento
aséptico en el cual se manipulan plantas, órganos, tejidos o células para originar poblaciones de
plántulas. Este procedimiento implica que cada una de las plántulas que se producen pueda crecer y
ser fenotípica y genotípicamente idéntica a la planta de la cual procede. La micropropagación tiene la
gran ventaja de obtener un gran número de plántulas, a partir de una planta madre, resultado que no se
obtiene con los métodos clásicos de propagación vegetativa (Vidalic, 1992; George, 2008).
Thorpe (2007) y George (2008) describen esta práctica especificando que es el cultivo sobre un
medio nutritivo, totalmente aséptico de segmentos apicales y nodales en el que se encuentra su yema
axilar. Por su parte, Pierik (1990) caracteriza esta técnica como un cultivo sobre un medio nutritivo, en
condiciones estériles, de plantas, semillas, embriones, órganos, explantes, tejidos, células y
protoplastos de plantas superiores. Este cultivo de material vegetal se realiza en tubos de ensayo o en
9
recipientes que puedan controlar de manera precisa, la asepsia, así como las condiciones ambientales
y nutritivas (Hartmann y Kester, 1995).
La micropropagación in vitro tiene la ventaja de multiplicar material libre de enfermedades,
debido a la total asepsia con que se trabaja. Así al detectar la presencia de bacterias y hongos en el
medio de cultivo, se excluye el material contaminado (Buzeta, 1997). Edwin et al. (2008), indican que no
es correcto decir que mediante la micropropagación se obtienen plantas libres de virus y bacterias, ya
que es imposible asegurar que una planta está libre de todas las enfermedades bacterianas o
contaminaciones virosas. Sólo se puede demostrar que una planta está libre de una contaminación
específica, siempre que estén disponibles las herramientas adecuadas de diagnóstico.
Pierik (1990) asegura que las células vegetales poseen totipotencialidad, lo que permite el
cultivo in vitro; es decir, cada célula vegetal viva con núcleo, es capaz de reproducirse de forma
completa e idéntica a la planta madre de la cual proviene. Según Haberlandt (1921) y Takebe et al.
(1971) la totipotencia celular es la capacidad heredable que tienen todas las células vivas de dar origen
a una nueva célula genéticamente idéntica y a partir de procesos de división celular y diferenciación
formar tejidos, órganos, sistemas y finalmente un individuo completo.
Desde el punto de vista práctico, los mecanismos que desencadenan la obtención de una
planta a partir de una célula o una sección de tejido dependen de factores que varían según la especie,
el tipo y la edad del tejido, las condiciones ambientales y la composición de los medios de cultivo
(García et al., 2007).
El cultivo in vitro presenta variados usos y utilidades, pues puede ser aplicado para estudios
fisiológicos, genéticos y bioquímicos. Puede usarse entre otros para la obtención de plantas libres de
patógenos, en la propagación masiva clones y en la conservación de germoplasma. (Hartmann y
Kester, 1995). Thorpe (2007), define esta aplicación como ideal para la masificación de especies o
genotipos con potencial comercial como son las flores de corte, las plantas ornamentales y los frutales.
La respuesta del cultivo in vitro variará dependiendo de varios factores, tales como: los
explantes que se utilicen, el medio de cultivo en el que se establecerá el material a propagar y la
combinación apropiada de reguladores del crecimiento (Pierik, 1990; George, 2008; George y Debergh,
2008).
10
2.3.1. Ventajas
El uso de este método proporciona diversas ventajas, entre las cuales podemos mencionar:
a) Homogeneidad en la producción de plantas.
b) Control de las condiciones ambientales.
c) Propagar utilizando diferentes vías vegetativas y en variedades que pueden resultar difíciles de
multiplicar por métodos tradicionales de propagación.
d) Mejorar el proceso de enraizamiento en plantas difíciles de propagar.
e) Obtener plantas de alta calidad sanitaria y seguridad en la identidad genética del producto final.
(Edwin, et al., 2008).
f) Plantas con mayor vida productiva, mayor vigor y mejor homogeneidad en el establecimiento
de plantas (Ozer, 2006).
g) Edwin et al. (2008) señalan que el número de plantas es mucho mayor que en
macropropagación, debido a la gran cantidad de plantas que se obtienen en un tiempo dado. Es
posible obtener además copias de plantas que son lentas y difíciles de propagar vegetativamente,
pudiendo ser la producción continua durante el año independiente de las condiciones estacionales.
2.3.2. Desventajas
Sin embargo, a pesar de lo anterior, la micropropagación presenta algunas desventajas:
a) Es una técnica especializada y con un alto costo inicial de producción (Edwin et al. 2008).
b) Podría existir variación genética respecto a la planta madre producida por la elevada tasa de
proliferación y la rápida multiplicación (Ellena, 1998).
c) Las plantas cultivadas in vitro no son capaces de satisfacer sus propios requerimientos de
compuestos orgánicos mediante fotosíntesis (no son autótrofos), por lo que tienen que sufrir un
período transitorio antes de crecer de forma independiente (Kozai y Smith, 1995).
11
d) Debido a que las plantas realizan niveles reducidos de fotosíntesis y crecen dentro de
recipientes cerrados con una alta humedad relativa, son altamente susceptibles a perder agua
en ambientes externos, produciendo plantas fisiológicamente difíciles de adaptar a condiciones
ex vitro (Edwin et al., 2008).
2.4. Efecto del medio de cultivo sobre la eficiencia en la micropropagación de plantas.
Los medios de cultivo son la fuente de energía, el soporte físico y el sustrato para el explante.
Su función principal es proporcionar los nutrientes básicos para el crecimiento continuo de los explantes
aislados y los propágulos subsiguientes, además de dirigir el crecimiento y desarrollo mediante el
control fisiológico a través de reguladores del crecimiento (Hartmann y Kester, 1995).
Por ser determinante en el crecimiento y desarrollo celular de la planta, en el sistema de
propagación in vitro se requiere definir los medios de cultivo para sus diferentes etapas (Salisbury y
Ross, 1994).
Existe un conjunto de elementos minerales que son esenciales para el crecimiento y desarrollo
de las plantas, los que se añaden de forma frecuente a los medios de cultivo. La preparación más
difundida entre los laboratorios comprende una agrupación de elementos base y nutritivos para inducir
el crecimiento y desarrollo (Edwin et al., 2008; García, 2007).
Estos son: a) Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S). Son aquellos elementos inorgánicos que la
planta consume en grandes cantidades y que intervienen en procesos vitales para la planta como la
fotosíntesis, el crecimiento y el enraizamiento. b) Los microelementos (B, Co, Cu, Mn, I, Fe, Zn, Ni).
Corresponde a elementos químicos o iones que la planta consume en pequeñas cantidades, pero que
son esenciales para el desarrollo de procesos metabólicos en la planta. (García et al., 2007; Edwin et
al., 2008).
Es de vital importancia proporcionar compuestos orgánicos para favorecer el desarrollo
morfogénico de plantas en cultivo in vitro. Estos pueden ser vitaminas, aminoácidos y sacarosa, entre
otros. La cantidad específica necesaria dependerá de la especie y genotipo de la misma, pero en
términos generales su proporción en el medio de cultivo debe ser baja (Edwin et al., 2008).
12
Las plantas en cultivo in vitro no fotosintetizan eficientemente, por lo que se necesita el
suministro de carbono orgánico que garantice la energía necesaria para el metabolismo celular. La
fuente de carbono más utilizada es la sacarosa, debido a su bajo costo y mayor disponibilidad
comercial; además, garantiza que los dos monosacáridos que la componen (glucosa y fructosa) estén
disponibles en el medio una vez hidrolizada. Así las células vegetales pueden hacer uso de ellas de
acuerdo a sus necesidades (Thorpe et al., 2008).
Las vitaminas facilitan la respuesta de los tejidos vegetales y permiten manejar la oxidación en
algunos tipos de explantes. Dentro de las vitaminas más utilizadas se encuentran: Tiamina, Myo-
inositol, mesoinositol, piridoxina, ácido nicotínico y ácido ascórbico. A pesar de que no son esenciales
en la composición de los medios de cultivos, los aminoácidos más utilizados, y que también permiten
modular la respuesta oxidativa y las respuestas morfogénicas de los tejidos son: glicina (la más
utilizada), arginina, aspargina, ácido aspártico, alanina, ácido glutámico, glutamina, prolina y L-cisteína
(George y de Klerk, 2008).
Para los medios de cultivo sólido se necesita de un material inerte que facilite la estructura
física que soporte las plantas, permita la asimilación de los nutrientes y que a su vez mantenga los
tropismos deseados en función del tipo de explante y la especie con la que se trabaje. Se utilizan los
medios solidificados con agar, phytagel o almidones (Chiriqui, 2008).
La preparación de los medios de cultivo es una fase crítica en los procedimientos de cultivo de
tejidos, pues de ella depende la correcta ejecución de los experimentos y los resultados obtenidos
(García et al., 2007).
El pH del medio de cultivo juega un papel importante en la eficiencia de asimilación de los
elementos nutritivos y también en la solidificación de los medios líquidos. Por lo general, y en
dependencia de la especie con la que se trabaje, el rango de pH debe estar entre 5 y 6,5. Valores de
pH por debajo de 5 en el medio de cultivo puede provocar la toxicidad de los iones Co2+ y Cu2+,
presentes en el medio de cultivo, y reducir la capacidad de polimerización de la mayoría de los agentes
gelificantes. Por encima del pH 6,5 se afecta la solubilidad de las sales presentes en el medio de
cultivo y la asimilación del nitrógeno que se encuentra en el medio en forma de NH4 (George y de Klerk,
2008).
13
Ostrolucká et al. (2004) estudiaron el efecto de diferentes valores de pH (3,0; 3,5; 4,0; 4,5 y
5,0), sobre la regeneración de brotes en plantas de arándanos Vaccinium corymbosum cv. Duke,
obteniendo resultados óptimos entre pH 4,0 y 5,0.
Para la introducción de plantas de carácter leñoso se utilizan diferentes medios de cultivo,
dependiendo de la especie vegetal que se trate. Generalmente para una especie leñosa como
Vaccinium corymbosum se usa el medio Woody Plant Medium (McCown y Lloyd, 1983) suplementado
con 2-iP (citoquinina), regulador del crecimiento con que las plantas leñosas presentan una mejor
respuesta en la estimulación del crecimiento y desarrollo debido a una mayor estimulación a la división
celular (Muñoz, 1990).
2.5. Rol de los reguladores del crecimiento en la micropropagación in vitro de especies
vegetales.
Las hormonas son compuestos orgánicos sintetizados por las plantas superiores. Estos influyen
en el crecimiento y desarrollo de la misma, actúan generalmente distante al lugar donde son producidas
y son activas en pequeñas cantidades. Existen productos de origen sintético que actúan de forma
semejante a las hormonas. A este conjunto de productos sintéticos más las hormonas se les denominan
reguladores del crecimiento. Estos intervienen en los procesos metabólicos y fisiológicos de las plantas
y determinan el crecimiento relativo de todos sus órganos (Pierik, 1990; Chriqui, 2008).
La utilización de reguladores del crecimiento en el cultivo in vitro es muy importante,
especialmente las auxinas y citoquininas, tanto así que un grupo importante de especies no podría
cultivarse in vitro sin el uso de éstas (Thorpe, 2007). Además, cabe señalar que la respuesta al uso de
auxinas y citoquininas dependerá del tipo de explante y de la especie vegetal (Pierik, 1990; Machakova
et al., 2008; van Staden et al., 2008; Moshkov et al., 2008).
En los procesos de morfogénesis in vitro son elementales las auxinas y citoquininas, ya que
estimulan la elongación y división celular, según la combinación y concentración de estas. La auxina
juega un papel fundamental induciendo la elongación, o en algunos casos la división celular. Por otro
14
lado, frecuentemente las auxinas inducen la formación de raíces adventicias e inhiben la formación de
tallos adventicios (Pierik, 1990).
Klee y Estelle (1991) precisaron que en condiciones de propagación in vitro la respuesta del
tejido depende del tipo de regulador de crecimiento y la respectiva dosis utilizada, la cual será diferente
para cada especie vegetal. Por ello no existe una regla general en la respuesta morfogenética.
