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AGUSTIN
NACIONAL DE SAN
ESCUELA
QUIMICA
PROFECIONAL DE
TEMA:
PROFESORA:
JUANITA
INTEGRANTES:
INTRODUCCIN
Las primeras separaciones, con resultados positivos, por medio de
mtodos cromatogrfi- cos fueron llevadas a cabo por Tswett en el ao
1.906; este botnico ruso consigui separar algunos pigmentos coloreados
de hojas de plantas utilizando una columna de almina.
El desarrollo total de estas tcnicas se produjo, no obstante, a partir
del ao 1931, en que Kuhn y Lederer comenzaron a utilizarlas de
manera sistemtica. La cromatografa de lquidos (CL) sufri un relativo
estancamiento a partir del ao 1952 en que Martin y James impulsaron
el desarrollo de la cromatografa de gases (CG), que acapar los esfuerzos
tericos encaminados al conocimiento profundo de la cromatografa. No
obstante, las limitaciones de la CG en cuanto al tipo de muestras
analizables (voltiles o derivados voltiles de las mismas), origin, en
la segunda dcada de los sesenta, una vuelta a considerar la CL cuyas
limitaciones, en este sentido, se reducen a la posibilidad de disolver la
muestra, lo que le confiere un rango mucho ms amplio de aplicacin.
Este hecho, junto con la aparicin de fases estacionarias con dimetros de
partcula mucho menores que los utilizados hasta entonces (3 a 25 :m),
que permiten obtener columnas de mayor eficacia, llev a una
utilizacin cada vez ms extensa de este tipo de cromatografa.
La experiencia acumulada en el desarrollo de la CG permiti tambin
aplicar nuevos puntos de vista a la CL, para la que pronto se disearon
sistemas de inyeccin, circulacin del eluyente y deteccin, de eficacia
comparable a la de los utilizados en CG, dando lugar a la moderna tcnica
de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC)
FUNDAMENTO
La cromatografa lquida de alta eficacia o high performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada
frecuentemente en bioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina
a veces cromatografa lquida de alta presin o cromatografa lquida de
alta resolucin (high pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta
terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en
diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y
la columna cromatogrfica
La cromatografa lquida (HPLC), es una tcnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase mvil. La fase estacionaria es slica .La fase mvil
acta de portador de la muestra. La muestra en solucin es inyectada en la
fase mvil. Los componentes de la solucin emigran de acuerdo a las
interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas
interacciones qumicas, determinan la separacin de los contenidos en la
muestra. La utilizacin de los diferentes detectores depender de la
naturaleza de los compuestos a determinar.
APLICACIONES
Esta tcnica est indicada para la separacin de compuestos orgnicos
semivlatiles. Hidrocarburos Poliaromticos (PAHs), Aminocidos: OTA,
cido Flico, Herbicidas, Vitaminas, Acido tenuazonico, Formaldehdoetc.
Rango de trabajo para muestras lquidas: g L-1 - mg L-1 Rango de trabajo
para muestras slidas: g Kg-1 - g g-1
1. EL PROCESO CROMATOGRFICO
La cromatografa lquida de alta eficacia se encuadra dentro de la
cromatografa de elucin. En sta, un lquido (fase mvil) circula en ntimo
contacto con un slido u otro lquido inmiscible (fase estacionaria); al
introducir una mezcla de substancias (analitos) en la corriente de fase
mvil, cada analito avanzar a lo largo del sistema con una velocidad
diferente que depender de su afinidad por cada una de las fases. Esto
supone que despus de terminado el recorrido de la muestra por la
columna, cada una de las substancias introducidas en el sistema eluir con
un tiempo diferente, es decir, estarn separadas.
2. CLASIFICACION DE HPLC
Los diferentes tipos de cromatografa lquida se pueden clasificar de
diferentes maneras, pero la forma ms habitual de clasificacin es la
realizada en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya que es sta la
que impone fundamentalmente el mecanismo de separacin; de este
modo, se pueden enumerar cuatro tipos de tcnicas:
2.1
de
reparto/adsorcin
(fases
ligadas
Resinas de poliestireno
anion-exchange
chromatography
of
carbohydrates
and
oligosaccharides, etc.
