REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

ESCUELA DE BIOLOGÍA

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR

Unidad III

Integración y Control de la Función Celular

Autores: Andrade, Mariana. CI: 22.440.773

Cabezas, María. CI: 19.395.178

Profesor: Carlos Torrealba.

Fecha: 15 de Noviembre de 2016.

RESUMEN

La bacteria E.coli son Gram-negativas, tienen forma de barra y pertenecen a la familia

Enterobacteria, esta bacteria es utilizada frecuentemente en experimentos de genética y biología
celular. Para este trabajo de laboratorio evaluamos la capacidad de repuesta que presenta esta
bacteria a diferentes condiciones, y como estas afectan a su crecimiento bacteriano. Para ello
someteremos a la bacteria a distintas fuentes de carbono, como glucosa y lactosa, a una
temperatura de 37°C con agitación. Una vez realizado esto se prosiguió a realizar un contaje
indirecto de las células procariotas, el cual se realizará por el método de turbidimetría, el cual se
basa en medir la disminución de la luz a través de una suspensión de partículas, en este caso, sería
nuestra dilución que contiene la células procariotas, utilizando para ello el espectrofotómetro.
Una vez realizado esto se tomó una alícuota de la dilución y se sembró en una placa de Petri con
agar blando utilizando la técnica de rastrilleo, para luego poder contar el número de colonias.
Con los resultados obtenidos se realizó una curva de absorbancia y se extrapolo los valores, para
así obtener el número de células y calcular el tiempo generacional.

En este trabajo de laboratorio también se realizo un contaje directo de las células eucarióticas,
utilizando un cultivo de Leptomonoas sp., esto se llevo a cabo en una cámara de Neubauer.
Posteriormente se evaluaron las ventajas y desventajas de los métodos de contaje aplicados en
esta práctica.

Palabras claves: E.coli, crecimiento bacteriano, fuentes de carbono, temperatura, agitación,

turbidimetría, cámara de Neubauer.
INTRODUCCIÓN

Las bacterias como por ejemplo la E.coli, crecen en un medio de cultivo líquido o en una placa
de Petri, sobre una superficie de agar semisólida. En este medio de cultivo se necesitan
componentes nutritivos del medio de crecimiento que son muy simples y constan sólo de una
fuente de carbono, un medio mineral simple y vitamina B1. Para crecer en estos medios de cultiva
la bacteria debe ser capaz de sintetizar todos los componentes orgánicos esenciales (Klug, 2006).

Para estudiar las bacterias de modo cuantitativo, se sitúa un inóculo bacteriano en un medio de
cultivo líquido. La bacteria presentará un patrón de crecimiento característico de crecimiento.
Inicialmente, durante la fase de latencia, el crecimiento es lento, por lo que se presenta un
incremento pequeño en el número de células. Las bacterias sintetizan RNA ribosómico y las
correspondientes enzimas, y se adaptan medio de cultivo (Cortes, 2004). Luego sigue un periodo
de crecimiento rápido llamado fase exponencial. En esta fase las células se dividen continuamente
con un intervalo de tiempo fijo entre divisiones celulares, hasta llegar a un máximo (Klug, 2006).
En esta fase es donde el investigador puede determinar el parámetro generacional, denominado
tiempo generacional, el cual es el tiempo requerido para que la población se replique, por la tanto,
es la relación que existe entre el tiempo y el número de generación. Por ejemplo, la generación
más rápida en el crecimiento de la bacteria E.coli tiene un tiempo generacional de 21 minutos. A
partir de este momento, la población crece poco y entra en una fase estacionaria, en la que los
nutrientes escasean y los productos de desechos se acumulan. Llegado un momento esos dos
factores se agudizan y la población desciende en número, en el que se conoce como fase de
muerte (Cortes, 2004).