Kogl et al., (1934) lograron identificar por primera vez el Ácido Indol-3-Acético (AIA), una auxina
vegetal. El AIA se produce de forma natural en las plantas y es una de las responsables junto a otras
auxinas (IBA, ANA) de la elongación celular, expansión de los tejidos, y división celular, entre otros. Una
baja concentración de auxina promueve la formación de raíces adventicias, mientras que con altas
concentraciones tiene lugar la formación de callo (Pierik, 1990).
Las citoquininas se utilizan para estimular el crecimiento y el desarrollo, siendo las más
comunes: Kinetina, BAP y 2-iP. Generalmente estimulan la división celular y más aún si van en conjunto
con una auxina. En concentraciones altas promueven la formación de vástagos axilares; debido a que
disminuyen la dominancia apical, uno de sus efectos es retardar el envejecimiento.
Otro grupo de reguladores del crecimiento son las Giberelinas. Estas inducen la elongación de
los entrenudos y el crecimiento de los meristemos e inhiben la formación de raíces adventicias (Pierik,
1990; Machakouva et al 2008; Van Staden, 2008).
Existen otros compuestos como la Fenilurea y sus derivados. Se descubrió en diferentes
bioensayos que el DPU (N, N-difenilurea) presenta actividad tipo citoquinina. Los compuestos más
activos son las piridil ureas y las diazol ureas (Tidiazurón y derivados), que son hasta 10.000 veces más
activas que el DPU, y más activas que las citoquininas naturales, tipo adenina como la zeatina (Pierik,
1990; Van Staden,2008). El Tidiazurón (TDZ) estimula la proliferación de los vástagos en algunas
especies leñosas. Se ha encontrado que resulta activa en concentraciones de 0,05-0,1uM (Pierik,
1990).
En arándanos de arbustoo alto (Vaccinium corymbosum) la 2-iP y zeatina, son más efectivas en
la proliferación de brotes, que otras citoquininas (Eccher y Noe, 1989). La utilización de 2-iP es más
común, debido a su menor costo, pero al combinar ambos compuestos se obtienen mejores resultados
que al utilizar cualquier otro, o estos mismos de forma separada (Eccher y Noe, 1989).
15
2.6. Cultivo in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum)
La micropropagación de este grupo de especies de arándanos, está tomando mayor interés en
países productores y con potencial exportador (Edwin et al., 2008). Diversos estudios se han realizado
sobre la introducción, establecimiento y multiplicación de esta especie in vitro.
Cao et al. (2003) investigaron los efectos de la concentración de sacarosa en el medio de
cultivo para la micropropagación de Vaccinium corymbosum. En explantes de la variedad Bluecrop con
brotes axilares de 0,5 cm, se les aumentó la concentración de sacarosa en el medio de 15 mM a 24,
44 ó 54 (µM) respectivamente. No hubo respuesta en el aumento de número de brotes. En cambio en
cv.Duke, al aumentar las concentraciones de sacarosa de 15 a 48 µM y de 15 a 58 µM, hubo aumento
en el número de brotes.
Debnath (2007), estudió la influencia del Acido indol butírico (IBA) sobre la tasa de crecimiento.
En este estudio se observó mayor crecimiento y desarrollo de brotes de arándanos de arbusto bajo
(lowbush), Vaccinium angustifolium a concentraciones de 20 µM.
Ostrolucká et al. (2004), estudiaron el efecto de distintas concentraciones de zeatina (0,5; 1,0;
2,0 mgL-1), en medio basal Anderson sobre la regeneración de brotes en plantas de arándanos
Vaccinium corymbosum cv.Duke. Las evaluaciones fueron realizadas a las 5 semanas después del
cultivo de las mismas. Hubo mayor número de brotes por planta con una concentración de 2 mgL-1 de
zeatina.
Los mismos autores evaluaron el efecto de la zeatina (2,0 mgL-1) y 2-iP (15 mgL-1) sobre el
número de brotes por planta en los cultivares de Vaccinium corymbosum; Blueray, Darrow, Berkeley,
Bluecrop y Duke. Todos los cultivares respondieron positivamente a ambos compuestos, observándose
un aumento en el número de brotes por planta en todos ellos, pero en todos los cultivares el aumento
fue más significativo con zeatina. También se estudió el efecto de distintas concentraciones de
citoquininas, zeatina (0.25; 0.50; 0.75 mgL-1) y 2iP (2.5; 5.0; 10 mgL-1) en combinación con IBA (0.5
mgL-1), en medio basal Anderson, sobre la regeneración de brotes en plantas de arándanos Vaccinium
vitis-idaea cv. Red Pearl and Koralle. Hubo diferencias significativas en la intensidad de proliferación de
16
brotes entre el control (sin citoquininas) y el uso de zeatina y 2-iP. La excepción estuvo en Koralle,
donde la proliferación de brotes fue similar en el control con el uso de 2-iP. Zeatina tuvo mayor efecto
sobre la proliferación de brotes y también una mejor respuesta en Red Pearl (Ostrolucká et al., 2004).
Ellos concluyeron que la intensidad de proliferación de brotes no solo depende de la concentración de
citoquinina, sino también del tipo de citoquinina y de la variedad.
17
III. MATERIALES Y METODOS.
Los ensayos se realizaron durante el segundo semestre del 2007 (para ensayo de desinfección
y brotación), y primer semestre del 2008 (para ensayo de multiplicación). Ambos fueron efectuados en
el laboratorio de Cultivo de Tejidos, del Instituto de Biología Vegetal y Biotecnología, de la Universidad
de Talca.
3.1. Material vegetal
3.1.1. Material vegetal para ensayo de desinfección y brotación.
Se utilizaron plantas de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum), del cultivar
Brigitta, seleccionadas en la localidad de Curicó, Rincón de Sarmiento, parcela 15, Lote BC (Sur
34º54’14’’, Oeste 71º10’54.4’’). Se utilizaron segmentos nodales de brotes jóvenes, no lignificados,
específicamente de brotes laterales y apicales de aproximadamente 1 cm.
3.1.2. Material Vegetal para ensayo de multiplicación.
Se utilizaron plantas de arándano de tipo arbusto alto (Vaccinium corymbosum) de los cultivares
OŃeal, Elliott y Bluecrop.
3.2. Desinfección, introducción y establecimiento in vitro del cv. Brigitta a partir de segmentos
nodales.
Se evaluaron tres protocolos de desinfección mediante tres métodos en los cuales se manejó el
tipo de desinfectante, su concentración y tiempos de acción sobre los explantes.
Se recolectaron brotes de 10 cm a partir de plantas mantenidas en invernadero. Los brotes se
trasladaron al laboratorio donde se prepararon explantes de 5 cm desde la yema apical hacia la base
18
con el objetivo de introducir material vegetal ligeramente desarrollado, evitando el uso de material
lignificado o muy joven.
Para eliminar partículas de polvo y suelo provenientes del campo, los explantes se lavaron con
detergente comercial Quix y agua corriente, este lavado se desarrolló de manera contínua durante 10
minutos. Se cortó el brote en segmentos provistos de meristemas, de aproximadamente 3 cm de largo,
con el objetivo de disminuir la superficie del explante. En la cabina de flujo laminar todo el material
vegetal fue lavado con etanol al 70% como tratamiento previo a los diferentes protocolo de desinfección
(Cuadro 1).
Los explantes desinfectados se sembraron en medio basal WPM (Woody Plant Medium, por sus
siglas en inglés) suplementado con diferentes concentraciones de reguladores del crecimiento,
combinados de acuerdo a los objetivos del proyecto (Cuadro 2). Además el medio de cultivo se
suplementó con 30gL-1 de sacarosa y el pH se ajustó a 5,3 antes de esterilizar en el autoclave a 121ºC
y 1 kPa de presión por 30 minutos. Se colocaron cuatro explantes en frascos de propagación con tapas
herméticas de 7 cm de altura y 7 cm de diámetro y se cultivaron a 22° C, con una intensidad luminosa
de 30 μmolm-2s-1 y fotoperíodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.
Cuadro 1: Tratamientos utilizados para la desinfección de explantes de arándanos de arbusto alto cv.
Brigitta.
Tratamientos Concentración % Tiempo
Etanol 70 30 seg
Hipoclorito de Sodio 0,1 10 min
HgCl2 0,01 15 min
Etanol 70 30 seg
Cloro comercial (clorox) 20 10 min
Cloro comercial (Clorox) 10 15 min
Etanol 70 30 seg
Lysoform 20 30 min
Para el desarrollo de los protocolos de desinfección se siguió un procedimiento estándar. Los
explantes preparados para la desinfección se trataron con sus respectivos procedimientos de
desinfección y se realizaron tres lavados con agua estéril entre cada desinfectante incluido en el
19
tratamiento (Cuadro 1). Para eliminar el exceso de humedad los explantes se secaron ligeramente
sobre placa Petri cerrada luego se cortaron en segmentos uninodales y se plantaron en el medio de
cultivo en las condiciones descritas anteriormente.
3.3 Criterios de Evaluación y diseño del experimento de tratamientos desinfectantes.
Para seleccionar el mejor protocolo de desinfección se evaluó la tasa de desinfección, la tasa
de oxidación y la tasa de brotación de los explantes en cada tratamiento. La tasa de desinfección se
calculó como el número de explantes desinfectados divididos por el número de explantes totales. La
tasa de oxidación se calculó como el número de explantes oxidados (>50% del área del explante),
dividido por el número total de explantes por réplica. La tasa de brotación se calculó como el número
total de explantes que emitieron brotes, dividido por el número total de explantes por réplica.
Se realizaron 3 evaluaciones a los 7, 14 y 21 días desde la introducción, para identificar
adecuadamente el total de explantes contaminados con contaminaciones por bacteria o levaduras que
aparecen en etapas tardías de la introducción al cultivo in vitro (Digonzelli et al. 2005). A los 21 días se
evaluó el total de explantes oxidados y el total de explantes brotados.
Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA), con tres tratamientos y 3 repeticiones por
tratamiento; cada repetición estuvo constituida por 15 frascos de cultivo. La unidad experimental
correspondió a un frasco de cultivo con 4 explantes en su interior para un total de 45 unidades
experimentales y 180 explantes por tratamiento.
3.4. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de arándanos de
arbusto alto cv. Brigitta durante el establecimiento in vitro.
Se evaluó el efecto del tipo de regulador de crecimiento y su concentración sobre la tasa de
brotación y la formación de hojas de los explantes, que indican la inducción de respuesta morfogénica
en explantes in vitro (Cuadro 2).
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Cuadro 2. Tratamientos con reguladores de crecimiento para establecimiento y brotación de arándanos
de arbusto alto cv. Brigitta
Regulador del crecimiento mg L-1
2iP 4
2iP 5
TDZ 2,5
3.4.1. Diseño experimental y criterios de evaluación.
Una vez conseguida la desinfección de los explantes, se evaluó la tasa de brotación y aparición
de hojas en cada tratamiento. La tasa de brotación fue determinada dividiendo el número total de
explantes que emitieron brotes sobre el número total de explantes por réplica, mientras que la tasa de
aparición de hojas se definió como el número total de explantes con al menos una hoja visible por
explante, dividido por el número total de explantes por réplica.
Se utilizó un diseño completamente al azar (DCA) con tres tratamientos. Cada tratamiento contó
con 3 repeticiones y cada repetición con 14 frascos. La unidad experimental correspondió a un frasco
de cultivo con 4 explantes en su interior, dando totales de 42 unidades experimentales por tratamiento y
168 explantes por tratamiento. Se realizaron evaluaciones a los 7 y 14 días desde introducción.
3.5. Efecto de los medios basales y reguladores del crecimiento sobre la tasa de multiplicación
de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) cultivados in vitro.
Se evaluó el efecto de la composición del medio de cultivo, y la combinación de diferentes tipos
de reguladores del crecimiento a diferentes contraciones sobre la tasa de multiplicación in vitro para los
cultivares O`Neil, Bluecrop y Elliott. Los medios basales WPM (Woody Plant Medium) y MS (Murashige
y Skoog, 1962) se suplementaron con 2-isopentenil adenina con o sin la adición de ácido indolbutírico.
Se evaluaron doce tratamientos (Cuadro 3).
Ambos medios de cultivo basales, fueron suplementados con sacarosa al 3% y 7,5 gL-1 de agar
para WPM y 8,0 gL-1 para MS a pH 5,3. Para todos los tratamientos se utilizaron frascos de propagación
de 7 cm de altura y 7 cm de diámetro con tapas metálicas herméticas. Las plantas fueron sometidas a
21
luminosidad <30 μmolm-2s-1 utilizando lámparas fluorescentes con un fotoperíodo de 16 horas de luz y 8
horas de oscuridad a 22 ºC.
Cuadro 3: Tratamientos de multiplicación para los cv. Elliot, Bluecrop y OŃeil.
Reguladores del crecimiento (mg L-1)

