MTODOS

FSICOS

DE

SEPARACIN

PURIFICACIN

DE

SUSTANCIAS

ORGNICAS

Mariana Lpez Snchez

Jorge Triana Mndez
Francisco Javier Prez Galvn
Mara Esther Torres Padrn

MTODOS FSICOS DE SEPARACIN Y

PURIFICACIN DE SUSTANCIAS
ORGNICAS

___________________________________________________________
Mariana Lpez Snchez
Jorge Triana Mndez
Francisco Javier Prez Galvn
Mara Esther Torres Padrn
___________________________________________________________
Impresin: Febrero de 2005
Universidad de Las Palmas de Gran Canaria
Servicio de Reprografa, Encuadernacin y Autoedicin
Universidad de Las Palmas de Gran Canaria (ULPGC)
Mquina Fotocopiadora
Marca: Xerox, Modelo Docutech
Nmero de Serie: 1104516609

de

Depsito Legal: GC 136 2005

ISBN: 84 689 - 1114 - 3
________________________________________________________________

la

NDICE
___________________________________________________________

Filtracin

Decantacin

Cristalizacin

Sublimacin

Destilacin

Extraccin

12

Cromatografa

20

Bibliografa

49

INTRODUCCIN
Cuando se quiere conocer la composicin de una sustancia
orgnica es necesario seguir tres etapas bsicas.
Obtener una muestra representativa de la muestra.
Separar o aislar cada una de las sustancias componentes de la
mezcla para su posterior anlisis.
Identificacin de cada uno de los componentes de dicha
muestra.
La
segunda
de
las
etapas
es una de las ms complejas,
laboriosas y difcil de realizar
El conocimiento de los mtodos de aislamiento y purificacin
de un compuesto es fundamental en Qumica Orgnica por las
siguientes razones:

Poder determinar su estructura

En los procesos de sntesis.
Seguimiento de las reacciones qumicas

Estos mtodos estn basados en las diferencias que existen

entre las propiedades fsicas de los componentes de una mezcla
(puntos
de
ebullicin,
densidad,
presin
de
vapor,
solubilidad, etc.)

Mtodos de separacin

Filtracin
Decantacin
Cristalizacin
Sublimacin
Destilacin
Extraccin
Cromatografa

FILTRACIN POR GRAVEDAD

Consiste en retener partculas slidas suspendidas de un
lquido o un gas forzando la mezcla a travs de una barrera
porosa que puede ser
mallas, fibras, material poroso o un
relleno slido.

FILTRACIN POR SUCCIN

La filtracin a vaco o por succin se utiliza para mezclas
como barros y pastas.
El agua al pasar a travs de la trompa, en el estrechamiento
interior, aumenta su velocidad originando una disminucin de
presin. Esto origina una succin del aire a travs de la
conexin con el matraz, originando un pequeo vaco en ste.
Tambin se emplea para separar los
cristales obtenidos a
partir de una disolucin.

DECANTACIN
Consiste en separar
componentes que contienen diferentes
fases siempre que exista una diferencia significativa entre
las densidades de las fases ( dos lquidos no miscibles, un
slido de un lquido. etc.)

CRISTALIZACIN
Proceso de separacin de un soluto a partir de su disolucin,
por sobresaturacin de la misma, aumento de la concentracin o
por enfriamiento de esa disolucin.
La cristalizacin permite separar solutos prcticamente puros.
Cmo se sobresatura una disolucin para
cristalizar el soluto?

que

comience a

Saturando la disolucin en caliente con posterior enfriamiento

de la misma
Aumentando
su
concentracin
evaporando
una
parte
del
disolvente
Adicionando a la disolucin otra sustancia ms soluble en el
disolvente que el compuesto que se desea separar

TIPOS DE DISOLUCIONES
Disolucin no saturada: concentracin de soluto es inferior a
su solubilidad
Disolucin
saturada: concentracin de soluto es igual a su
solubilidad
Disolucin sobresaturada: concentracin de soluto es superior
a su solubilidad (sistema inestable)

Cuanto ms lento sea el enfriamiento de la disolucin saturada

ms grandes y puros sern los cristales del slido que se
separa.

EL PROCESO DE CRISTALIZACIN
Tcnica ms simple
orgnicos slidos.

eficaz

para

purificar

compuestos

Consiste en disolver el slido impuro en la menor cantidad de

disolvente posible y en caliente. En estas condiciones se
genera una disolucin saturada que a medida que se va
enfriando se sobresatura y origina la cristalizacin.
Como el proceso de cristalizacin es dinmico, las molculas
que estn en la disolucin alcanzan el equilibrio con las que
forman parte de la red cristalina. El alto grado de ordenacin
de esa red no permite la participacin de impurezas en la
misma. Por eso es conveniente que el proceso de enfriamiento
sea lento para que los cristales se formen poco a poco y el
lento crecimiento de la red cristalina excluya las impurezas.
Si el enfriamiento de la disolucin es muy
rpido
impurezas pueden quedar atrapadas en la red cristalina.

las

ELECCIN DEL DISOLVENTE DE CRISTALIZACIN

Para su eleccin es muy til
la regla semejante disuelve
semejante. Los disolventes ms usados en orden de polaridad
creciente son: hexano, cloroformo, acetona, acetato de etilo,
etanol y agua.
Es conveniente elegir un disolvente cuyo punto de ebullicin
no sea superior a 60C y que a su vez sea por lo menos 10 C
menor que el punto de fusin del slido que se desea

cristalizar, para
que se pueda eliminar fcilmente por
evaporacin.
Muchas veces es necesario usar una mezcla de disolventes y es
conveniente probar diferentes mezclas hasta encontrar aquella
que nos proporciones la cristalizacin ms efectiva. Una vez
obtenidos los cristales se procede a eliminar el lquido
sobrenadante llamado aguas madres
generalmente mediante un
proceso de decantacin.

RECRISTALIZACIN
Con el fin de conseguir una cristalizacin ms correcta
algunas veces es necesario llevar a cabo un recristalizacin
La finalidad de este proceso es conseguir un adecuado grado de
pureza que nos permita determinar el punto de fusin de la
sustancia.
El punto de fusin de un compuesto es una caracterstica
fsica que nos confirma el grado de pureza de una muestra.
No se puede hablar de punto de fusin exacto sino de un
intervalo de fusin. Si la muestra est impura el intervalo de
fusin es alto.
En la siguiente tabla presentamos los disolventes ms
empleados en la cristalizacin de las clases ms comunes de
compuestos orgnicos.
Tipos de compuestos

Disolventes sugeridos

Hidrocarburos
teres
Haluros
Compuestos carbonlicos
Alcoholes y cidos
Sales

Hexano, ciclohexano, tolueno

ter, diclorometano
Diclorometano, cloroformo
Acetato de etilo, acetona
Etanol
Agua

SUBLIMACIN
Es el paso de una sustancia del estado slido al gaseoso sin
pasar por el estado lquido. Se puede considerar como una
forma especial de destilar una sustancia slida.
El
slido
que
sublima
se
convierte
directamente
por
calefaccin (sin fundir) en su vapor, despus se condensan sus
vapores a slido mediante enfriamiento

La temperatura de sublimacin es aquella a la cual la presin

de vapor del slido iguala a la presin externa.
Para que una sustancia sublime debe tener una elevada presin
de vapor, es decir, las atracciones intermoleculares en estado
slido deben ser dbiles
Cuanto menor sea la diferencia entre la presin externa y la
presin de vapor de una sustancia ms fcilmente sublimar.
La sublimacin es un mtodo excelente para la purificacin de
sustancias relativamente voltiles.
Ejemplos: la desaparicin de la nieve, sin fundir, en un da
de invierno fro pero soleado, el dixido de carbono slido,
la naftalina
y el yodo que subliman a la temperatura
ambiente.

