Excavacin arqueolgica

Mauricio Cedeo
00126135
Laboratorio de biologa molecular,
Universidad San Francisco de Quito,
Quito, Ecuador
mcedeoq@usfq.edu.ec

Durante una excavacin arqueolgica en el norte de la provincia de Puno en Per, se encontr

una tumba que se cree que pertenece a la cultura Chinchorro, contemporneo a la cultura
Valdivia. En esta tumba se encontraron tres cuerpos momificados, junto con una serie de
artefactos de diferentes materiales. Los arquelogos recolectaron muestras de tejido de las
momias (hueso con mdula, tejido epitelial y muestras de pelo encontradas en el interior de las
momias).
1.
Escoge tres metodologas de biologa molecular qu pensara en aplicar para probar que
las muestras encontradas en la excavacin pertenecen a individuos de la cultura Chinchorro
teniendo acceso a ms momias confirmadas como integrantes de este grupo humano.
Sobre estas metodologas: explica de qu se tratan cada; esto quiere decir explica sus principios,
los principales reactivos que utilizan y su objetivo final.

Extraccin de ADN de huesos

La tcnica de extraccin debe ser un protocolo no toxico, basado en altas concentraciones de

sales
1. Preparacin de la muestra:
Es el inicio de la extraccin del genoma comienza con la obtencin, se realiza una trituracin
del hueso en un mortero, posteriormente se le aadir dos disoluciones EDTA al 2% di sdica
y 5% trisodica, y se deja en agitacin constante por 24h a temperatura, posteriormente se
centrifugo 10min a 3500 r.p.m, recuperamos en el sobrenadante y volver a centrifugar10min a
4500r.p.m; recuperamos el sobrenadante, y procedemos a marcarlo con azul de dextrano como
marcador del frente de elucin. Para posteriormente extrelo (Parcorbo, e.t, n.d)
2. Extraccin del ADN.
Para la extraccin del ADN, realizamos una solucin que consta de protenas K 10ul, acetato
sdico 375ul 2M y SDS 25ul 20% aadiendo la muestra y se incuba a 56 grados centgrados
por una hora, a continuacin aadimos NaCl 6M agitndole energticamente durante 15 s,
centrifugamos a 5000rpm por 15min, aadimos etanol al 100% frio y dejamos que se precipite
durante 3 horas a menos ochenta grados centgrados, de ah centrifugamos nuevamente y
eliminamos el sobrenadante y volvemos a re suspender el ADN con 10ul de TE durante 8 horas.
(Parcorbo, e.t, n.d)
3. Purificacin del ADN obtenido.
Para la purificacin se aade 2.5ul de acetato de sodio 3M, y etanol puro frio y dejamos a -80 oC
varias horas, centrifugamos eliminado el sobrenadante y dejamos secar el sobrante a
temperatura ambiente. Y disolvemos en 10ul de TE. (Parcorbo, e.t, n.d)
4. Cuantificacin del ADN
Para la cuantificacin del ADN extrado se usa comnmente el espectrofotmetro, el cual mide
la longitud de onda que es capaz de absorber el ADN que es de 280nm. (Parcorbo, e.t, n.d).

5. objetivo de la tcnica
La tcnica se realiza por la necesidad de una muestra de ADN que posteriormente ser
secuenciada con el fin de compararles desencintes de la cultura chinchorro, para encontrar los
parecidos genes nicos que se transfieren de familia a familia.