Medio basal 2iP IBA
WPM 2 0
WPM 2 0,5
WPM 4 0
WPM 4 0,5
WPM 5 0
WPM 5 0,5
MS 2 0
MS 2 0,5
MS 4 0
MS 4 0,5
MS 5 0
MS 5 0,5
3.5.1 Criterios de evaluación y diseño del experimento de tratamiento de multiplicación.
Se evaluó la tasa de multiplicación de cada tratamiento lo que corresponde a la relación entre el
número final de segmentos nodales (NFSN) y el número inicial de los mismos (NISN). Para ello se
contabilizó el número inicial de segmentos nodales al momento del montaje de cada ensayo, y a las 2, 4
y 6 semanas subsiguientes se contabilizó la cantidad de segmentos nodales.
Para el experimento se usó un diseño completamente al azar (DCA), con un arreglo factorial de
2 x 3 x 2, dado por los siguientes factores: Medio de cultivo basal (WPM y MS), concentraciones de 2iP
(2, 4, y 5 mg L-1) y presencia o ausencia de IBA (0,5 mg L-1). Dando un total de 12 tratamientos con 6
repeticiones por tratamiento. Una unidad experimental correspondió a un frasco de cultivo con 10-12
plantas por frasco; por planta se dejaron aproximadamente 1-3 segmentos nodales. El total de unidades
experimentales por ensayo fue de 72.
22
3.6 Efecto de la posición de los explantes sobre la tasa de multiplicación en plantas in vitro de
arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum)
Se evaluó el efecto de la posición de los explantes (horizontal y/o vertical) sobre la tasa de
multiplicación en dos cultivares de arándanos de arbusto alto: Elliott y Bluecrop.
3.6.1 Criterios de evaluación y diseño del experimento
Se evaluó la tasa de multiplicación para cada tipo de posición del explante. Para ello se
contabilizó el número inicial de segmentos nodales al momento del montaje de cada ensayo, mientras
que a las 6 semanas desde inicio del cultivo se contabilizó la cantidad de segmentos nodales finales. La
posición de las plantas se evaluó en ambos medios de cultivo basales (WPM y MS) y en cada
tratamiento de reguladores de crecimiento.
Para el experimento se usó un diseño completamente al azar (DCA), con dos tratamientos
(horizontal y vertical) con 36 repeticiones por tratamiento. Una unidad experimental correspondió a un
frasco de cultivo con 10-12 plantas por frasco y por planta se dejaron aproximadamente 1-3 segmentos
nodales. El total de unidades experimentales por tratamiento fueron 36 frascos.
Para el análisis estadístico de ambos tratamientos se consideró aquel medio basal y regulador
del crecimiento significativo sobre la tasa de multiplicación para cada uno de los cultivares.
3.7. Análisis Estadístico.
Para todos los experimentos se realizó un análisis de Varianza (ANDEVA), a fin de determinar
diferencias entre los tratamientos. La separación de medias para aquellas variables con diferencias
significativas se hizo mediante el Test de Rangos Múltiples de Tukey (p<0,05). Se utilizó para tales
análisis, el programa estadístico Statgraphics Plus 5.1.
23
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
4.1. Efecto de desinfectantes sobre el establecimiento al cultivo in vitro de segmentos nodales
del cv. Brigitta.
Tasa de desinfección: Hubo diferencias altamente significativas en las medias de los tres tratamientos
desinfectantes utilizados (Cuadro 4). Se observó que al usar Etanol al 70% más Clorox al 20% y 10%
hubo un incremento significativo en la tasa de desinfección de explantes de arándanos de arbusto alto
del cv. Brigitta en relación al uso de los otros dos tratamientos desinfectantes. Con respecto a estos dos
últimos la utilización de Etanol al 70% más Hipoclorito de Sodio al 0,1% y Bicloruro de mercurio al
0,01% generó una mayor tasa de desinfección que al usar Etanol al 70% más Lysoform al 20%.
La eficiencia en la desinfección de los explantes introducidos al cultivo in vitro depende de una
serie de factores asociados a la calidad fisiológica y fitosanitaria de los explantes (Leifert et al. 1989;
Leifert and Woodward 1998). Se ha observado, en explantes adultos que la tasa de contaminación
tiende a ser superior que en explantes juveniles, especialmente yemas (Leifert et al., 1998). Por otra
parte, las condiciones de cultivo de las plantas madres a partir de las que se toma el material vegetal
pueden incidir en la tasa de contaminación de los explantes establecidos, como ha sido demostrado en
vides (Iocco et al., 2001; Pinto-Sintra, 2007) y cerezos (Ružic et al., 2000).
La eficiencia de desinfección documentadas para arándanos varía entre 40%-60% (Cohen,
1980; González et al., 2000; Meiners et al.; 2007) estos autores utilizaron hipoclorito de sodio para
desinfectar tejidos de diferentes cultivares de arándanos y han determinado que los genotipos pueden
responder de manera heterogénea ante los mismos protocolos de desinfección (González et al., 2000).
Este comportamiento se puede deber a una mayor especificidad entre la interacción de
microorganismos, superficiales y endógenos, y los diferentes genotipos.
Tasa de oxidación: Hubo diferencias altamente significativas en los tratamientos desinfectantes sobre la
tasa de oxidación (Cuadro 4). El tratamiento en el cuál se usó Etanol al 70% más Clorox al 20% y 10%,
presentó la mayor tasa oxidativa de explantes de arándano de arbusto alto del cv. Brigitta.
24
No se observaron diferencias estadísticas al usar Etanol al 70% más Hipoclorito de Sodio al
0,1% y luego Bicloruro de mercurio al 0,01% respecto al tratamiento con Etanol al 70% más Lysoform al
20% sobre la tasa de oxidación de explantes de arándano de arbusto alto del cv. Brigitta.
Pérez et al. (2002) documentaron mejores resultados de desinfección cuando lavaron explantes
tomados de árboles adultos leñosos de especies tropicales con concentraciones relativamente bajas de
Hipoclorito de Sodio. Aparentemente, los iones Cloruro provocan respuesta hiperoxidativas en los
explantes de plantas leñosas y esta respuesta es más marcada en explantes adultos, aunque debe
haber una relación entre la edad del explante y la toxicidad del desinfectante.
Tasa de brotación: No hubo diferencias significativas en las medias de los tratamientos respecto a esta
variable (Cuadro 4). Por lo tanto, no existe evidencia de que estos tratamientos desinfectantes afecten
la tasa de brotación. Estos resultados coinciden por los documentados para vides (Thomas, 2006) y
otros berries leñosos (Zimmermann, 1991). La respuesta morfogénica de las arándanos de la variedad
Briggitta, parecen estar más asociada a la interacción de los explantes con el medio de cultivo de
establecimiento que con el procedimiento de desinfección. No obstante, es necesario considerar que la
exposición prolongada de explantes vegetales ante agentes desinfectantes puede provocar respuestas
fitotóxicas que disminuyan su capacidad de división celular y diferenciación.
Cuadro 4. Efecto de tratamientos desinfectantes sobre la tasa de desinfección, la tasa de oxidación y