TCNICA DE SUBLIMACIN
Se calienta en el vaso de precipitados el yodo slido y lo
tapamos con una superficie fra, en esta caso un baln al que
se le aade agua hielo para evitar que el vapor de yodo
eleve peligrosamente su temperatura.
El vapor de yodo choca con el fondo del baln, y la rpida
disminucin de la temperatura hace que el yodo vuelva al
estado slido en forma de pequeos cristales que se pueden
observar al levantar el baln.

DESTILACIN
La separacin y purificacin de lquidos por destilacin
constituye una de las principales tcnicas para purificar
lquidos voltiles. La destilacin hace uso de la diferencia
entre los puntos de ebullicin de las sustancias que
constituyen una mezcla.
Las dos fases en una destilacin son la vaporizacin o
transformacin del lquido en vapor y la condensacin o
transformacin del vapor en lquido. Existen varios tipos de
destilaciones. La eleccin en cada caso se hace de acuerdo con
las propiedades del lquido que se pretenda purificar y de las
impurezas que lo contaminan.
El mtodo fsico consiste en suministrar calor a la mezcla
logrando que el lquido de menor punto de ebullicin se
vaporice en primer lugar y luego se produzca la condensacin
de ese vapor al ponerlo en contacto con una superficie fra.

DESTILACIN SIMPLE
Tcnica utilizada en la purificacin de lquidos cuyo punto de
ebullicin es inferior a 150C a la presin atmosfrica.
til para eliminar impurezas no voltiles
Tambin sirve para separar dos lquidos con puntos de
ebullicin que difieran en al menos 25 C.
El vapor formado por la ebullicin del componente, simplemente
se condensa y se recoge en el matraz.

DESTILACIN A VACO O PRESIN REDUCIDA

Tcnica usada en la separacin de lquidos con un punto de
ebullicin superior a 150 C.
Como un lquido hierve cuando su presin de vapor iguala la
presin atmosfrica, se puede reducir su punto de ebullicin
disminuyendo la presin a la cual se destila
Para mantener una ebullicin homognea se puede usar plato
poroso o adaptar al conjunto un capilar para mantener la
ebullicin homognea.
Este montaje nos permite
destilar lquidos a bajas
temperaturas evitando de esta forma la descomposicin trmica
de las sustancias.
Similar al anterior excepto que el sistema se conecta a una
bomba de vaco o una trompa de agua.
Equipo de destilacin a vaco

DESTILACIN FRACCIONADA
Tcnica que se utiliza en la separacin de sustancias cuyos
puntos de ebullicin difieren entre s menos de 25C.

La diferencia con la destilacin simple es que incorpora una

columna de fraccionamiento (o de rectificacin) entre la
disolucin y el refrigerante.
La columna de fraccionamiento consta de un tubo largo de
vidrio que lleva en su interior un relleno inerte (hlices de
vidrio) o unos platos de condensacin.
La columna aporta una gran superficie para el intercambio
entre el vapor que sube y el condensado que desciende, lo que
hace posible una serie de vaporizaciones y condensaciones a lo
largo de la columna.
Equipo de destilacin fraccionada

EL PROCESO DE DESTILACIN FRACCIONADA

En cualquier punto de esa columna de fraccionamiento,
condensado fro recibe calor del vapor que asciende y
vuelve a vaporizar parcialmente formando un vapor que
enriquece en el componente ms voltil.

el
se
se

10

De la misma manera, al ceder calor al condensado el vapor se

enfra formando un condensado ms rico en el componente menos
voltil.
Con la columna adecuada y un control suficiente de la
temperatura se pueden separar con esta tcnica
lquidos que
difieren unos pocos grados en su punto de ebullicin.
UNA DESTILACIN FRACCIONADA ES EQUIVALENTE A UNA SECUENCIA DE
DESTILACIONES SIMPLES Y POR TANTO UN PROCESO MS EFICIENTE.
Esta tcnica es particularmente importante en la industria
del petrleo,
donde el
crudo se destila para obtener
diferentes fracciones de intervalos
de ebullicin creciente.
A partir de estas fracciones se pueden obtener sustancias
puras mediante procesos ulteriores.
Torre de destilacin fraccionada del petrleo crudo

DESTILACIN EN CORRIENTE DE VAPOR

Tcnica que se
solubles en agua

usa

en

la

separacin

de

sustancias

poco

11

Al hacer pasar una corriente de vapor a travs de la mezcla,

ambos componentes se destilan juntos.
Como el agua y el compuesto
son inmiscibles, cada uno de
ellos ejerce su presin de vapor independientemente del otro
(al contrario que en la destilacin simple)
Cuando la suma de la presin de vapor del compuesto y del agua
se iguala a la presin atmosfrica, por debajo de 100C,
se
produce la destilacin conjunta de ambos componentes.
Equipo de destilacin con arrastre de vapor

La condensacin de los vapores produce una mezcla acuosa a

partir de la cual se extrae el compuesto deseado por
filtracin o extraccin.
Se emplea para separar una sustancia de una mezcla que posee
un punto de ebullicin muy elevado y que se descompone al
destilar.
Tambin se utiliza para separar disolventes de alto punto de
ebullicin de sustancias slidas que no son arrastradas.

12

Principal mtodo de obtencin de los aceites esenciales,

fragancias naturales muy apreciadas que se encuentran en las
plantas, como el mentol, eucaliptol, eugenol, la vainillina,
etc.

EXTRACCIN
Tcnica
general
ms
utilizada
para
purificacin de un compuesto orgnico
reaccin o de sus fuentes naturales

el
de

aislamiento
una mezcla

y
de

Se aplica a todo tipo de mezclas ya sean slidas, lquidas o

gaseosas
Est fundamentada en la diferencia de solubilidades de los
compuestos.

LEY DE DISTRIBUCIN O REPARTO

La distribucin de un soluto entre
dos disolventes
inmiscibles est gobernada por la ley de Distribucin o de
Reparto.
Para un soluto A distribuido libremente entre dos fases se
cumple:
K =

[Ao] / [Aw]

[Ao] = Concentracin del soluto en la fase orgnica

[Aw] = Concentracin del soluto en la fase acuosa
K = Coeficiente de reparto
El soluto A se distribuye entre las dos fases en funcin de su
solubilidad en ambas
originando un equilibrio de particin
dinmico. Este equilibrio viene definido por su constante de
equilibrio, constante de distribucin
o coeficiente de
reparto K.
Cuando se ha alcanzado el equilibrio se establece una
diferencia entre las relaciones de concentracin en ambas
fases.
Esa relacin de concentraciones entre la fase orgnica y la
fase acuosa es independiente de la cantidad total de A

13

Fase orgnica

Fase acuosa

Mediante extracciones sucesivas con pequeas porciones del

disolvente extractante, se separa mayor cantidad de soluto que
con una sola extraccin en la que se utilice todo el volumen
de extractante.