PCR (reaccin en cadena polimerasa)

La cantidad de ADN extrado no suele ser suficiente, porque es necesario la multiplicacin del
ADN para poder realizar los estudios.
El uso del PCR ha abierto la posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas
copias intactas presentes en especmenes de museo y descubrimientos arqueolgicos en los
cuales la mayora de las molculas estn daadas o degradadas, para proceder posteriormente a
su estudio mediante secuenciacin (Rodrguez & Martnez, 2010)
La tcnica molecular PCR la cual usa varios reactivos en los que constan: Reaccin Buffer.
dNTPs, Primers. ADN molde Taq ADN polimerasa y agua.
Taq polimerasa es una ADN polimerasa extrada de la bacteria termfila Thermus aquaticus
que tiene la propiedad de poder replicar ADN a temperaturas altas (Rybick, 2001)
Los Primers o iniciadores: son pequeas secuencias de ADN de 5 -10pb las cuales se unen a
las regiones complementarias de la cadena molde indicando a la Taq polimerasa donde inicie la
amplificacin (Rybick, 2001).
dNTPs: es una mezcla de los 4 nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) que sirve de
sustratos por para sintetizar la nueva cadena de ADN(Rybick, 2001).
Solucin amortiguadora o buffer: es la solucin que permite que el pH sea el adecuado para
que se lleve la reaccin en cadena polimerasa. Brindando las condiciones de pH necesarias
para que se lleve a cabo la reaccin de PCR (Rybick, 2001).
ADN molde: es el electo ms importante de la reaccin en cadena polimerasa pues es de este
ADN el que va ser amplificado (Rybick, 2001).
El PCR consta de 3 ciclos:
Desnaturalizacin: las dos hebras del ADN molde se separan. Causado por el calentamiento
(94-95 C) de la muestra. En donde el aumento de la temperatura de las desnaturalizacin es
proporcional a la cantidad de G+C tenga la cadena (Rybick, 2001).
Hibridacin: es la etapa donde los iniciadores se unen a la cadena molde de forma
complementaria lo que ocurre entre los 45-60C. Siendo la especificidad de unin proporcional
a la temperatura (Rybick, 2001).
Sntesis o elongacin de la nueva cadena de ADN: es esta fase la Taq Polimerasa aade los
nucletidos partiendo del extremo libre 3-OH del iniciador, basndose en la
complementariedad de bases. Lo que ocurre entre los 70-72C (Rybick, 2001).

Secuenciacin del genoma.

Esto se realizara basndose en la secuenciacin automtica que emplea un mtodo enzimtico y

consiste en marcar el cebador o los terminadores con un compuesto fluorescente y activar la
reaccin de secuencia. Los productos de la reaccin se detectan directamente durante la
electroforesis al pasar por delante de un lser que al excitar los fluorforos permite detectar la
fluorescencia emitida (Rodrguez, Concepcin & Martnez)
2.
Explica cmo utilizara las muestras obtenidas de hueso y pelo, encontrados en la tumba
de Puno, para su anlisis con las distintas metodologas que escogiste. Adems de las muestras
obtenidas en la tumba, qu otras muestras requieren los antroplogos forenses para determinar
su proveniencia de forma adecuada?
El uso del ADN extrado se lo replicara por medio del PCR, el cual posteriormente ser
secuenciado para la posterior comparacin del ese Genoma con humanos desencintes de la
cultura chinchorro, por lo que es necesario tambin la extraccin del ADN de los desencintes
con su respectiva secuenciacin.
Los paleontlogos usan a los marcadores moleculares en estudios evolutivos y poblacionales.
Para tener la seguridad de que la proveniencia de ese esqueleto sea la adecuada los
paleontlogos determinan la edad anagrfica, siendo el esqueleto un sistema dinmico por lo
que sus clulas se desarrollan, crecen y se degeneran, reflejndose en ellos el paso del tiempo.
La estimacin de la edad anagrfica o edad de la muerte, es uno de los aspectos ms importantes
-junto con el sexo y la estatura- de todo estudio antropolgico. Los mtodos para determinar la
edad de la muerte varan segn el grupo de edad que se trate (Reverte Coma, 1999). Sin
embargo, pueden dividirse en criterios de formacin y criterios de degeneracin (Burns, 1999).
Siempre que sea posible hay que intentar combinar ms de combinar ms de un mtodo puesto
que la estimacin de la edad de la muerte de un esqueleto es un rango ms o menos amplio
dependiendo del estado de conservacin del mismo. Conocer el momento aproximado en el que
los huesos comienzan su estado defusin es bsico para llegar a determinar, con mayor o menor
exactitud, la edad de un individuo en su etapa de adolescencia. Por ello, es tambin importante
saber que los centros de osificacin se clasifican en tres: los centros de osificacin primarios o
diafisarios, los secundarios o epifisarios y los conocidos como grmenes dentarios que sern los
que posteriormente conformen los dientes, tanto decdales como permanentes. A continuacin
mostramos una tabla con los principales centros de osificacin segn reflejan los antroplogos
(Krogman e Isan, 1986)
Extraccin de ADN mitocondrial
EL ADN mitocondrial es nico, el cual es trasmitido directamente por la madre de generacin
en generacin por lo que la tasa de mutacin es poca o escasa lo que hace al ADN mitocondrial
una herramienta primordial para determinar la procedencia de los genes a estudiar, la
extraccin del ADN mitocondrial se realiza por diversos protocolos loa cuales son similares a
los protocolos de la extraccin de ADN genmico, en donde la diferencia radica de donde se
saca la muestra. Y se realizada de la siguiente manera