tasa de brotación en arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta a los 21 días desde introducción.
Comportamiento de explantes
Tasa de Tasa de
Tratamientos desinfección z oxidación Tasa de brotación
Etanol (70%); Clorox (20%-10%) 0,82 y c 0,28 b 0,31
Etanol (70%); Hip.de Sodio (0,1%);
HgCl2 (0,01%) 0,58 b 0,03 a 0,22
Etanol (70%); Lysoform (20%) 0,32 a 0,03 a 0,20
Significancia ** ** n.s.
z
Letras minúsculas distintas en una columna indican diferencias significativas entre tratamientos para cada tasa
específica (descrita en materiales y métodos) según test HSD de tukey (p<0,01). Nivel de significancia del 99%(**).
n.s. = no significativo
y
valores promedios de tres repeticiones por tratamiento.
25
4.2. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de arándanos de
arbusto alto cv. Brigitta durante el establecimiento in vitro.
Hubo diferencias altamente significativas sobre la tasa de brotación entre las medias de los
tratamientos con reguladores de crecimiento. Se observó que no existieron diferencias estadísticas al
utilizar 2-iP en cualquiera de sus dos concentraciones (4 ó 5 mgL-1) sobre la tasa de brotación de
explantes de arándano de arbusto alto del cv. Brigitta; sin embargo, si existieron diferencias al utilizar 2-
iP en cualquiera de sus dos concentraciones (4 ó 5 mgL-1) y usar TDZ (2,5 mg L-1), este último presentó
una baja tasa de brotación con respecto al uso de 2-iP a 4 ó 5 mgL-1 (Cuadro 5).
Al utilizar 2-iP en sus dos concentraciones (4 ó 5 mgL-1) no se afectó la tasa de aparición de
hojas; sin embargo, sí lo hizo el uso de TDZ (2,5 mgL-1); observándose en este último niveles
significativamente más bajos con respecto al uso de 2-iP en sus dos concentraciones.
La respuesta morfogénica en las plantas introducidas al cultivo in vitro depende de las
interacciones entre los genotipos, la manipulación del explante, las condiciones ambientales y la
composición nutritiva del medio de cultivo (Thorpe, 2007). Esta serie de factores puede tener un efecto
más o menos importante; así en arándanos se ha observado que la interacción genotipo-citoquínina en
el medio determina la eficiencia de brotación y la calidad fisiológica de los brotes (Gajdošová et al.,
2006). Los resultados obtenidos coinciden con los documentados por Meiners et al. (2007), quienes
demostraron que el TDZ afecta la capacidad de elongación de las yemas y los brotes emitidos,
generando alta formación de callos en los explantes establecidos. Por otra parte estos mismos
investigadores informaron que el 2-iP es una citoquinina con un efecto relativamente débil para inducir
diferenciación de brotes, por lo que no la recomiendan para esta etapa.
Es probable que los resultados obtenidos en el presente ensayo se deban a una mejor
selección y preparación de los explantes. En este caso, se introdujeron explantes de una zona
relativamente estable del brote, eliminando la variabilidad de la brotación debido a diferencias en las
edades fisiológicas de las yemas y su grado de diferenciación. Wolfe et al. (1983), determinaron que los
segmentos nodales de la zona central de brotes jóvenes manifestaron la mejor respuesta organogénica
en los experimentos de introducción al cultivo in vitro.
26
Cuadro 5. Efecto de reguladores del crecimiento sobre la tasa de brotación y aparición de hoja en
arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta a los 14 días desde introducción.
Brotación y aparición de hojas
Tratamientos Tasa de brotación z Tasa de aparición de hojas
2iP - 4 mgL-1 0,30 y b 0,35 b
2iP - 5 mgL-1 0,34 b 0,25 b
TDZ - 2,5 mgL-1 0,13 a 0,02 a
Significancia ** **
z
específica (descrito en materiales y métodos), según test HSD de tukey (p<0,05). Nivel de significancia del 95% (*),
y (p<0,01) 99%(**).
y
Valores promedios de tres repeticiones por tratamiento.
4.3. Efecto de la interacción de dos medios basales (WPM y MS) y diferentes concentraciones de
Citoquininas/Auxinas, sobre la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto
(Vaccinium corymbosum).
Se observaron diferencias altamente significativas entre las medias de los tratamientos
producto de la interacción entre tipo de medio de cultivo (WPM y/o MS) y tratamientos con reguladores
de crecimiento para plantas de arándano de arbusto alto del cv. OŃeal. Las plantas de la variedad
OŃeal cultivadas en WPM suplementadas con 2iP a 2, 4 ó 5 mgL-1 más IBA (0,5 mgL-1), obtuvieron
significativas disminuciones en sus tasas de multiplicación, respondiendo de forma negativa a la adición
de IBA en dicho medio basal, situación que no se observa al cultivar las plantas en los mismos
tratamientos de reguladores del crecimiento pero en medio basal MS, estos últimos presentaron
evidentes incrementos en las tasas de multiplicación con respecto al medio basal WPM.
Los seis tratamientos de reguladores del crecimiento en medio MS no mostraron diferencias
estadísticas sobre la tasa de multiplicación.
Se observó que al cultivar las plantas de la variedad OŃeal en WPM suplementado con 2iP (5
-1
mg L ) se obtuvo diferencias estadísticas en relación a todos los tratamientos de reguladores del
crecimiento en medio MS, logrando niveles significativamente menores sobre la tasa de multiplicación
que cualquiera de los tratamientos en medio de cultivo MS (Cuadro 6). No se observaron diferencias
significativas entre las medias de los tratamientos al interactuar tipo de medio de cultivo (WPM y/o MS)
27
y tratamientos con reguladores de crecimiento, sobre la tasa de multiplicación en plantas de arándano
de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) del cv. Elliot y Bluecrop.
Cuadro 6. Efecto de la interacción de dos medios de cultivo WPM y MS y 6 tratamientos con