Hay diversos factores que afectan la cinética de crecimiento, los cuales pueden ser químicos
(p.e., fuentes de carbono y requerimiento de oxígeno) o físicos (p.e., Temperatura y pH). Un
ejemplo de los factores químicos, es cuando tenemos una bacteria la cual se encuentra
inicialmente en un medio pobre, como por ejemplo succinato, y posteriormente se toma un
inóculo bacteriano y se coloca en un medio rico como glucosa. Este cambio de fuentes de carbono
va a provocar un cambio en la fase de latencia, anteriormente explicada, ya que esta no se va a
observar, debido a que la bacteria puede metabolizar la glucosa, lo cual implica un menor gasto de
energía en forma de ATP para la bacteria. En cuanto a los factores físicos pueden o no favorecer al
crecimiento bacteriano, debido a que catalizan las reacciones enzimáticas.

Las fuentes de carbono son un componente muy importante para el crecimiento de las
bacterias, debido a que estas degradan la fuente de carbono que puede ser: glucosa, galactosa,
fructosa, succinato, lactosa, etc., para producir energía en forma de ATP, y así poder llevar a cabo
todos sus procesos celulares.

Las células que crecen en un medio líquido se pueden determinar su densidad celular, por
medio de diversos métodos que pueden ser directos o indirectos. Los directos son aquellos que el
investigador cuenta directamente el número de colonias formadas, y los indirectos es cuando se
relaciona alguna característica que tenga la población, como por ejemplo la turbidez. A
continuación describiremos la base de algunos de los métodos directos e indirectos para
determinar la densidad celular.

Contaje Directo:

1. Plaqueo: Este método se basa en que las células que crecen en un medio líquido pueden
ser cuantificadas transfiriéndolas a un placa de Petri con un medio semisólido. Después de
la incubación y de muchas divisiones, cada célula da lugar a una colonia visible sobre la
superficie del medio, la cual se puede contar fácilmente (Klug, 2006).
2. Cámara Neubauer: Es portaobjeto modificado que tiene dos cámaras de 0.1 mm de
profundidad. Cada cámara está dividida en nueve cuadrados de 1 mm2. La superficie cubre
un área total de 9 mm2. Adicionalmente, el cuadrado del centro esta subdividido en cinco
por cinco cuadrados agrupados de 0.2 mm de lado y una superficie de 0.04 mm2 cada uno.
Los cuadros del centro a su vez están subdivididos en 16 cuadros más pequeños de 0.0025
mm2 cada uno (Cañedo, 2004). En estos cuadros es donde se coloca la alícuota, se coloca
un cubre objeto y por tensión superficial se va a fijar, permitiendo así que se puede
realizar el conteo en el microscopio.

Contaje Indirecto:

1. Turbidimetría: Es la determinación de la turbidez, es un método práctico para controlar el

crecimiento bacteriano. Cuando las bacterias se multiplican en un medio líquido este se
torna turbio por las células. El instrumento utilizado para medir la turbidez es un
espectrofotómetro. En el espectrofotómetro un haz de luz se transmite a través de una
suspensión bacteriana. Cuando la cantidad de bacterias aumenta, menos luz alcanza las
células. Este cambio de luz se registra en la escala del instrumento como la absorbancia,
la cual se utiliza para graficar el crecimiento bacteriano ().

OBJETIVOS:

1. Analizar el efecto que tiene una variedad de condiciones ambientales como:

Temperatura, fuente de carbono, presencia o ausencia de oxígeno, en la cinética de la
curva del crecimiento bacteriano, utilizando como organismo procariota a la bacteria
Escherichia coli.
2. Conocer, diferenciar y aprender a utilizar los métodos de determinación de la densidad
celular.

METODOLOGÍA:

Materiales:

1. 2 Ertulas de 125 mL (estéril). 4. Pipetas (0.1 mL; 0.2 mL; 1 mL; 10

2. Tubos de ensayo. mL).
3. Pera de succión. 5. Placas con Agar nutritivo (estéril)
6. Mechero.
 7. Cámara de contaje celular Neubauer. 8. Espectrofotómetro.
Materiales biológicos Componentes del medio de cultivo

1. Cultivo de bacterias Escherichia coli. 1. 50 mL de medio mineral (Fosfato, K+,

Na2+, Ca2+, Mg2+, Fe3+, NH+4 Estériles).
2. Glucosa 1M.
3. Galactosa.