EJEMPLO
Se extraen 1000 ml de una disolucin acuosa que contiene 60
gramos de I2 con 1000 ml de tetracloruro de carbono. Se desea
saber: A) La cantidad de I2 que queda en la disolucin acuosa.
B) La cantidad de I2 que queda en la disolucin acuosa si la
extraccin se realiza con dos porciones sucesivas de 500 ml de
Yodo es 80 veces ms soluble en CCl4 que en
CCl4. DATO: el
agua.
A)

Una nica extraccin

X = gramos de Yodo remanentes despus de la extraccin

Concentracin de I2 en CCl4 = 60 x / 1000
Concentracin de I2 en H2O = x / 1000
80 = Concentracin de I2 en CCl4 / Concentracin de I2 en H2O
80 = [ 60 x / 1000] / [ x/ 1000 ]
= 60 x / x
x =
B)

0,47 gramos de yodo remanentes

Dos extracciones sucesivas

B 1)

Primera extraccin

14

Y = gramos de Yodo remanentes despus

primera extraccin
Concentracin de I2 en H2O = Y / 1000
Concentracin de I2 en CCl4 = 60 Y / 500
80 = [ 60 Y / 500 ] /

de

finalizada

la

finalizada

la

[ Y / 1000 ]

Y = 1,46 gramos de Yodo remanentes

B 2) Segunda extraccin
Z =
gramos de Yodo remanentes despus de
segunda extraccin
Concentracin de I2 en H2O = Z / 1000
Concentracin de I2 en CCl4 = 1,46 Z / 500
80 = [ 1,46 Z / 500 ] / [ Z / 1000 ]
Z = 0,0356 gramos de yodo remanentes

EXTRACCIN LQUIDO LQUIDO

Consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente
de tal forma que uno de los componentes se disuelva en dicho
disolvente y el resto de las sustancias no lo haga.
Los compuestos orgnicos en disoluciones acuosas se extraen
generalmente agitando vigorosamente dicha solucin
con un
disolvente orgnico no miscible.
El proceso se realiza en un embudo de decantacin

15

EL PROCESO DE EXTRACCIN LQUIDO LQUIDO

1) Se agita vigorosamente ambas capas
2) Se deja sedimentar ambas capas.
3) Se separan
La eliminacin del disolvente se realiza en un rotavapor

ELIMINACIN
(ROTAVAPOR)

DE

UN

DISOLVENTE

PRESIN

REDUCIDA

Consiste en eliminar un disolvente orgnico de una mezcla de

reaccin
El motor elctrico produce el giro de un tubo que tiene un
ajuste esmerilado al cual se acopla el
matraz de fondo
redondo que contiene la disolucin.
El matraz debe estar parcialmente sumergido en un bao de agua
y girando.
En el caso de disolventes orgnicos usuales la temperatura del
bao debe oscilar entre 35 40 C
Acoplado al sistema hay un refrigerante por el que circula
generalmente agua, que origina la condensacin de los vapores
del disolvente que se recogen en un colector
El conjunto es un sistema cerrado conectado a una bomba de
vaco, una trompa de agua o un circuito de vaco
Esto tambin se puede realizar mediante destilacin simple,
sin embargo, es el
procedimiento ms empleado por ser ms
rpido y cmodo.

16

EXTRACCIN SLIDO LQUIDO

Para la extraccin en continuo donde la sustancia a extraer se
encuentra en estado slido y el extractor es un lquido se
emplea el SOXHLET.
Tcnica ms utilizada y consiste en extraer la mezcla con un
disolvente que disuelve todos los componentes.
La extraccin continua es una combinacin de extraccin
destilacin que permite la recuperacin del disolvente.

Equipo soxhlet para la extraccin en continuo

PROCEDIMIENTO
1)
La mezcla slida finamente dividida se introduce en un
cartucho de extraccin y se coloca en el Soxhlet
2) El disolvente
ebullicin.

elegido se coloca en el matraz y se lleva a

17

3) Los vapores del

encima de la muestra

disolvente

extractor

se

condensan

por

4) El condensado caliente lixivia la muestra mientras se va

llenando el cartucho.
5) Cuando la cmara se ha llenado, la disolucin se sifona y
vuelve al matraz de destilacin.
El proceso se repite sucesivamente con lo que se consigue que
aumente la concentracin del extracto en el disolvente
extractor.

EXTRACCIN CON FLUIDOS SUPERCRTICOS (EFS)

Tcnica muy utilizada para la extraccin de aceites esenciales
(aromas
y
fragancias),
medicinas
naturales,
pesticidas
naturales, tabaco libre de nicotina, caf y t descafeinado,
productos libres de colesterol y en el tratamiento de residuos
orgnicos industriales.
Un fluido es supercrtico cuando est sometido a condiciones
superiores a su presin y temperatura crtica, en este caso se
encuentra en estado supercrtico.
En este estado la lnea de separacin de fases lquido gas
se interrumpe. Esto implica la existencia de una sola fase en
la que el fluido tiene propiedades intermedias entre las de un
lquido y un gas. Mantiene su gran difusividad (propia de los
gases) mientras consigue una alta densidad (propia de los
lquidos)

18

CARACTERSTICAS DE LOS

FLUIDOS SUPERCRTICOS

Dada la relacin directa entre la densidad de un fluido con su

poder de solvatacin, vemos como los fluidos supercrticos
tienen una gran capacidad de solvatacin que,
unido a la
enorme difusividad que presentan, les permite penetrar a
travs de matrices porosas aportando al
fluido supercrtico
una gran versatilidad.
Su gran poder disolvente junto a una gran capacidad
penetracin en los slidos permite el agotamiento rpido
prcticamente total de los slidos extrables. (pe, en
extraccin de
productos naturales se originan
extractos
alta pureza).

de
y
la
de

Pueden separarse totalmente en forma sencilla de los extractos

modificando la presin y la temperatura, hasta el extremo, si
es necesario de que el fluido pase al estado gaseoso.

FLUIDOS MS USADOS

EN EFS

Dixido de carbono (CO2). Agua (H2O.Etano

Propano (C3H8) Xenn (Xe) xido nitroso (N2O)

(C2H).Eteno

(C2H4)

De todos ellos el ms usado es, tanto a nivel de laboratorio

como en procesos industriales el dixido de carbono. Se trata
de un gas inocuo (no txico, no corrosivo, no inflamable)
abundante,
barato
y
cuyas
condiciones
crticas
son
relativamente bajas (31C, 73 atm) y por tanto fciles de
operar.

EL
PROCESO
DE
SUPERCRTICOS

EXTRACCIN

MEDIANTE

FLUIDOS

1) La mezcla, generalmente un slido molido, es cargada en el

extractor.
2) El CO2
es alimentado
hacia el
extractor a travs de
una bomba de alta presin (100 400 bar). El CO2 comprimido
es calentado hasta la temperatura de extraccin (30 60C).
3) Ingreso en el extractor donde se
a extraer.

disuelven los compuestos

4) La mezcla CO2 extracto es enviada a un separador (50

160 bar) previo paso a travs de una vlvula de reduccin. A
temperatura
y
presin
reducida,
el
extracto
precipita
espontneamente en el separador, mientras que el CO2, libre de
cualquier extracto, es reciclado al proceso, con unos pasos
previos de enfriamiento y compresin

19

5) El CO2 se puede usar slo o combinado con otros fluidos

como metanol, amoniaco, etc. que permite variar su polaridad
logrando con ello mejorar la selectividad de la separacin. A
estos aditivos se les llama modificadores polares
6) La separacin se realiza frecuentemente en etapas,
manteniendo condiciones distintas en dos o tres separadores,
para fraccionar el extracto en funcin de las solubilidades de
los componentes y las especificaciones deseadas de los
productos.
VENTAJAS
MEDIANTE

E INCONVENIENTES DE
FLUIDOS SUPERCRTICOS

LA

TCNICA

DE

EXTRACCIN

El CO2 no deja residuo en los compuestos procesados. No hay

presencia de disolventes orgnicos en el extracto. El uso de
temperaturas moderadas evita la degradacin trmica del
extracto.
Alto coste de los equipos y su mantenimiento. No se obtienen
todos los compuestos presentes en la muestra. Para cualquier
composicin
de
la
muestra
inicial
no
existen
datos
experimentales para conocer como se distribuye el soluto en el
fluido supercrtico. Este es su mayor inconveniente.