reguladores de crecimiento sobre la tasa de multiplicación de plantas de arándano de arbusto alto in
vitro, después de 6 semanas de cultivar las plantas.
Tratamientos Tasa de multiplicaciónz
-1
Regulador del crecimiento (mgL )
Medio basal Citoquinina/Auxina OŃeal Elliott Bluecrop
WPM 2iP (2) 4,91 bcd 1,98 6,03
WPM 2iP (2) + IBA (0,5) 1,21 a 1,13 5,11
WPM 2iP (4) 5,85 cd 2,8 6,43
WPM 2iP (4) + IBA (0,5) 1,50 a 1,12 6,08
WPM 2iP (5) 3,26 abc 4,2 7,15
WPM 2iP (5) + IBA (0,5) 1,93 ab 2,87 7,05
MS 2iP (2) 5,15 cd 2,37 3,53
MS 2iP (2) + IBA (0,5) 6,68 d 1,66 2,83
MS 2iP (4) 7,18 d 2,48 3,13
MS 2iP (4) + IBA (0,5) 5,41 cd 1,87 2,8
MS 2iP (5) 6,55 d 2,77 3,72
MS 2iP (5) + IBA (0,5) 7,75 d 3,05 2,97
Significancia ** n.s n.s
Letras minúsculas distintas en una columna indican diferencias significativas entre tratamientos para
z
tasa de multiplicación (descrita en materiales y métodos), según test HSD de Tukey (p<0,01). Nivel de
significancia del 99%(**) n.s=no significativo.
y
Valores promedios de seis repeticiones por tratamiento.
Gráfico No 1. Análisis del efecto de la interacción entre medios de cultivo y variedades de arándanos
de arbusto alto sobre la tasa de multiplicación in vitro.
Gráfico de Interacción
Tasa de Multiplicación
7,7 Variedad
Bluecrop
6,7 Elliot
Ońeal
5,7
4,7
3,7
2,7
MS WPM
Medio de Cultivo
28
En Gráfico Nº1 se observa que el efecto de la interacción entre las variedades Bluecrop, Elliot y
OŃeal y el medio de cultivo sobre la tasa de multiplicación in vitro es altamente significativa. Se
observa que para las variedades Bluecrop y Elliot el cultivo sobre medio basal MS disminuye
significativamente la tasa de multiplicación, mientras quela variedad OŃeil aumenta su tasa.
Entre la variedad Elliott y Bluecrop la interacción es leve ya que ambas variedades en los dos
medios de cultivo se comportan de manera similar, ambas variedades en Medio basal MS tienden a
bajar sus tasas de multiplicación, sin embargo, en WPM se observa un aumento de las tasas de
multiplicación.
La interacción entre los reguladores del crecimiento y la variedad en medio WPM fue
significativa para algunas variedades. Se puede observar que la curva de interacciones muestra una
tendencia similar en todas las variedades, aunque la magnitud del efecto es más pronunciada en la
variedad OŃeil. La variedad Bluecrop muestra las tasas de multiplicación más elevadas.
Gráfico Nº 2. Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de