Con un homogeneizador de aspas se homogeneiza el tejido en dos volmenes de

TEK (Tris-HCl 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM y KCl al 1.5%).
Subyaciendo a la muestra agregue lentamente un volumen de TEK-15% sacarosa.
Centrifugue (1,500 x g por 10 min. a 4C) y obtenga el sobrenadante.
Repita el paso 2 y 3.
Centrifugue a 18,000 x g durante 1 hora a 4 C. Elimine el sobrenadante. .
Resuspenda el precipitado con 10 ml de TEK y repita la centrifugacin por 30
minutos.
En caso de que el sobrenadante este turbio o con pigmentos, repita el paso 6.

Resuspenda el precipitado con TEK (0.9 ml por cada 5 gr. de tejido inicial).
Agregue Igepal al 10% (en TEK), para obtener una concentracin final en la
muestra de Igepal al 1%.
Agite suavemente por 15 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos a 4 C y recoja el sobrenadante.
Agregue 1 volumen de fenol equilibrado (pH 8.0) y agite suavemente durante 5
minutos.
Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos y recoja la fase acuosa. Se recomienda ser
muy cuidadoso, para evitar tomar partculas de la interface.
Repita los pasos 12 y 13.
Agregue un volumen de fenol-cloroformo-alcohol isoamlico (v:v:v 25:24:1) y agite
suavemente unos segundos.
Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos. Recoja el sobrenadante.
Agregue un volumen de cloroformo-alcohol isoamlico (v:v 24:1) y agite
suavemente unos segundos.
Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos y recoja el sobrenadante.
Agregue un octavo del volumen de acetato de sodio 3 M (pH 4.8).
20 Agregue dos volmenes de alcohol etlico absoluto a -20C.
Guardar la muestra en congelador (-20C) y esperar una noche.
Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos y tire con cuidado el sobrenadante.
Agregue dos volmenes de alcohol etlico al 70% a -20C (volumen equivalente al
del paso 20).
Centrifugue a 12,000 x g por 10 minutos y tire con cuidado el sobrenadante.
Seque el precipitado a 37C.
Re suspenda en 200 l (por cada 5 gr. de tejido inicial) de amortiguador TE- RNasa
(solucin 10x = Acetato de sodio 1M pH 4.8; EDTA 0.05M pH 4.8; RNasa A 0.1 gr.
por cada 10 ml; se almacena a -20C). (Raya, e.t, n.d)