INSTRUMENTACIN
Si bien es cierto que para realizar una cromatografa lquida tan solo
es necesario disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la
columna, la moderna cromatografa de lquidos de alta eficacia, debido al
pequeo dimetro de las partculas de fase estacionaria que se utilizan,
requiere de la utilizacin de unos dispositivos que constituyen el
cromatgrafo.
Los componentes bsicos de un cromatgrafo de lquidos son:
.- Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de
mezclado de eluyentes).
.- Dispositivo de inyeccin.
.- Conducciones y conexiones.
.- Detector y registrador.
.- Columna.
Los componentes bsicos de un cromatgrafo se muestran en la
figura 1.
bombeo
ideal
debe
cumplir
las
siguientes
Tipos de bombas
Una primera clasificacin de las bombas utilizadas en CLAE, se
puede realizar atendiendo a la fuerza motriz, as se tendrn:
Bombas
amplificadoras de aire.
- Bombas
de
motor
elctrico.
(A)
(B)
(A)
(B)
- El mecanismo de transmisin.
- La cabeza de bomba.
cromatografa
de
lquidos,
es
posible
trabajar
en
dos
de alta precisin y, adems, se necesita una bomba para cada uno de los
disolventes a mezclar. Como ventajas, se pueden sealar una buena
reproducibilidad de las mezclas, una rpida respuesta en los cambios de
concentracin y, adems, la posibilidad de utilizar cada una de las bombas
por separado para trabajar con sistemas isocrticos independien- tes.
Sistemas de inyeccin
El mtodo de introduccin de la muestra en CLAE, es de importancia
capital,
pues
un
mal
sistema
de
inyeccin
puede
dar
lugar
Inyectores de jeringa
En este tipo de inyectores, la introduccin de la muestra en la
columna se realiza por medio de una jeringa cuya aguja entra en el
sistema cromatogrfico a travs de una membrana ("septum"), lo que
permite depositar la muestra en la cabeza de la columna (figura 7).
Las ventajas de este tipo de inyector, radican en su facilidad de
construccin y en que permiten sacar todo el partido a la eficacia ofrecida
por la columna; por el contrario, son inyectores que presentan una gran
falta de reproducibilidad, tienen una presin de trabajo limitada y son de
gran dificultad de manejo.
Inyectores de vlvula
Este sistema de inyeccin consiste en una vlvula de seis vas, dos
de las cuales estn conectadas entre s por medio de una espira ("loop").
Esta espira es un tubo de volumen conocido, cuya misin es la de
contener la muestra antes de efectuarse la inyeccin.
Conducciones y conexiones
Como ya es conocido, la presencia de volmenes muertos es uno de
los grandes problemas de los equipos de cromatografa de lquidos, ya que
stos dan origen a prdidas en la eficacia del sistema y, por lo tanto, en la
capacidad de separacin. En particular, todas las conducciones y
conexiones entre inyector y columna, y entre columna y detector son de la
mxima importancia.
El tubo de conduccin puede considerarse como un volumen muerto
del sistema y, por lo tanto, es de vital importancia la utilizacin para esta
finalidad de tubos capilares en los que el dimetro interno sea pequeo y
evitar al mximo posible la utilizacin de grandes longitudes de tubo de
conexin; de este modo, se consigue reducir en la medida de lo posible el
Longitud
tubo (cm)
0.125
128
0.25
del
0.5
0.5
dos
tipos
de
el
dime-
tro
de
la
las
reducciones
En
ambos
casos,
es
Detectores
Un detector para cromatografa es un dispositivo que permite medir,
a la salida de la columna, una propiedad fsica del eluyente, que deber
depender de la composicin de ste. La deteccin en cromatografa se
realiza, habitualmente, en continuo, aunque es posible la utilizacin de
colectores de fracciones para la identificacin y cuantificacin de
pequeas fracciones del eluyente.
Las caractersticas
principalmente:
de
un
detector
para
cromatografa,
son
Es
la
seal
determinada
ofrecida
variacin
por
de
el
la
detector
ante
una
propiedad
fsica
del
Ruido.-
Deriva.-
Sensibilidad.-
La
sensibilidad
se
define
como
la
mnima
entre
de
la
columna.
El
valor
mnimo,
se
del
sistema.