arándanos de arbusto Alto, Bluecrop, Elliott y Ońeal en medio basal WPM.
8 Variedad
Bluecrop
Elliott
6
Ońeal
0
1 2 3 4 5 6
Tratamientos
En gráfico Nº3 se observa el efecto de las interacciones entre los tratamientos con reguladores del
crecimiento y las tasas de multiplicación sobre medio MS presentan de leve a nula interacción en las
tres variedades de arándanos de arbusto alto. El tratamiento con 2 mg L-1 de 2i-P más 0,5 mg L-1 de
29
IBA muestra una leve interacción entre Bluecrop, Elliot y Ońeal; en Ońeal estimula un aumento de la
tasa de multiplicación no asi en Elliott y Bluecrop donde la tasa de multiplicación disminuye.
Gráfico Nº 3. Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de

arándanos de arbusto Alto, Bluecrop, Elliott y OŃeal en medio basal MS.
8 Variedad
Bluecrop
Elliott
6
Ońeal
0
1 2 3 4 5 6
Tratamientos
Sucede algo similiar para el tratamiento de 5mg L-1 de 2i-P más 0,5 mg L-1 de IBA donde se
observa que las plantas de la variedad Ońeal y Elliot aumentan significativamente la tasa de
multiplicación. La variedad Bluecrop disminuye sus tasas de multiplicación en estas condiciones.
Vaccinum corymbosum es una especie altamente dependiente de los reguladores del
crecimiento para desarrollarse in vitro (Lyrene y Perry, 1988). Reed y Abdelnour-Esquivel (1991),
encontraron que la respuesta morfogénica fue variable entre 12 genotipos tratados con diferentes
concentraciones de 2-iP y zeatina y que la respuesta fue mejor en presencia de este último regulador.
En un estudio con cuatro variedades diferentes, Ostrolucká et al. (2004) encontraron que todas las
variedades respondían positivamente a la adición de reguladores del crecimiento del tipo citoquininas.
Sin embargo, la respuesta dependió significativamente del tipo de citoquinina y de su concentración en
el medio de cultivo. Ellos reportaron que las citoquininas tienen un efecto significativo en la emisión y
desarrollo de los brotes, mientras que las auxinas incluidas de manera individual pueden deformar las
yemas de segmentos nodales recién plantados o estimular la formación de raíces. Además, se
documenta que la composición nutritiva y la disponibilidad de la sacarosa como fuente de energía en el
30
medio de cultivo pueden afectar significativamente la respuesta de las plantas de arándanos (Cao et al.,
2003).
Cuando en este ensayo se analizó el comportamiento de las plantas de arándanos cultivadas
en la mejor concentración de citoquininas sobre la composición variable del medio de cultivo, se
observó que existieron diferencias significativas en las tasas de multiplicación al utilizar WPM y MS
suplementados con 2iP (5 mgL -1). Los resultados mostraron que al cultivar plantas del cv. OŃeal en
medio MS, se obtuvo tasas de multiplicación significativamente más altas que al cultivarlas en medio
WPM. Para el caso del cv. Elliott fue lo contrario pues se observó que la mayor tasa de multiplicación se
obtuvo al cultivar las plantas en medio de cultivo basal WPM (Cuadro 7).
Para Bluecrop la diferencia entre las medias fue altamente significativa, donde se observó que
el medio basal WPM obtuvo un incremento en las tasas de multiplicación con respecto al cultivo de
plantas de esta variedad en medio MS.
El uso de citoquininas ha sido extendido en arándanos y varios autores han recurrido incluso a
combinar más de una citoquinina para mejorar la respuesta morfogénica (Rowland y Olden 1992). Sin
embargo, el uso de auxinas para mejorar la calidad de los brotes no ha sido tan estudiada y los
resultados han demostrado ser consistentes en la mayoría de las variedades (Lyrene, 1981; Meiners et
al., 2007). Las evidencias de estos experimentos demuestran que los brotes de arándanos pueden
alcanzar un mejor desarrollo y generar segmentos nodales con capacidad de mejorar una respuesta
morfogénica homogénea en los siguientes subcultivos.
Cuadro 7. Efecto de medios de cultivo basales sobre la tasa de multiplicación en arándanos de

arbusto alto. (Vaccinium corymbosum) después de 6 semanas de cultivar las plantas.
Efecto de medios de cultivo
Tratamientos Tasa de Multiplicación z
OŃeal Elliott Bluecrop
-1 y
WPM + 2iP 5mg L 3,27 a 4,20 b 7,15 b
MS + 2iP 5mg L-1 6,55 b 2,77 a 3,72 a
Significancia * * **
z
específica (descrita en materiales y métodos), según test HSD de tukey (p<0,05). Nivel de significancia del 95% (*),
y (p<0,01) 99%(**).
y
Valores promedios de 6 repeticiones por tratamiento.
Los resultados informados en la literatura por diferentes grupos han limitado los estudios a las
interacciones de los medios de cultivo y los tipos de reguladores del crecimiento. Los resultados (cuadro
31
7) evidencian que la respuesta de las plantas in vitro de arándanos ante la presencia de una citoquinina
en el medio puede ser influida por la composición del medio de cultivo y por la interacción con auxinas
suministradas como complemento. El medio MS generó una mejor respuesta morfogénica en plantas de
las variedades O`Neil y Elliott ; en ese contexto las tasas de multiplicación fueron ligeramente
superiores en presencia de auxinas a medida que se aumentó su concentración, especialmente
marcada fue esa respuesta en la variedad OŃeil.
El uso del medio MS para el cultivo in vitro de arándanos fue informado por (Cohen y Elliott
1979) para las variedades Atlantic, Jersey, Dixie, Stanley, Burlington, Darrow, Berkeley, Ivanhoe,
Blueray, Bluecrop y Earliblue. Las tasas de multiplicación de esas variedades en el medio
suplementado con 2 mgL-1 de 2-iP variaron de 2 a 8, en dependencia de la variedad. Sin embargo,
otros autores han incluido cambios en el medio basal utilizando el medio de Anderson modificado
(Zimmerman y Broome, 1980) y el Woody Plant Medium, WPM, (Grout et al., 1986).
Los medios de cultivo presentan diferencias importantes en los tipos y concentraciones de sales
de nitrógeno en su composición, lo que puede afectar la disponibilidad de ese ion ya sea por defecto o
por exceso. Por otro lado, en el medio MS se produce una rápida caída del pH en los 10 primeros días
(Ružic et al., 2000), lo que puede afectar la respuesta de algunos genotipos, como es el caso de la
variedad Bluecrop. A pH bajos, la disponibilidad de iones N y P se limita en condiciones de cultivo de
tejidos, por lo que para algunas especies se sugiere reforzar la concentración de estas sales en el
medio. En cerezos, se encontró que las plantas cultivadas en medio MS al doble de su concentración
salina absorbieron más N y P que las plantas cultivadas en medio normal o con menor concentración de
sales. La mejor absorción de estos iones propició una mejor respuesta morfogénica y una mejor calidad
de los brotes (Ružic et al., 2000).
A pesar que la variedad O`Neil presenta una tasa ligeramente superior sobre todos los
tratamientos de reguladores del crecimiento en el medio MS, es posible que esta variedad pueda ser
cultivada sobre medio WPM. Cuando se añadieron 4 mgL-1 de 2-iP al medio de cultivo se obtuvo una
tasa de multiplicación que no difirió significativamente del resto de los tratamientos en MS. (Cuadro 7).
32
4.4. Efecto de la posición de explantes de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum)
de los cv. Elliott y Bluecrop sobre medio basal WPM suplementado con 2-iP (5mg L-1).
La posición del explante en el medio de cultivo no incidió significativamente en la tasa de
multiplicación en la variedad Elliot cultivada en medio WPM suplementado con 2-iP a 5mgL-1 (Cuadro
8). Sin embargo, en el cv. Bluecrop hubo diferencias significativas en las medias de los tratamientos
sobre la tasa de multiplicación; así, se observó que la posición vertical en WPM suplementado con 2-iP
(5mgL-1) presentó tasas de multiplicación significativamente más altas con respecto a la posición
horizontal de las mismas. González et al. (2000) desarrollaron un estudio para obtener un método
uniforme de micropropagación mediante el uso de segmentos nodales a partir de plantas maduras
obtenidos en campo. Ellos encontraron que la respuesta del explante a las diferentes posiciones en el
medio de cultivo depende del genotipo.
Cuadro 8. Efecto de la posición horizontal y vertical de plantas de arándanos (Vaccinium corymbosum),