Huella gentica
El anlisis de ADN se basa en que es muy poco probable que dos seres humanos tengan la
misma cantidad de microsatlites, es decir de repeticiones de unos pocos pares de bases
nitrogenadas, en un mismo loci. Para encontrar marcadores verdaderamente individuales hay
que estudiar las secuencias que no codifican protenas y que no parecen desempear una
funcin relevante. Se usan sobre todo las secuencias que se llaman minisatlites, que consisten
en numerosas repeticiones de cadenas cortas de nucletidos. Estas secuencias cambian
rpidamente por mutacin y recombinacin y generan los complejos patrones que identifican a
cada persona. (Umaa & Montaa, n.d)
La primera tcnica de marcadores moleculares es la RFLP, que viene de la sigla en ingls que
significa Variacin en la Longitud de los Fragmentos de Restriccin. Esta tcnica se basa en las
enzimas de restriccin. Las enzimas de restriccin separan la cadena de ADN en fragmentos de
diferente tamao dependiendo del nmero de veces que aparezca la secuencia de
reconocimiento de la enzima en la cadena. La enzima digiere la molcula y la rompe en pedazos
segn la repeticin en tndem de los nucletidos que especifican la enzima. Los fragmentos ms
grandes, cargados positivamente, van a la parte superior del tubo de ensayo; los fragmentos ms
pequeos y con carga negativa se queda abajo. En esta tcnica se usan qumicos radiactivos que
muestran los nucletidos. Cuando en el tubo estn los fragmentos separados, se agrega una
polimerasa y esta se activa por calor. La enzima empieza a agregar nucletidos libres que
forman una sonda radiactiva. Cada vez que la muestra tenga Guanina o Citosina se volver
radiactiva. (Umaa & Montaa, n.d)

3.
Tras el posterior anlisis de las muestras, los arquelogos determinan que una de las
muestras no parecen corresponder a una momia cercanamente emparentada a las otras dos. Para
ejemplificar estos resultados dibuja para cada una de las metodologas una figura que indique de
forma clara los resultados que el antroplogo forense obtuvo

Extracion del ADN del hueso.

Secuenciacin del genoma de
parientes cercanos

protocolos de extracin
determinacion de calidad de
muestra de extracin por
espectrometria.

fSecuenciacion del genoma por

medios bioinformaticos
Extracin de ADN mitocondrial.

amplificacion del ADN extraido

por PCR
protocolos de extracin de
ADN mitocondrial.

Comparacion de los
microsatelites, hereditarios,.
COmpararacion de Genoma
secuencia mitocondrial de la
muestra de ADN y de lo
parientes cercano.

Uso de electroforesis,
comparando los microsatelites
heridatorios de generacin.
comparacion mediante
progrmas infomaticos los
genomas secuecniados del
ADN mitocondrial.

separacion de los genosmas

mitocondrila detemrinando la
igualdad del genoma con los
desendientes.

Mediante las comparaciones

realizadas en los pasos
anterios se elimina a las
muestras en donde el ADN
mitocondrial no es similar

4.
El anlisis de las muestras de pelo tomadas del interior de las momias revel que stas no
son de pelo humano, sino de alguna otra especie. En base a esto, se decide secuenciar un gen a
partir de esta muestra. Cmo utilizara esta secuencia para determinar la especie a la que
pertenece el pelo? Menciona una tcnica de secuencia miento que podra utilizarse para estas
muestras, y una metodologa utilizando herramientas bioinformticas para descubrir el origen de
las secuencias encontradas.
Comparando con los genomas que estn en el banco genmico mundial
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ , el cual comparara las similitudes del genoma con los genomas
existentes, pudiendo obtener informacin de ancestro pasados.
Otra tcnica seria el uso de la secuenciacin de ADN empleando microrrays, en los cuales
miraremos con que genoma reacciona de mejor manera el ADN extrado del pelo. Teniendo
como caractersticas principales:

A los cientficos para llevar a cabo un experimento en miles de genes al mismo tiempo.
Cada punto en un microrrays contiene mltiples hebras idnticas de ADN.
La secuencia de ADN en cada lugar es nico.

Cada punto representa un gen.

Miles de puntos estn dispuestos en filas y columnas ordenadas en una superficie slida
(por lo general vidrio).
La ubicacin exacta y la secuencia de cada punto se registran en una base de datos
informtica.

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