Para
anlisis
Tipos de refractmetros
En la actualidad se suelen utilizar dos tipos bsicos de detectores de
ndice de refraccin. Ambos requieren el uso de una cubeta de doble paso,
en la que el lado que contiene la muestra se compara constantemente con
el lado de referencia que contiene fase mvil.
a)Detector de desviacin
En la figura 13, se presenta un esquema de la parte ptica del
detector de desviacin, que obedece a la ley de Snell. Este detector utiliza
el principio de la desviacin; en l se mide la desviacin de un haz
luminoso al variar la composicin del lado de la muestra en relacin con la
del lado de referencia a medida que eluye la muestra a travs del detector.
Cuando no hay muestra presente, la luz que pasa a travs de ambas
partes de la cubeta se enfoca en la fotoclula; a medida que eluye la
muestra, vara el ngulo de refraccin, por lo que el haz luminoso se
desva. Esto se traduce en un cambio en la intensidad de luz que llega la
fotoclula, siendo registrada la intensidad del cambio, que puede
relacionarse con la concentracin de la muestra.
Detectores de ultravioleta/visible
Fundamentos
Cuando se hace pasar una radiacin electromagntica a travs de
compuestos que presentan determinados grupos funcionales, stos
experimentan una excitacin electrnica a causa de la absorcin de
energa, a una longitud de onda que ser especfica para cada grupo
funcional. Esta energa, provoca el paso de un electrn desde el estado
fundamental hasta un nivel de energa superior. La absorcin de energa,
CROMFO
RO
LONGITUD
ONDA
(nm)
Amina
Insaturacin
aliftica
-NH2
-C=C-
195
190
2800
8000
-(C=C)2-
210-230
Insaturacin
aliciclica
Benceno
-(C=C)2-
230-260
2100
06000
202
6900
246
2000
0
Bifenilo
DE
DE
Quinoleina
270
314
3600
2750
Antraceno
252
375
19900
07900
un
registro
automtico
de
todo
el
espectro,
parando
recogidas
simultneamente
todas
las
longitudes
de
onda
supuesto,
debe
tenerse
en
cuenta
que
este
tipo
de
destacarse
tambin
que
la
tcnica
de
deteccin
mediante
menos
sensible
convencional.
Detectores de fluorescencia.
que
la
deteccin
por
ultravioleta
Fundamentos
El fenmeno de fluorescencia tiene lugar cuando compuestos que
poseen determinados grupos funcionales especficos, se excitan con la
energa de ciertas longitudes de onda y emiten
DE
LONGITUD
ONDA
(nm)
COMPUESTO
EXCITACIN
EMISIN
Benceno
270
310
Tolueno
270
320
Clorobenceno
275
345
Fenol
285
365
Anilina
210
405
Acido benzoico
310
390
Benzonitrilo
280
360
DE
En
la
sensibilidad,
deteccin
tambin
por
fluorescencia,
aumenta
la
adems
especificidad.
de
Los
aumentar
detectores
la
de
tanto
utilizados
para
la
deteccin
por
(A) Cloruro de dansilo. (B) Cloruro de 5-di-nbutilaminonaftaleno-1- sulfonilo. (C) p-clorosulfofenil-3fenilindona. (D) 4-cloro-7-nitrobenzo -1,2,5- oxadiazol.
(E) isitiocianato de fluorescena. (F) isocianato de
acridina. (G) p- dimetilaminocianoaldehido. (H) Piridoxal.
(I) o-ftaldialdehido. (J) Fluorescamica.
Detectores electroqumicos.
Fundamentos
Este tipo de detectores, estn basados en la oxidacin del analito
eludo mediante un electrodo adecuado, registrndose la intensidad de la
corriente, mantenida mediante la electrolisis de los analitos, a lo largo del
cromatograma. La deteccin en este caso est basada en el conocido
polargrafo de gota de mercurio; este instrumento consta de un par de
electrodos a los que se aplica un potencial de oxidacin (potencial de
semionda) suficiente para crear una corriente de difusin. Puesto que la
cantidad de corriente es una medida directa de la concentracin de analito
en un momento dado, el proceso es cuantitativo.