20

CROMATOGRAFA
Cromatografa significa
Escribir en Colores
[del griego
cromos (color) y grafe (escribir)]. Debe su nombre al bilogo
ruso Mikhail Tswett primera persona que utiliz esta tcnica
(1906) al separar una mezcla de pigmentos naturales.
Utiliz una columna larga de vidrio, rellena de sulfato de
calcio finamente dividido y con una llave en su extremo
inferior.
Comprob que al colocar una mezcla de pigmentos verdes de una
planta en una columna que se eluye con ter de petrleo,
aparecen unas bandas horizontales con diferentes colores que
se corresponden con cada uno de los pigmentos de la mezcla y
que indica que ha habido una separacin a lo largo de la
columna
Aproximacin a la tcnica de Tswett

La separacin no tiene nada que ver con el color de los

compuestos sino con la diferente afinidad de adsorcin de los
pigmentos hacia el yeso. De esta forma los compuestos que se
adsorben
ms
dbilmente
avanzan
por
la
columna
de
cromatografa con ms rapidez que los compuestos que se
adsorben ms fuertemente.
Aunque el color tiene poco que ver con la cromatografa
moderna, su nombre ha persistido y se sigue utilizando para
describir todas las tcnicas de separacin en las que
intervienen una fase mvil y una fase estacionaria.

21

DEFINICIN DE CROMATOGRAFA
Se entiende por cromatografa al conjunto de tcnicas
analticas que se fundamentan en la separacin que se produce
cuando una mezcla de compuestos es arrastrada por una fase
mvil a lo largo de una fase estacionaria.
La tcnica cromatogrfica de purificacin consiste en separar
mezclas de compuestos en funcin de su diferente afinidad
entre una fase estacionaria y una mvil.
Todas las tcnicas cromatogrficas dependen de la distribucin
de los componentes de la mezcla entre dos fases inmiscibles,
una de ellas llamada fase activa o fase mvil, que transporta
las sustancias que se separan, y que progresa en relacin a
otra fase llamada fase estacionaria
El sistema cromatogrfico
Soluto

Fase Mvil
Fase Estacionaria

CLASIFICACIN DE LOS PROCESOS CROMATOGRFICOS

La fase mvil puede ser un lquido o un
estacionaria puede ser un slido o un lquido.

gas.

La

fase

Teniendo en cuenta la naturaleza de la fase estacionaria se

establece la siguiente clasificacin.
CROMATOGRAFA DE ADSORCIN: la fase estacionaria es un slido
sobre el que se adsorben los componentes de la muestra.
-

Cromatografa Lquido Slido CLS (fase mvil lquido)

Cromatografa Gas Slido CGS (fase mvil gas)
Cromatografa en Capa Fina CCF
(fase estacionaria slida en forma
plana y la mvil
lquida)

CROMATOGRAFA DE REPARTO: la fase estacionaria es un lquido

sostenido por un slido inerte.
-

Cromatografa
lquido)

Lquido

Lquido

CLL

(fase

mvil

un

22

Cromatografa Gas Lquido CGL (fase mvil un gas)

Cromatografa en papel (fase estacionaria es una capa de
agua adsorbida sobre una hoja de papel)

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO: la fase estacionaria es

una resina de intercambio
inico y la separacin se produce
por la unin de los iones a la fase estacionaria.
CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR: la fase estacionaria es
una estructura parecida a un tamiz y la separacin se produce
en funcin del tamao de las molculas.
Teniendo en cuenta
clasifica en:

la

forma

de

la

fase

estacionaria

se

Cromatografa en columna

Cromatografa plana (cromatografa en capa fina y en

papel.

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
Existen ciertas sustancias slidas, qumicamente inertes, que
tienen la propiedad de
adsorber o fijar dbilmente en su
superficie a una gran cantidad de compuestos. La fortaleza con
la que se adsorben las sustancias sobre un adsorbente dado
vara de un compuesto a otro.
Entre los adsorbentes
ms
usuales:
slica Gel (xido de
silicio), almina
(xido de aluminio), celulosa, fluorosil
(silicato de
magnesio) y sulfato de calcio.
La separacin
adsorcin
de
estacionaria.

se realiza por la diferente tendencia de

los
compuestos
orgnicos
por
la
fase

La fase mvil
desplaza y disuelve a los componentes de la
mezcla segn sea su afinidad por la fase estacionaria
es
decir, los componentes ms polares estarn adsorbidos con ms
fuerza y sern ms difciles de separar de la fase
estacionaria que los componentes poco polares.
Los menos polares no presentan una interaccin importante con
la fase estacionaria (gel de slice) y no sern retenidos.

23

H
Si O H O
Si

O
Si

Puede formar puentes de hidrgeno

o enlaces de tipo dipolo-dipolo.

Si O H

Silicagel
En un proceso de adsorcion los componentes de
son adsorbidos por la fase estacionaria con
intensidad de tal forma que el proceso adsorcin hace que unos componentes avancen ms rpidamente que

la mezcla
diferente
desorcin
otros.

La adsorcin es un proceso de superficie

mientras que la
absorcin es la penetracin de una sustancia en el seno de
otra (al escribir el papel adsorbe tinta mientras que la
esponja absorbe agua).
En cualquier fenmeno de adsorcin influyen tres variables
independientes: el adsorbente, el disolvente y las sustancias
a cromatografiar.
Por tanto, s una molcula tiene una gran afinidad pasar muy
lentamente mientras que otro componente con menos afinidad lo
har ms rpidamente.

Adsorbentes
menor
a
adsortivo

por orden de Disolventes por orden de menor

mayor
poder a mayor poder eluyente

Azcar, almidn
Inulina
Talco
Carbonato de sodio
Carbonato de potasio
Carbonato de calcio
xido de magnesio
Gel de slice activada
Almina activada (Al2O3)

Hexano, ter de petrleo

Heptano
Ciclohexano
Tetracloruro de carbono
Benceno
Tolueno
Cloroformo
ter dietlico
Acetato de etilo
Piridina
Acetona
Propanol
Etanol
Metanol
Agua
Mezcla de cidos o
bases con
agua, alcoholes o piridina.

24

La
regla general es elegir la polaridad
anloga a la de la muestra a emplear y en la
casos adsorbentes poderosos (activos) para
polares y adsorbentes con menos actividad para
polares.

del disolvente
mayora de los
sustancias no
sustancias ms

En la tabla anterior se indica una relacin de adsorbentes y

disolventes ordenados de menor a mayor polaridad, (actividad y
poder eluyente respectivamente).

CROMATOGRAFA DE PARTICIN O REPARTO

Tcnica donde la separacin selectiva de los componentes se
produce por el diferente grado de solubilidad que estos puedan
tener con las dos fases participantes. Es decir, como si se
estuviese produciendo un elevado nmero de extracciones.
Por ello, las fases tiene que ser inmiscibles entre si y el
soluto sufre un equilibrio de particin entre ambas que queda
definido por una constante K, llamada coeficiente de
reparto, cuyo valor depende para una fase estacionaria
determinada y para una fase mvil dada, de la naturaleza del
soluto a aislar, lo que origina las diferencias en la
retencin y la consiguiente separacin.
El soluto se reparte entre el lquido de la fase estacionaria
y la fase mvil, por diferencia de solubilidad, hasta alcanzar
el equilibrio.
La tcnica cromatogrfica consiste en disponer de una columna
de tal forma que su contenido sea capaz de establecer fuerzas
de retencin hacia una sustancia, a la vez que un disolvente
que pasa continuamente por esa columna sea capaz de establecer
fuerzas de disolucin hacia ese soluto.
Lgicamente, para que la fase estacionaria se mantenga dentro
de la columna debe estar formando una delgada pelcula sobre
un soporte inerte.
En este tipo de cromatografa se debe controlar la temperatura
y los volmenes de ambas fases (estacionaria y mvil) ya que
estos parmetros alteran la solubilidad y por tanto el
coeficiente de reparto.