después de 6 semanas de cultivar las plantas.
Tasa de multiplicación z
Posición Elliott Bluecrop
Vertical (WPM 2iP 5mg L-1 ) 3,90 y 7,15 b
Horizontal (WPM 2iP 5mg L-1 ) 3,85 5,61 a
Significancia n.s *
Letras minúsculas distintas en una columna indican diferencias significativas entre tratamientos para
z
tasa de multiplicación (descrito en materiales y métodos), según test HSD de tukey (p<0,05). Nivel de significancia
del 95%(*).
y
Valores promedios de 6 repeticiones por tratamiento.
4.5. Evolución temporal de la tasa de multiplicación en Vacciunium corymbosum cv. Bluecrop,
OŃeal y Elliott.
La variación de las tasas de multiplicación a partir de segmentos bi-nodales, dependió del
genotipo. Para la variedad OŃeal, los tratamientos de reguladores del crecimiento en medio basal
WPM (Figura 1) mostraron una disminución significativa en las tasas de multiplicación con respecto a
los tratamientos de reguladores del crecimiento en medio MS. En general las tasas de multiplicación se
incrementaron a partir de la segunda semana y alcanzaron el máximo punto a las seis semanas. Los
tratamientos con 2-iP 2 mgL-1 + IBA 0,5 mgL-1; 2-iP 4mgL-1 + IBA 0,5 mgL-1 y 2-iP 5 mgL-1 + IBA 0,5 mgL-
1
mostraron una tasa de multiplicación estable y baja a lo largo del experimento que se debió a la altura
33
reducida de los brotes en esos medios. Claramente, la adición de IBA al medio de cultivo retardó el
crecimiento cuando el medio basal era WPM, pues los tratamientos con 2-iP 2 mgL-1; 2-iP 4 mgL-1; 2-iP
5 mgL-1 mostraron incrementos en las tasas de propagación similares a los tratamientos en medio MS.
Las tasas de multiplicación en MS no se afectaron con la adición de auxinas y los mejores
resultados se alcanzaron en el tratamiento con 2-iP a 5 mgL-1+ IBA 0.5 mgL-1. Este tratamiento puede
ser útil para adaptar las plantas en la fase ex vitro pues estimularía favorablemente la inducción de
raíces.
OŃeal en medio basal MS OŃeal en medio basal WPM

8 8
a
a a
7 7
a a
a a
6 6
a a
d
a a
5 a
a 5
a c
c
a
4 c
a 4
a
a
3 b b
3 c
bc
2
2 b a a
a a a
a a
1 0 a a
0 2 Semanas 4 6 1 0
0 2 Semanas 4 6
MS + 2iP (2) MS + 2iP (2) + IBA (0,5) MS + 2iP (4)

WPM + 2iP (2) WPM + 2iP (2) + IBA (0,5) WPM + 2iP (4)
MS + 2iP (4) + IBA (0,5) MS + 2iP (5) MS + 2iP (5) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (4) + IBA (0,5) WPM + 2iP (5) WPM + 2iP (5 )+ IBA (0,5)
Figura 1. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de arbusto alto del cv.
OŃeal en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del
crecimiento.Letras minúsculas distintas en dirección vertical indican diferencias significativas entre
tratamientos para tasa de multiplicación según test HSD de tukey (p<0,05).
En la variedad Elliott (Figura 2) se observó que la tasa de multiplicación a las 2, 4 y 6 semanas
disminuyó en todos los tratamientos con 2-iP e IBA (0,5 mgL-1) en medio de cultivo basal MS producto de la
formación en la base del explante inicial que inhibió el desarrollo de las yemas. En los tratamientos con 2-iP
(2 y 4 mgL-1) más IBA (0,5 mgL-1) en medio de cultivo basal WPM no existieron variaciones en las tasas de
multiplicación entre la primera y tercera evaluación. El resto de los tratamientos mostraron incrementos en
sus tasas de multiplicación en las tres evaluaciones y el tratamiento con 5 mgL-1 de 2-iP mostró diferencias
significativas con el resto de los tratamientos a partir de la segunda semana, con la mayor tasa de
multiplicación en la sexta semana.
34
Elliott en medio basal MS Elliott en medio basal WPM
4 4
c
c
b
3 3
Tasa de multiplicación
a bc
a abc
ab
a bc
ab
a abc
a
b
2 a 2 ab
a ab
a ab
a a ab
ab ab
a ab
a a
a a ab
a a a
1 0 1 0
Semanas Semanas
0 2 4 6 0 2 4 6
MS + 2iP (2) MS + 2iP (2) + IBA (0,5) MS + 2iP (4)