Para poder aplicar esta tcnica a la deteccin en cromatografa
lquida, se han desarrollado nuevos materiales para los electrodos y se han
diseado cubetas de electrolisis de escaso volumen y con geometras muy
eficaces. Como electrodos de medida, se utilizan los de pasta de carbn,
carbn pulimentado y amalgama de oro y mercurio, normalmente con un
contraelectrodo de plata-cloruro de plata. El esquema de la clula de un
detector electroqumico se muestra en la figura 19.
Figura
19.Clula
amperomtrico
de
flujo
de
un
detector
LA COLUMNA
La columna es el elemento fundamental de un cromatgrafo de
lquidos, puesto que es en ella donde tiene lugar la separacin; por lo
tanto, resulta fundamental una correcta eleccin de la columna adecuada
para cada separacin, ya que con una columna inadecuada o de mala
calidad se nunca se obtendrn buenos resultados aunque se disponga del
mejor instrumental.
Las partes de que se compone
una columna de cromatografa lquida
se muestran en la figura
21. Las columnas ms utilizadas en
cromatografa de lquidos son las de
relleno; estas columnas consisten en
un
tubo,
relleno
generalmente
de
una
fase
de
acero,
estacionaria
vara
entre
60
mm
semipreparativa,
su
en
el
mercado
columnas
de
de
acoplar
otras
(fundamentalmente
la
cromatografa
tcnicas
analticas
espectrometra
de
del
tubo,
por
lo
que se hace
de
una
Dimetro de la columna
La eleccin del dimetro interno de la columna se realiza en
funcin de la cantidad de muestra a separar. Para las separaciones a
escala analtica (algunos microgramos de muestra por inyeccin) se
suelen usar columnas de pequeos dimetros (1 a 6 mm) mientras que
en los trabajos a escala preparativa se superan los 10 mm de dimetro
interno. Esta seleccin de dimetros se debe a la prdida de eficacia,
por sobrecarga de la columna, cuando se inyecta una masa excesiva
de solutos a separar. Se ha comprobado empricamente que en fase
normal, la sobrecarga comienza a partir de 50 :g de muestra por gramo
de relleno, mientras que en fase reversa es necesario sobrepasar los 100
:g/gr de relleno; parece lgico, por tanto, pensar que mayores dimetros
Longitud de la columna
Como se puede comprobar en las ecuaciones que rigen los procesos
cromatogrficos, la eficacia de la columna depende, entre otros factores,
de la longitud de la columna y, a igualdad de otros parmetros, mayores
longitudes de la columna permitirn obtener mayores eficacias.
Por otra parte, debe tenerse en cuenta que, a mayor longitud de la
columna, la presin en cabeza se eleva considerablemente, por lo que hay
que alcanzar un compromiso, a la hora
de
Conexiones
En los extremos de la columna se montan los sistemas de conexin
para poderlas unir al detector y a los sistemas de inyeccin y bombeo de
eluyentes. La conexin, en este caso, es realmente una unin reductora de
compresin radial, que permite una perfecta unin del tubo de la columna
con el capilar que la conecta a los restantes dispositivos del cromatgrafo.
Estas uniones no deben presentar volumen muerto, deben permitir el paso
de secciones anchas de tubo a capilares, y deben ser fcilmente
montables y desmontables.
Por otra parte, y como cierre del tubo que contiene el relleno se
colocan los llamados fritados, que son mallas con un tamao de poro
inferior al dimetro de la partcula de relleno; de esta forma, se deja pasar
al eluyente evitando que el relleno se salga de la columna.
Relleno
Todas las separaciones cromatogrficas tienen lugar sobre la fase
estacionaria. Las fases estacionarias en cromatografa de lquidos, estn
constituidas
generalmente
por
partculas
de
materiales
rgidos
la
superficie
de
la
slice
(grupos
silanol)
son
los
responsables de la separacin.
-
Superficie
especfica.
170 m2/g
LiChrosorb
Porasil
350 m2/g
Spherisorb
190 m2/g
2
Zorbax BPSil
300 m /g
Pecosphere
300 m2/g
p
H
9
,7
por
11,5
nm
11,1
nm
10.0
nm
8,1
nm
5,6
nm
8
nm
.
7
.
9
.
3
.