25

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN EN COLUMNA

Cromatografa liquido slido que utiliza columnas huecas
verticales de vidrio cerradas en su parte inferior con una
llave que permite la regulacin del flujo de la fase mvil.
Como fase estacionaria se emplean bsicamente dos adsorbentes,
gel de slice y almina.
La tcnica consiste en rellenar la columna con el adsorbente
elegido que debe sedimentar sin que se produzcan canales o
grietas.
En la parte superior de la columna se coloca la mezcla a
separar, llamada cabeza de la columna que se obtiene mezclando
el adsorbente con la muestra con el eluyente (fase mvil) que
va a ser utilizado en el proceso de separacin
Se deja que el eluyente empiece a descender por la columna ya
sea por gravedad o a presin (cromatografa flash).
Se produce la adsorcin de los componentes con diferentes
intensidades logrando que unos avancen ms que otros.
En la parte inferior de la columna se recogen las diferentes
fracciones cromatogrficas que se analizan y agrupan en
funcin de sus caractersticas.

26

El
rendimiento
del
proceso
depende
bsicamente
preparacin de la columna y del proceso de elucin.

de

la

El relleno de la columna puede ser en seco o en hmedo. El

seco tiene el inconveniente de que pueden aparecer burbujas de
aire en la columna que son difciles de eliminar. Tambin hay
que tener presente que los adsorbentes al empaparse de
los
eluyentes aumenta su volumen y pueden romper la columna. El
relleno hmedo evita los problemas anteriores y consiste en
llenar la columna en forma continua con una mezcla de
adsorbente con el eluyente a utilizar de menor polaridad.
La cantidad de adsorbente a emplear es de 20 25 gramos de
adsorbente por cada gramo de mezcla a separar. Este es el tipo
de cromatografa ms utilizado en Qumica Orgnica.
El orden aproximado de elucin de los compuestos es el que se
indica a continuacin.

Aumento de la polaridad
movimiento ms lento

Alcanos
Alquenos
teres
Hidrocarburos halogenados
Hidrocarburos aromticos
Aldehdos y cetonas
steres
Alcoholes
Aminas
cidos carboxlicos

Polaridad de los disolventes ms usuales:

Aumento de la polaridad,
se eluye ms fcilmente

Alcanos
(hexano,
ter
de
petrleo)
Tolueno
Hidrocarburos halogenados
ter dietlico
Acetato de etilo
Acetona
Alcoholes
cido actico.

27

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

La tcnica de Cromatografa en Capa Fina
CCF ( TLC,
sus
siglas en ingls Thin Layer Cromatography) es una adaptacin
especial de la cromatografa de adsorcin muy utilizada en
Qumica Orgnica ya que entre otras cosas nos permite:
-

Determinar el grado de pureza de una muestra

Comparar muestras.

Hacer el seguimiento de una reaccin qumica

Controlar el contenido de las fracciones obtenidas por
cromatografa en columna
Determinar las condiciones ms adecuadas para una
cromatografa en columna.

La fase estacionaria consiste en una fina capa delgada de gel

de slice o almina adherida a un soporte de vidrio, aluminio
o materiales plsticos con un grosor que puede oscilar entre 1
hasta 0,1 0,2 mm.
Algunas placas vienen con indicadores
fluorescentes.
Para realizar la cromatografa se aplica la muestra disuelta
en la parte inferior de la placa, y a 1 cm del borde de la
misma, con la ayuda de un capilar.
Las muestras se deben colocar entre 1 - 1,5 cm del extremo de
la placa de tal forma que al ponerla en contacto con el
disolvente que se encuentra en la cubeta no cubra la muestra.

28

El cromatograma se introduce verticalmente en un recipiente

cerrado llamado cubeta de cromatografa o tanque de desarrollo
que contiene en su fondo una pequea cantidad del
eluyente
que se vaya a usar (fase mvil)
dejando que el disolvente
ascienda por capilaridad.

Las sustancias que forman parte de la muestra se adhieren a la

fase estacionaria o son arrastradas con la fase mvil,
viajando una distancia que es inversamente proporcional a su
afinidad por la fase estacionaria.
Cuando el eluyente ha ascendido hasta casi el borde superior
de la placa, se saca, se seca y se observan las seales.
Muchas veces las sustancias desarrolladas por este mtodo, al
no ser coloreadas, no son visibles. Para hacerlas visibles se
utiliza luz ultravioleta entre 240 270 nm.
Para hacer visibles aquellas seales que no se detectan a la
luz UV ni son coloreadas, se procede al revelado de la placa
usando un revelador destacando entre los ms usuales el Yodo y
el Oleum [mezcla de cido sulfrico (4%) cido actico (80%)
y agua (16%)]
El revelado consiste en pulverizar el cromatograma con la
especie reveladora y posterior calentamiento en una estufa
alrededor de 100 C, logrndose
de esta manera la
carbonizacin de los compuestos orgnicos.
El cromatograma una vez revelado nos presenta mediante manchas
el grado de pureza de la muestra o el nmero de compuestos
presentes en ella.

29

Cmara para el revelado de la placa

Cromatograma

CONCEPTO DE FACTOR DE RETENCIN - Rf

Para determinar las posiciones relativas de las seales se
utiliza el concepto de Rf o Factor de Retencin.
El Rf es la relacin que existe entre el recorrido de una
mancha, medido desde el origen hasta el centro de la misma, y
el recorrido por el disolvente (fase mvil) medido desde el
origen hasta el frente.
Distancia recorrida por la seal de un compuesto

Rf

-------------------------------------------Distancia recorrida por el frente del disolvente

El Rf se expresa en valores que oscilan desde 0,01 hasta 0,99

y, tambin en porcentaje.

30

Cuanto menos haya recorrido la sustancia

estacionaria, menor ser el Rf de la misma.

en

la

fase

Los valores de Rf se pueden utilizar con fines comparativos

para
identificar
sustancias
al
comparar
con
muestras
autnticas de las mismas.

CROMATOGRAFA EN CAPA FINA BIDIMENSIONAL

Cuando las mezclas a analizar son complicadas la cromatografa
unidireccional slo nos conduce a una separacin parcial.
Para conseguir una mejor separacin de las manchas se
la TLC bidimensional.

utiliza

La tcnica consiste en realizar una CCF normal pero colocando

la muestra en una esquina del cromatograma y eluyendo dicha
placa con un disolvente A. Cuando el eluyente ha llegado al
extremo superior de la placa se saca y se seca.
A continuacin
se gira la placa 90 y se vuelve a
cromatografiar utilizando otro eluyente B.
El empleo de un
disolvente con caractersticas diferentes al primero permite
aumentar el recorrido de las sustancias
facilitando la
separacin parcial de las seales.
Despus del segundo desarrollo se saca la placa de la cubeta
se seca y se revela con algn agente selectivo.

31

Tambin es posible identificar un compuesto determinado sobre

un cromatograma bidimensional por comparacin de su posicin
(Rf) con la de algn compuesto estndar colocado sobre el
mismo cromatograma.
Capa fina bidireccional

Giro 90

Disolvente

x
Disolvente

TLC PREPARATIVA
La cromatografa en capa fina tambin se puede usar con fines
cuantitativos
para
separar
pequeas
cantidades
de
un
compuesto.
Las separaciones preparativas se realizan en placas estndar
de 20 x 20 cm (algunas veces en placas de 20 x 40 cm) ms
gruesas y el volumen de la muestra tambin debe ser mayor
(alrededor de 10 ml).
La muestra se aplica en forma de banda lineal
pipeta Pasteur o con un capilar.

mediante una

Para la TLC preparativa podemos utilizar todos los sistemas de

disolventes
que
hemos
descrito
para
la
TLC
analtica
obteniendo los mismos resultados.
Una vez realizada la cromatografa, las bandas de inters se
ponen de manifiesto utilizando una tcnica no destructiva con
el reactivo adecuado (luz UV o Yodo).

32

Capa gruesa sin revelar

La zona de la placa que contiene dicha banda es raspada y

recuperada en un matraz y extrada con el disolvente adecuado.
Finalmente el disolvente es evaporado para la recuperacin del
soluto.
Esta tcnica tiene la ventaja de que su tiempo de desarrollo
es inferior al de una cromatografa en columna.