WPM + 2iP (2) WPM + 2iP (2) + IBA (0,5) WPM + 2iP (4)
MS + 2iP (4) + IBA (0,5) MS + 2iP (5) MS + 2iP (5) + IBA (0,5)
WPM + 2iP (4) + IBA (0,5) WPM + 2iP (5) WPM + 2iP (5 )+ IBA (0,5)
Elliott en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del crecimiento. Letras
minúsculas distintas en dirección vertical indican diferencias significativas entre tratamientos para tasa de
multiplicación según test HSD de tukey (p<0,05).
Para la variedad Bluecrop (Figura 3), las tasas de multiplicación sobre WPM fue mayor que en
medio MS. En medio MS, las tasas de multiplicación alcanzaron su máximo a las cuatro semanas,
mientras que en medio WPM las plantas continuaron creciendo. A pesar que los tratamientos mostraron
diferencias leves en sus tasas de multiplicación, no se encontraron diferencias significativas entre los
tratamientos de reguladores del crecimiento en ninguna de las fechas y ninguno de los medios.
35
Bluecrop en medio basal MS Bluecrop en medio basal WPM
8 8
a
7 7
a
a a
a
6 6 a a
aa
5 a a
5
a a
a
4
4 a a a
a aa aa
a a
a 3
3 a a a
a
a a
a a
a
a 2
2 a
1 0
1 0 0 2 4 6
Semanas Semanas
0 2 4 6
MS + 2iP (2) MS + 2iP (2) + IBA (0,5) MS + 2iP (4) WPM + 2iP (2) WPM + 2iP (2) + IBA (0,5) WPM + 2iP (4)
MS + 2iP (4) + IBA (0,5) MS + 2iP (5) MS + 2iP (5) + IBA (0,5) WPM + 2iP (4) + IBA (0,5) WPM + 2iP (5) WPM + 2iP (5 )+ IBA (0,5)
Bluecrop en medio basal MS y WPM con sus respectivos tratamientos de reguladores del crecimiento. Letras
minúsculas distintas en dirección vertical indican diferencias significativas entre tratamientos para tasa de
multiplicación según test HSD de tukey (p<0,05).
El establecimiento de protocolos eficientes para el cultivo in vitro de arándanos ha sido
desarrollado por varios autores a partir de meristemos axilares, organogénesis y discos de hojas
(Callow et al. 1989; Rowland y Odgen 1992; Cao and Hammerschlag 2000; Debnath y McRae 2001;
Debnath 2005 a, b). Las tasas de multiplicación han sido variables y afectadas por la concentración de
citoquininas, mientras la zeatina ha estimulado la formación de brotes de manera más exitosa que el 2-
iP o el TDZ (Reed y Abdelnour-Esquivel 1991). Las tasas de mutiplicación informadas por varios
autores han variado desde 1.5 hasta 8.6 (considerando brotes de más de 1 cm) (ver más información
en Rowland y Hammerschlang, 2005).
La variación en las tasas de multiplicación en las variedades incluidos en este estudio son
similares con las documentadas por Cohen (1980) y Meiners et al. (2007), tanto por la alta variabilidad
entre los diferentes genotipos como por la eficiencia en la tasa de multiplicación. El número máximo de
brotes se obtiene a las seis semanas, lo que corresponde con los resultados mostrados por González et
al. (2000) y Ostrolucká (2004).
El cultivo de las plantas de arándanos por más de seis semanas puede mejorar la respuesta a
la etapa de adaptación ex vitro (Debnath, 2007). Sin embargo, en las plantas in vitro puede provocar la
disminución de la respuesta morfogénica para el siguiente subcultivo, debido al envejecimiento y la
lignificación del tejido (Meiners et al., 2007).
36
El hecho que las tasas de multiplicación hayan sido homogéneas en las semanas donde se
evaluó pudiera indicar que los medios de cultivo empleados otorgan condiciones nutricionales muy
efectivas para el desarrollo normal de los brotes y que los reguladores del crecimiento tienen un efecto
estimulador sobre esa respuesta morfogénica. Las principales variaciones en las condiciones de cultivo
deben ser dirigidas entonces a mejorar el balance nutricional de los medios de cultivo, en lugar de
focalizarse en manejar las concentraciones de reguladores del crecimiento.
37
V. CONCLUSIONES
Se estableció que es posible obtener altos porcentajes de respuesta morfogénica en explantes
de arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta introducidos al cultivo in vitro mediante la desinfección con
etanol al 70% por 30 segundos e Hipoclorito de Sodio al 0,1% más HgCl2 al 0,01%.
Las tasas de brotación de explantes vivos no fueron afectactadas al utilizar cualquiera de los
tres tratamientos desinfectantes, por tanto, la acción desinfectante de tales tratamientos no es influyente
en la respuesta morfogénica de explantes de arándanos de arbusto alto del cv. Brigitta.
En explantes del cv. Brigitta las tasas de oxidación más bajas se obtuvieron al desinfectar con
etanol al 70% más Hipoclorito de Sodio al 0,1% y HgCl2 al 0,01%.
En la etapa de establecimiento y brotación del cv. Brigitta se determinó que utilizar TDZ (2,5
mgL-1) provocó bajas tasas de brotación y aparición de hojas, no así con el uso de 2iP en cualquiera de
sus dos concentraciones (4 ó 5 mg L-1). La brotación de la variedad Brigitta fue más eficiente cuando los
segmentos nodales de plantas provenientes de viveros se cultivaron en 2-iP (4 ó 5 mgL-1).
La posición de los explantes no fue influyente en la tasa de multiplicación de los cultivares
evaluados (Elliott y Bluecrop).
Para ensayo de multiplicación se estableció un medio de cultivo basal estándar a base de las
sales WPM para las variedades OŃeal, Elliott, y Blue Crop, suplementando con 4 mgL-1 de 2-iP.
Se determinó que el manejo de la composición de sales del medio de cultivo puede tener un
efecto importante para inducir mayores tasas de multiplicación en las variedades incluidas en el estudio.
La tasa máxima de multiplicación se obtiene a las seis semanas y es afectada por la interacción
entre los reguladores del crecimiento y la composición nutritiva del medio de cultivo.
38
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UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

EVALUACION DE METODOS DE MICROPROPAGACION VEGETATIVA DE

ARÁNDANOS in vitro (Vaccinium corymbosum)

MARÍA DE LA PAZ TAPIA SALAS

Profesor Guía: Ing. Agr., M.S., PhD. Jorge Retamales Aranda

Profesor Informante: Ing. Agr., PhD. Rolando García González

El arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) es un frutal menor perenne,

de dudosa calidad genética y fitosanitaria lo que pudiera comprometer el futuro de este

importante fruto de exportación. Las técnicas de cultivo de tejidos pueden contribuir al

objetivos de este proyecto de tesis están enfocados en establecer una metodología de

micropropagación in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum), para producir

plantas de alta calidad genética y fitosanitaria mediante la evaluación de protocolos de

desinfección y establecimiento al cultivo in vitro.

Para desarrollar un protocolo de micropropagación homogéneo en variedades de arándanos

se determinó que el mejor procedimiento para la desinfección y el establecimiento de arándano

Sodio al 0,1% más HgCl2 al 0,01%.

multiplicación se obtuvo a las seis semanas. El procedimiento descrito permite propagar de

Highbush blueberries (Vaccinium corymbosum) have become a very important horticultural

the six week after planting in the studied media.

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 4

2.1. Descripción de la especie 4

2.2. Cultivo de tejidos vegetales 6

2.3. Micropropagación vegetativa in Vitro 9

2.4. Efecto del medio de cultivo sobre la eficiencia en la micropropagación de

2.5. Rol de los reguladores del crecimiento en la micropropagación in vitro de

2.6. Cultivo in vitro de arándanos de arbusto alto (Vaccinium corymbosum). 16

III. MATERIALES Y METODOS 18

3.2. Desinfección, introducción y establecimiento in vitro del cv. Brigitta a partir de

3.3. Criterios de Evaluación y diseño del experimento de tratamientos desinfectantes. 20

3.4. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de

3.6. Efecto de la posición de los explantes sobre la tasa de multiplicación en plantas

4.1. Efecto de desinfectantes sobre el establecimiento al cultivo in vitro de

4.2. Efecto de reguladores de crecimiento sobre la respuesta morfogénica de

4.3. Efecto de la interacción de dos medios basales (WPM y MS) y diferentes

4.4. Efecto de la posición de explantes de arándanos de arbusto alto (Vaccinium

4.5. Evolución temporal de la tasa de multiplicación en Vacciunium corymbosum cv.

Cuadro 1. Tratamientos utilizados para la desinfección de explantes de arándanos de

Cuadro 2. Tratamientos con reguladores de crecimiento para establecimiento y brotación

Cuadro 3. Tratamientos de multiplicación para los cv. Elliot, Bluecrop y O´Neil. 22

Cuadro 4. Efecto de tratamientos desinfectantes sobre la tasa de desinfección, la tasa de

Cuadro 5. Efecto de reguladores del crecimiento sobre la tasa de brotación y aparición

Cuadro 6. Efecto de la interacción de dos medios de cultivo WPM y MS y 6 tratamientos

Cuadro 7. Efecto de medios de cultivo basales sobre la tasa de multiplicación en

Cuadro 8. Efecto de la posición horizontal y vertical de plantas de arándanos (Vaccinium

Figura 1. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de

Figura 2. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de

Figura 3. Evolución temporal de la tasa de multiplicación de plantas de arándanos de

Gráfico 2. . Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de

Gráfico 3. Interacción entre los 6 tratamientos de reguladores del crecimiento y 3 variedades de

El arándano de arbusto alto (Vaccinium corymbosum) es un frutal menor perenne de gran

abastecimiento en contraestación de arándanos, es necesario destacar que Argentina, Nueva Zelanda,

corto y mediano plazo (Alcaíno, 2008).

volumen de exportación en la temporada 2007/08 cercana a las 30.195 T, observándose un crecimiento

El crecimiento sostenido de la demanda no solo ha elevado las exportaciones, sino también ha

precisos de propagación y saneamiento de plantas. La biotecnología proporciona herramientas para

desarrollo en la actualidad en el campo del cultivo de tejidos vegetales.

vegetal de ciertas variedades y su consecuente alto costo de adquisición, la alta probabilidad de

pueden concentrarse en tres ámbitos: mejoramiento genético, producción de plantas libres de

enfermedades y propagación vegetativa (Gravina et al., 1995).

La importancia del arándano como fruta de consumo en varios mercados ha impulsado el

desarrollo de proyectos de investigación en el campo del cultivo in vitro, la micropropagación y la

vez, se ha evaluado la respuesta morfogénica de la especie ante la presencia de diferentes tipos de