Tipo
de
partcula
esfrica
irregular
irregular
esfrica
esfrica
esfrica
Tamao de partcula
El tamao de partcula juega un papel importantsimo en la calidad y
eficacia de la columna. Como se puede ver en la ecuacin de Van
Deemter, la altura equivalente de plato terico es funcin del dimetro de
la partcula de relleno:
tanto, las columnas preparadas con ellas presentan una gran capacidad de
carga (admiten gran cantidad de muestra) pero, como contrapartida, dan
lugar a un gran ensanchamiento de la banda cromatogrfica ya que
influyen significativamente sobre los trminos de transferencia de masa de
la ecuacin de Van Deemter (figura 22).
Como solucin parcial a este problema, se comenzaron a utilizar los
recubrimientos de
estas
partculas
por
capas
de
fase
estacionaria
(adsorbente
(ecuacin
de
Knox),
permitiendo
este
tipo
de
partculas
lograr
de
cambio
catinico. Cromatografa de
cambio aninico.
- Tamao molecular.
(CEM).
Cromatografa de adsorcin
Fundamentalmente, se tiene este mecanismo de separacin cuando
la fase estacionaria es un slido, con una superficie que contiene grupos
funcionales cuyas caractersticas les permiten interaccionar con los
compuestos a separar y con la fase mvil. La cromatografa slido-lquido
se fundamenta en este mecanismo y los slidos utilizados habitualmente
como fase estacionaria son almina o slice. Este tipo de cromatografa es
el ms antiguo de todos (es el usado por Tswett en 1903).
El soluto.
La fase estacionaria
La fases estacionarias ms utilizadas en cromatografa de adsorcin
son la slice y la
La fase mvil
La fase mvil juega un papel principal en la cromatografa lquida, ya
que es la variable del sistema que permite mayor variacin y que, por otra
parte, permite efectuar los pequeos retoques necesarios para lograr una
perfecta separacin.
En cromatografa de adsorcin, se utilizan como fase mvil
disolventes orgnicos de polaridad baja o media (la polaridad est en
relacin directa con la fuerza eluotrpica ,o), pudindose utilizar un
se
le
denomina
modificador,
suele
ir
en
pequeas
de
lquidos
ha
experimentado
un
gran
desarrollo.
GRUPO FUNCIONAL
FASE
NORMAL
AMINO
-NH2
CIANO
-CN
DIOL
Si-O-CH2-CH(OH)-
Si-CH2-(CH2)6-
CH3 OCTADECILSILILOSi-CH2-(CH2)16FASE
REVERSA
CH3
FENILSILILO
Si-C6H4-OH
estacionaria.
Esta
tcnica
recibe
el
nombre
de
S
S
S
S
S
La fase estacionaria
Como en el caso de la cromatografa lquido-slido, la naturaleza de
la fase estacionaria influye en la selectividad del sistema cromatogrfico.
En la cromatografa de fases ligadas, la polaridad de la fase estacionaria
puede ser seleccionada entre una mayor variedad, atendiendo al grupo
funcional que se liga qumicamente al soporte (Tabla V), cadenas cortas
(C-8), cadenas largas (C-18) u otros grupos funcionales.
Si bien es cierto que con las fases ligadas se dispone de ms
versatilidad en la eleccin de fases estacionarias, las ms habitualmente
utilizadas son:
- Cadenas hidrocarbonadas de 18 carbonos para fase inversa.
- Cadenas con extremos amino para fase normal.
Al igual que en cromatografa slido-lquido, la cantidad de grupos
activos y la distribucin de stos sobre la superficie del soporte
condicionan la calidad de la fase estacionaria. Para las fases ligadas,
existen varios parmetros indicativos de la cantidad de grupos activos: la
concentracin superficial, el grado de conversin de silanoles y el
porcentaje de carbono total relativo a la superficie especifica. En todos los
casos no son valores que permitan comparar fases estacionarias
La fase mvil
La fase mvil para cromatografa de fase normal recibe las mismas
consideraciones que
b)
c)
d)
e)
f)
con
la
que
se
alcanzan
los
equilibrios
en
el
sistema
para
realizar
separaciones
mediante
la
tcnica
de
La fase estacionaria
Las fases estacionaras para intercambio inico pueden clasificarse,
segn la carga del grupo funcional, en intercambiadoras de aniones o de
cationes. Los rellenos ms habitualmente usados en cromatografa inica
estn constituidos por copolmeros de estireno/divinilbenceno sobre los
que se ligan los grupos funcionales cambiadores. Tambin se encuentran
con cierta frecuencia otros copolmeros como base de las fases de cambio
inico (polimetacrilato y poliacrilato con divinilbenceno), pero en la
actualidad estn tomando mucho auge los cambiadores de iones basados
en soportes rgidos, como es el caso de las slices de estructura controlada
contra, la slice ofrece una gran resistencia mecnica, una alta uniformidad
en los tamaos de partculas y la posibilidad de utilizar partculas mas
pequeas, lo que la hace ms apta para el trabajo en cromatografa de
alta eficacia.