CROMATOGRAFA EN PAPEL
Es similar a la CCF, excepto en que como fase estacionaria se
utiliza
una capa de agua adsorbida sobre una hoja de papel
(lquido retenido sobre un soporte slido inerte).
El papel
contiene retenido alrededor de un 20% de agua.
El soporte general que se utiliza es papel Whatman nmero 1 y
nmero 3 para separaciones analticas y Whatman 3MM para
trabajos preparativos
No es estrictamente una cromatografa de adsorcin sino una
combinacin de adsorcin y reparto.
El reparto se produce
entre el agua que hidrata la celulosa de la fase estacionaria
y la fase orgnica mvil.

33

Cubeta para cromatografa en papel

La tcnica consiste en colocar el papel (fase estacionaria)

en una cubeta de vidrio colgndolo de un soporte.
La fase mvil, colocada
en el
fondo de la cubeta (1 1,5
cm), entra en contacto con el papel sobre el cual, a 1 cm de
distancia
hemos
colocado
las
muestras
que
deben
ser
arrastradas y separadas.
Este tipo de cromatografa, llamada ascendente, se debe
realizar en unas condiciones estndar de saturacin previa de
la fase estacionaria ya que el disolvente se puede evaporar
del papel antes de que se produzca la separacin y no se
consiga el efecto deseado.
La
tcnica
de
cromatografa
en
papel
se
utiliza
preferentemente
cuando
se
trata
de
separar
compuestos
polifuncionales o muy polares como aminocidos o azcares.
La tcnica descendente es similar a la anterior y slo se
diferencia en que el papel es introducido por su parte
superior en una canaleta donde hay una pileta para el
disolvente.
Las muestras colocadas en la parte superior del papel, a 1 1,5 cm de la canaleta, sern arrastradas hacia abajo por el
eluyente (fase mvil).
Los resultados de ambas tcnicas son similares.
En forma anloga a la TLC se pueden realizar cromatografas en
papel tanto preparativa como bidimensional.

34

Comparacin de las tcnicas de cromatografa en columna y plana

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA - HPLC

Tcnica muy utilizada para el anlisis de compuestos orgnicos
pesados como pesticidas, aromticos polinucleares, frmacos,
vitaminas, alimentos etc. Cromatografa
de
adsorcin
conocida
como HPLC (siglas en ingls
High Performance
Liquid Chromatography)
o Cromatografa Lquida de Alta
Presin
o Resolucin.
Es una variante de la cromatografa en columna donde la fase
estacionaria est formada por partculas muy pequeas, en
forma esfrica, que hace que el empaquetamiento de la columna
sea muy compacto.
La disminucin del tamao de los poros que forman la fase
estacionaria
hace que la cromatografa sea muy lenta
prdida de carga, por lo que hay que instalar a la entrada de
la columna un sistema de bombeo que tiene dos finalidades:
I)
Superar la resistencia del relleno
II) Aportar un flujo de fase mvil que puede ser controlado a
lo largo de toda la
cromatografa
En estas condiciones se consigue acortar el tiempo de anlisis

35

de las columnas de gravedad.

En la cromatografa lquida los componentes de una mezcla son
llevados a travs de una fase estacionaria fijada dentro de
una columna de cromatografa mediante el flujo de una fase
mvil lquida.
Las separaciones estn basadas en las diferentes velocidades
de migracin que existen entre los componentes de la mezcla
que dependen de su naturaleza y su interaccin con las fases.
Una cromatografa por HPLC puede tener un poder de separacin
miles de veces superior al de una columna simple.
Las partculas de relleno suelen ser microesferas de slice,
almina o resina
cuyo dimetro oscila entre 3 25 m
(micras).
Las columnas de HPLC son de acero inoxidable, con un dimetro
interno de 2 5 mm y una longitud variable de 10 30 cm
dependiendo del dimetro de las micropartculas de relleno.
El flujo a presin se aplica entre 1500 800 psi.
En la cromatografa HPLC, como en cualquier tipo de
cromatografa, se distinguen una fase estacionaria y una fase
mvil. Como ambas compiten con las molculas del soluto sern
de polaridades diferentes.
Si la fase mvil la integran compuestos orgnicos poco
polares, la fase estacionaria ser relativamente polar.
La
tcnica derivada de esta situacin se llama de fase normal por
ser la modalidad ms usual de la HPLC.
Si la fase mvil la forman lquidos acuosos o polares y la
fase estacionaria es poco polar o apolar, la tcnica se llama
de fase inversa (cada vez ms usada).

HPLC en fase normal

Fase mvil poco polar (hexano, tetracloruro de carbono,
benceno, etc.)
Fase estacionaria polar (generalmente slice)

HPLC en fase inversa

Fase mvil polar (agua, disoluciones amortiguadoras de pH,
metanol, acetonitrilo, etc.)
Fase estacionaria no polar: (habitualmente silica injertada
con compuestos orgnicos que contienen desde 8 hasta 18 tomos
de carbono).
Esta
tcnica
requiere
un
equipo
muy
sofisticado
que
describimos a continuacin.

36

ESQUEMA DE UN CROMATGRAFO HPLC

Gases disueltos

Jeringa o vlvula para la

muestra
Inyector

Desgasificador

Precolumna

de solventes
Espacio trmico
Cmara
del disolvente
Columna analtica
Medidor
de presin
Filtro

Lectura

Bomba
Detector y Amplificador
Vlvula de
seguridad y purga

Descarga

Recoleccin
o descarga

CMARA DEL DISOLVENTE

Los componentes de la fase mvil para HPLC necesitan un
estricto control de pureza fsica y qumica por ellos tienen
que
ser
filtrados
y
muchas
veces
desgasificados.
Es
conveniente
que
en
esta
cmara
(reservorio)
existan
desgasificadores (aplicacin de ultrasonidos) para eliminar
los gases del disolvente pues producen burbujas en la columna
que interfieren en los resultados. Se puede trabajar con un
solo disolvente (elucin isocrtica) o se puede cambiar
continuamente la composicin del disolvente (elucin por
gradiente).
BOMBA DE ALTA PRESIN
Es la encargada de introducir la fase mvil (eluyente) en la
columna de cromatografa. Estas bombas deben aportar un flujo
constante del disolvente entre 0,001 hasta 10 ml/minuto. Las
elevadas presiones que generan las bombas (varios centenares
de atmsferas) no constituyen un peligro de explosin ya que
los lquidos no son muy compresibles. No obstante, muchos

37

cromatgrafos presentan vlvulas de seguridad y purga por si

se produce este proceso.
PRECOLUMNA
El empleo de una columna previa
(precolumna)
a la columna
analtica
mejora
la
eficiencia
de
la
separacin
cromatogrfica.
Su
misin
es
eliminar
contaminantes
y
partculas de polvo.
CMARA DE INYECCIN DE LA MUESTRA - INYECTOR.
Dispositivo por medio del cual se introduce la muestra en el
sistema cromatogrfico. La inyeccin se realiza con una
jeringa que se introduce en el inyector y descarga la muestra
para su anlisis.
La muestra no debe contener slidos
para
que no se atasque, si es necesario hay que proceder a su
filtracin. La muestra debe ser disuelta en el mismo eluyente
que se va a utilizar. El volumen a inyectar de muestra debe
ser el menor posible para que los resultados sean ms ntidos.
COLUMNA ANALTICA
Es el corazn del sistema cromatogrfico, en ella se produce
la retencin de los diferentes
compuestos que permite su
separacin.
ESPACIO TRMICO - CALENTADOR.
Su misin es controlar la temperatura del proceso que puede
oscilar desde la ambiental hasta 150C. Manteniendo la
temperatura
constante
se
obtienen
mejores
resoluciones
cromatogrficas.
DETECTOR.
Dispositivo que colocado a la salida de la columna nos indica
quien va en la fase mvil. Su misin es detectar los
momentos de emersin de los componentes y
proporcionar
informacin cualitativa y cuantitativa de los mismos. La
accin del detector se traduce en una seal, (normalmente de
tipo elctrico) que posteriormente se amplifica y registra en
un grfico llamado cromatograma.
El cromatograma consta de
una
serie
de
picos
que
se
emplean
para
identificar
cualitativamente (posicin en el eje) y cuantitativamente
(rea de los picos)
a los componentes de la muestra, al
compararlos
con cromatogramas estndar. Se dividen en dos
tipos:
Detector selectivo.
Aquel que responde a una propiedad del soluto en disolucin.