Metodología.

1-. Contaje indirecto de células procarióticas.

En la figura 1, se observa un esquema de la metodología llevada a cabo para realizar el conteo

indirecto de las células procarióticas. Primero se preparó en condiciones estériles un medio de
cultivo dos ertulas (con un total de 10mL) que contenía: Medio mineral completo, vitamina B1 y
una fuente de carbono. Posteriormente el medio es inoculado con una dilución 1/10 de un cultivo
de Escherichia coli y se se midió la densidad óptica, para así poder obtener el número de unidades
Klett, a través de la siguiente relación:

1DO = 500 UK y 1 UK= 2x106 células/mL

Una vez obtenido las unidades Klett, obtuvimos como resultado un valor mayor a 40 UK, por lo
tanto se realizó una dilución global de éste de 1x106.

Se incubo ambas ertulas inoculadas en un baño de agitación a una temperatura de 37° C por un
tiempo de intervalos sucesivos de 20 minutos, durante 3 horas. En cada intervalo de 20 minutos se
midió la densidad óptica del cultivo, utilizando el espectrofotómetro y ajustando la lectura del
fotocolorímetro con el blanco, el cual era el medio sin las bacterias.

Terminada cada medición de densidad óptica, con la ertula que contenía glucosa, se tomaba 0,1
mL de la dilución, y se distribuía uniformemente sobre una placa de agar estéril, utilizando la
técnica de rastrilleo. Posteriormente cada placa se incubó a 37°C por 24 horas. Una vez que se
incubaron se contó el número de colonias para calcular el número de células viables presentes en
el cultivo original por mililitro.
Fig 1. Esquema de la metodología llevada a cabo para realizar el contaje indirecto.

Contaje indirecto de células eucarióticas

Con un cultivo de Leptomonas sp se determinó el total de células por mL, en el cultivo original
utilizando un contaje directo de las células en una cámara de Neubauer.
RESULTADOS

Tabla 1. Valores de D.O obtenidos para las fuentes de carbono: Glucosa y Lactosa en intervalos de tiempo de
20 minutos, durante 3 horas.

Tiempo D.O.
(min) Glucosa Lactosa
0 0,126 0,107
20 0,156 0,133
40 0,175 0,159
60 0,199 0,179
80 0,253 0,198
100 0,305 0,250
120 0,360 0,281
140 0,450 0,309
160 0,490 0,360
180 0,568 0,405
200 0,620 0,454

Tabla 2. Número de colonias determinadas a través del contaje directo en placas.

Tiempo (min) N° de colonias (medio: glucosa)

0 244
40 120
80 1986
120 440
160 Incontable
200 1064

Nota: Se dividió la placa en 4 cuadrantes y se determinó el número de colonias sólo en uno de

ellos. Posteriormente, se multiplicó el número de colonias obtenido para ese cuadrante, por
cuatro (p. ej. : en la placa correspondiente al t= 0min, se contó en uno de los cuadrantes 61
colonias; multiplicando el valor obtenido para ese cuadrante, por cuatro, se obtuvo un total de
244 colonias).

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

 W.S Klug; M.R Cummings y C.A Spencer. Conceptos de Genética. Pearson Educación, S.A.,
Madrid. 2006, pp. 155
 D. Cortes. Diccionario de Biología. Editorial Cumplutense, S. A., Madrid. 2004, pp. 172.
 V. Cedeño; T. Ames. Manual de laboratorio. Lima, Perú. 2004, pp. 43
 G.J. Tortora; B.R Funke y C.L Case. Introducción a la Microbiología. Editorial medica
Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2004, pp. 182