Los intercambiadores de cationes contienen grupos de cido
sulfnico (cambiadores de cationes fuertes) o bien de cido carboxlico
(cambiadores de cationes dbiles), en tanto que los cambiadores de
aniones contienen grupos amonio cuaternario (cambiadores fuertes) o
grupos amino (cambiadores dbiles).
RESINA BASE
POLIMERICA
INICO
dp (:m)
7 - 12
Forma
esfrica
SLICE DE INTERCAMBIO
5 - 12
esfrica-irregular
0,5 - 2
buena
excelente
muy grande
grande
Resistencia mecnica
pequea
Acceso de molculas grandes
excelente
a
los
grupos
funcionales
difcil
fcil
Rango de Ph
0 - 14
2-9
Velocidad de recuperacin
lenta
moderada
La fase mvil
De nuevo la fase mvil juega el papel principal en la retencin del
soluto ya que, en este caso, permite controlar los equilibrios entre soluto,
contraion y fase estacionaria. La fase mvil debe contener los contraiones
de los componentes
de
la muestra; en estos
casos, es
grande
como
para
posibilitar
que
se
produzcan
el
la
incorporacin
de
los
copolmeros
de
estireno
y qumica
frente a disolventes
orgnicos,
ha permitido
La fase estacionaria
La fase estacionaria en la cromatografa de exclusin es de la mayor
importancia, pues es en ella donde radica totalmente la capacidad de
separacin ya que en este tipo de cromatogra- fa la fase mvil, que es un
simple vehculo para los solutos, no tiene en absoluto ninguna influencia
sobre la separacin.
Las caractersticas que debe cumplir la fase estacionaria de
cromatografa de exclusin
son:
-
columnas
para
cromatografa
de
exclusin
RELLENO
TSK-10
PORO
(A)
-
P.
M.
(DALTON)
< 1.000
TSK-20
50
< 5.000
TSK-30
200
TSK-40
500
TSK-50
1.000
1.000
20.000
2.000
300.000
4.000
800.000
P.
(DALTON)
M.
< 2.000
a
a
a
1.000
100.000
10.000
6
a
a
1,5 10
>1.500.00
0
La fase mvil
La fase mvil realiza en este caso un mero papel de transportador,
ya que no acta directamente sobre el mecanismo de la separacin.
La fase mvil utilizada para este tipo de cromatografa, debe reunir
las siguientes caractersticas:
- Debe solubilizar perfectamente a la muestra.
- No debe disolver la fase estacionaria.
- No debe interaccionar ni con la muestra ni
con la fase estacionaria.
Por supuesto, muchos disolventes cumplen estas caractersticas y
pueden utilizarse como fase mvil, pero siempre hay que tener en cuenta
las especificaciones del fabricante de la fase estacionaria, ya que los geles
de polmeros biolgicos y los de polmeros orgnicos pueden modificar su
tamao de poro por accin del disolvente, variando en consecuencia la
calibracin de la columna.
En ocasiones, se pueden presentar junto con el mecanismo de
exclusin otros fenmenos de separacin diferentes. Para asegurarse de
que no se dan otros mecanismos (fundamentalmente adsorciones), se
eluye un compuesto de pequeo tamao (generalmente benceno, a no ser
que el lmite inferior de exclusin sea menor), en las mismas condiciones
cromatogrficas con las que se va a trabajar; como esta molcula pequea
pasa a travs de todos los poros de la columna, ser tambin la que ms
tarde en salir de la columna; en el cromatograma de la muestra real,
ningn compuesto puede salir ms tarde que el pico de sta molcula, y
de suceder, este hecho indicara la superposicin de ms de un
mecanismo de separacin.