38

Ejemplo, el detector UV/Visible nos mide la absorcin de un

producto a una
determinada
longitud
de
onda,
el
fluormetro que nos mide la fluorescencia, etc.
El ms utilizado es el detector espectrofotomtrico UV/Vis por
ser el ms sensible y estable a los cambios de flujo y
temperatura (trabaja en el rango 190 650 nm). Es el ms
utilizado porque muchos solutos absorben este tipo de
radiacin y son bastantes sensibles a ella.
El sistema ms simple emplea la emisin a 254 nm de una
lmpara de mercurio y deteccin a una sola longitud de onda.
Esquema de un detector espectrofotomtrico UV/Visible

Detector universal.
Aquel que responde cuando una propiedad de la fase mvil es
modificada por la presencia de un soluto en ella.
Ejemplo, el detector de ndice de refraccin (RI)
nos mide
el cambio en el ndice de refraccin entre el lquido
contenido en el matraz y la referencia.
Los ms utilizados son el detector de
el de conductividad.

ndice de refraccin y

COLECTOR DE FRACCIONES
En este mdulo se van recogiendo las fracciones a medida que
van llegando al detector. Esta recogida nos separa los

39

componentes de idnticas propiedades entre s, salvo que

aparezcan picos solapados. A continuacin se toman las
muestras, se comprueba su pureza mediante una cromatografa en
capa fina y se efectan los ensayos de identificacin con las
tcnicas disponibles, IR, RMN, Fluorescencia, Masas, etc. La
mayora de los cromatgrafos de HPLC llevan incorporados un
colector de fracciones.
ORDENADOR CROMATOGRFICO
Microprocesador diseado solo para esta tcnica,
es el nexo
entre todos los componentes del equipo. Su misin es controlar
todas las variables del proceso e indicar en cada instante las
condiciones del sistema.

CROMATOGRAFA DE GASES
Tcnica cromatogrfica que se utiliza para separar compuestos
orgnicos voltiles como hidrocarburos, fenoles, disolventes,
cidos grasos, etc. Hay dos tipos de cromatografa de gases:
Cromatografa Gas Slido (CGS) donde la fase estacionaria
es un slido y la fase mvil un gas inerte. (Tcnica muy
limitada solo aplicable
a compuestos gaseosos de bajo peso
molecular). (Cromatografa de adsorcin)
Cromatografa Gas - Lquido (CGL) donde la fase estacionaria
es un lquido retenido sobre la superficie
de un soporte
slido y la fase mvil es un gas. En este caso la separacin
de los compuestos depende de la constante de solubilidad de la
muestra entre la fase lquida y la fase gaseosa. Esta es la
tcnica conocida vulgarmente como cromatografa de gases
CG
(Cromatografa de reparto).
MTODO GENERAL DE LA CROMATOGRAFA DE GASES
Una pequea muestra del material a separar se inyecta en una
corriente de gas inerte (fase mvil)) que lo transporta hasta
la columna de cromatografa que contiene el medio adecuado
para ir retardando el flujo de los componentes individuales de
la muestra.
Los componentes de la muestra se van separando en la columna
cromatogrfica debido a las diferencias de su perfil de
particin o retencin entre la fase mvil gaseosa y la fase
estacionaria slida o lquida. La diferencia en la adsorcin o
en el reparto sobre el material de la columna es el factor que
hace posible la separacin.
Los compuestos ya separados emergen a intervalos de tiempo
discretos (caracterstico de cada componente) y pasan a travs
de un tipo de detector.

40

Esquema general de un cromatgrafo de gases

ELEMENTOS DEL CROMATGRAFO DE GASES

GAS PORTADOR: Los ms usuales son el helio, argn, nitrgeno,
dixido de carbono e hidrgeno, inyectados a presin que
oscila entre 2 6,3 atm. Su eleccin depende del tipo de
detector instalado en el cromatgrafo. El gas portador,
qumicamente inerte, se mezcla con la muestra vaporizada
impulsndola por el interior de la columna.
INYECTOR:
Dispositivo encargado de introducir la muestra en
la columna. Se mantiene a temperaturas elevadas entre 200
350 C. La temperatura de trabajo se debe elegir de tal forma
que se consiga la volatilizacin de todos los componentes
presentes en la mezcla, pero no debe ser superior a la
temperatura de ebullicin del componente menos voltil ya que
puede producir su descomposicin.
COLUMNAS: La columna de cromatografa est situada dentro de
un horno ya que esta tcnica se realiza a elevadas
temperaturas. Las columnas pueden ser de vidrios, plsticos y

41

metlicas (cobre - nquel y acero inoxidable). Generalmente se

usan columnas metlicas (ms caras pero ms eficaces) cuya
longitud oscila entre
1 4,5 m y entre 2 20 mm de
dimetro.
En las columnas de adsorcin los adsorbentes ms usuales son
la almina, gel de slice y carbn activo.
En columnas de reparto el material de relleno consiste en un
soporte slido finamente dividido como celita, arcilla o
esferitas de vidrio que portan el lquido voltil. Los
lquidos ms empleados son las siliconas, grasas y glicoles
polietilnicos.
DETECTOR:
Los componentes de la muestra ya separados, abandonan la
columna de cromatografa y se dirigen
hacia el detector que
mide alguna propiedad fsica del compuesto que origina una
seal elctrica sobre el registrador.
Entre los detectores ms usuales est el de ionizacin de
llama, conductividad trmica, el termoinico (para detectar
compuestos orgnicos con nitrgeno y fsforo y el detector
fotomtrico de llama til para el anlisis de contaminantes
del agua y del aire como pesticidas e hidrocarburos.
REGISTRADOR:
El proceso de separacin por cromatografa de gases queda
reflejado en un cromatograma donde se observan una serie de
picos. Cada pico representa una sustancia de las eluidas en la
columna.
Estos
picos
vienen
caracterizados
por
tres
parmetros:
* Tiempo de retencin: tiempo transcurrido entre la inyeccin
de la muestra y la elucin de un producto de la misma.
* Volumen de retencin: volumen total del gas portador que se
ha necesitado pasar a travs de la columna para separar
completamente la sustancia responsable de ese pico.
Volumen retencin = (tiempo retencin) x (velocidad del flujo)
* rea de los picos: directamente relacionada con la
concentracin de la sustancia detectada. La altura de los
picos en el cromatograma se expresa en unidades de potencial
elctrico.
El rea de los picos se calcula multiplicando el
alto del pico por el ancho del mismo medido a la mitad de su
altura.

42

Actualmente los cromatgrafos de gases llevan incorporados

unos aparatos llamados integradores que realizan esa funcin
automticamente.
La identificacin de los productos separados se realiza
comparando su tiempo de retencin o volumen de retencin con
el de sustancias conocidas.
En el anlisis de mezclas
con sustancias desconocidas la
tcnica de la cromatografa de gases no es suficiente. En este
caso es necesario recoger la muestra a la salida del detector
para realizar su identificacin con las tcnicas habituales de
IR, RMN, UV y Masas. Esta tcnica tiene dos grandes ventajas:
*
til para separar cantidades muy pequeas de material (del
orden de 10 4 g).
* Requiere poco tiempo para su realizacin al contrario que
otras tcnicas analticas.

Ilustracin de las tcnicas cromatogrficas en capa fina y gases.

43

Aplicacin de la cromatografa de gases en la determinacin de

drogas.
Los
picos
del
cromatograma
se
identifican
positivamente por comparacin con los de estndares conocidos
de drogas.

CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO

Mtodo muy utilizado en la separacin de iones inorgnicos
como
nitratos (NO3-), sulfatos
(SO42), separacin y
purificacin de molculas biolgicas (pe, protenas) y en los
procesos de desionizacin del agua.
La tcnica es muy similar a la utilizada en la cromatografa
en columna y la separacin se produce en funcin de la carga
que posee el soluto.
Fase estacionaria: resinas de intercambio inico que tienen la
propiedad de separar especies ionizadas (aniones o cationes)
Fase mvil: generalmente disoluciones amortiguadoras de pH.

44

La afinidad de los compuestos por los grupos cargados de la

fase estacionaria est influida por el pH que determina su
estado de ionizacin.
El intercambiador inico consiste en una matriz insoluble a la
que se han unido covalentemente grupos cargados. Estos grupos
cargados pueden ser reversiblemente intercambiados por otros
iones de la misma carga sin alterar la matriz. Hay dos tipos
de intercambiadores inicos
Intercambiador catinico.
Posee grupos cargados negativamente que atraen cationes
(cargas +).
Tambin se les conocen como intercambiadores inicos cidos
porque sus cargas negativas proceden de la ionizacin de
sus grupos cidos.
Las resinas catinicas presentan como grupos funcionales ms
frecuentes el sulfonato SO3 H+ y el carboxilato -COO- H+.
Intercambiador aninico.
Posee grupos cargados positivamente que atraen aniones (cargas
negativas).
Tambin se les conocen como intercambiadores inicos bsicos
ya que las
cargas positivas que poseen resultan de la
asociacin de protones con grupos bsicos.
Las
resinas
aninicas
suelen
contener
grupos
amonio cuaternario -RN+R3 (-NH3+OH) y (-+N(CH3)3OH-)
Se utilizan normalmente como fase mvil disoluciones acuosas
tamponadas ya que las propiedades del agua contribuyen a la
disociacin de los grupos inicos y al hinchamiento de la
matriz efectos que aumentan el intercambio inico.
Hay que tener presente dos reglas

bsicas

1) La temperatura del proceso que afecta a la constante de

equilibrio (pK) de la disolucin tampn por lo que puede
variar su capacidad de tamponamiento.
2) Que los iones del tampn no interfieran en el proceso de
intercambio inico ya que si estos iones llevan carga opuesta
a la de los grupos funcionales
del
intercambiador
inico
intervendrn en el proceso de intercambio
inico y causarn
perturbaciones en el pH.
CONCLUSIN: Utilizar tampones catinicos con intercambiadores
aninicos
y
tampones
aninicos
con
intercambiadores
catinicos

45

Tampones ms usuales en cromatografa de intercambio inico

Intercambiador
inico
Catinico

Aninico

Tampn

pKa

Acetato
Citrato
Fosfato
Hepes

4,75
4,75
7,20
7,55

4,2
4,2
6,7
7,6

5,2
5,2
7,6
8,2

L-Histidina
Imidazol
Trietanolamina
Tris
Dietanolamina

6,15
7,00
7,77
8,16
8,80

5,5
6,6
7,3
7,5
8,4

6,0
7,1
7,7
8,0
8,8

EL PROCESO CROMATOGRFICO

Rango de
tamponamiento

DE INTERCAMBIO INICO

1) Instalacin de la columna: la resina de intercambio inico

se empaqueta en la columna. Los rellenos de las resinas son
polmeros cruzados
de estireno y etilbenceno
a los que se
les ha aadido los grupos funcionales cido (SO3H) o bsico (Todo este conjunto recibe el nombre de matriz de la
NH3OH).
columna o lecho de la columna.
2) Aplicacin de la muestra
reversible de la misma.

producindose la adsorcin

3) Separacin de las sustancias las molculas que poseen una

carga opuesta a la del intercambiador se adsorben, mientras
que las molculas neutras o las que poseen la misma carga que
la del intercambiador se eluyen a lo largo de la columna.
Las sustancias se separan entre s porque poseen diferentes
afinidades por el intercambiador inico,
debido a sus
diferencias de cargas.
La separacin del compuesto de la matriz cargada se puede
realizar cambiando el pH de la disolucin
El intercambio de iones es un proceso instantneo
equilibrio esquematizado en las siguientes reacciones:

en

46

Intercambiador catinico.
R - SO3

.... Na+

H3N+ R

R SO3

.... + NH3 R+

Na+

Intercambiador aninico
R4N+ .... Cl-

- OOC

R4 N

.... OOC

Cl

Separacin de protenas por cromatografa de intercambio inico

47

CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR

Tambin conocida como Cromatografa de Filtracin sobre Gel,
Cromatografa de Permeacin sobre Gel y Cromatografa por
Tamao Molecular o por Tamices Moleculares.
Es un tipo especial de cromatografa
separacin de sustancias que poseen
diferentes.

que se utiliza en la
volmenes
o tamaos

La fase estacionaria, llamada malla molecular,

est formada
por partculas altamente porosas que permiten la separacin de
los componentes de la mezcla en funcin del tamao de las
molculas.
No existen interacciones entre la fase estacionaria
soluto. Se separan por el tamao de la partcula.

el

Las especies ms utilizadas como fase estacionaria se dividen

en dos tipos:
Tipo Inorgnico: como las zeolitas sintticas, por ejemplo los
tamices moleculares de Linde.
Tipo Orgnico: como
geles y biogeles (polmeros orgnicos)
por ejemplo, el Sephadex (polmero cruzado derivado del
dextrano)
Todas estas especies poseen cavidades o poros a travs de los
cuales las molculas pueden pasar o ser retenidas.
MECANISMO DE FILTRACIN SOBRE GEL
La muestra a cromatografiar se aade por la parte superior de
la columna y se procede a su elucin con el disolvente
adecuado.
Las sustancias cuyo tamao molecular es superior al de los
poros del gel no pueden atravesarlo por lo que pasan con el
lquido a travs del lecho emergiendo las primeras en la
columna.
El tamao de estas molculas determina el llamado lmite de
exclusin de tal forma que aquellas molculas que superan
dicho lmite sern las primeras en ser eluidas.
Las molculas ms pequeas penetran en
los poros
quedando
retenidas en su interior y sern las ltimas en ser eluidas.
Las molculas que emergen de la columna
siguen
decreciente respecto a sus pesos moleculares.

un

orden

48

Separacin de protenas mediante cromatografa de exclusin

molecular.

49

BIBLIOGRAFA
"Anlisis Instrumental"
Skoog Leary
Ed. McGraw Hill (1993)

"Cromatografa Lquida de Alta Resolucin"

Adrin Garca de Marina

- Benito del Castillo

Ed. Limusa (1988)

"Determinacin de Estructuras Orgnicas"
Daniel J. Pasto Carl R. Jonson
Ed. Revert (1984)
"Gua de Prcticas de Qumica Orgnica"
Mariana Lpez Snchez Jorge Triana Mndez Mara Esther
Torres Padrn
Ed. Servicio de Reprografa y Encuadernacin Universidad de
Las Palmas de Gran Canaria

(2001)

"Introduccin a la Cromatografa"
David Abboutt R.S Andrews
Ed. Alambra (1983)
" Manual de Cromatografa"
Juan Francisco Loro Ferrer
Coleccin

Textos

Universitarios.

Gobierno

de

Consejera de Educacin - Cultura y Deportes (2001)

Canarias.