Microorganismos extremfilos

Dr. J.V. Sinisterra

Biotransformations Group
Faculty of Pharmacy
Universidad Complutense
www.biotransformaciones.com

Tabla 1

Tipos de microorganismos extremfilos

AMBIENTE

COMPORTAMIENTO

PARMETRO

EJEMPLO ORGANISMO

Temperatura

Hipertermfilo
Termfilo
Psicrfilo

Crecimiento > 80C

Crecimiento 60-80C
Crecimiento < 15C

Pyrolobus fumarii (113C)

Synechoccus lividis
Psychrobacteria (algunos
insectos)

Radiacin

Atomfilos

Superior a 6000 rad/hr; 15 Mrad

tot.

Deinococcus radiodurans

Presin

Barfilos

Por encima de los gigapascals

Sh. Oneidensis, E. coli

Sequedad

Xerfilos

Ausencia de agua

Artemia salina, hongos, etc

Salinidad

Halfilos

2-5 M NaCl

Halobacteriaceae, D. salina

pH
(Acidez/alcalinidad)

Alcalfilos
Acidfilos

pH > 9
pH < 0

Natronbacterium, B. Firmus
Cyanadium caldarium (pH 0)

Presin de oxgeno

Anaerobio
Microaerfilos

No tolera O2
Tolera bajas [O2]

Methanococcus jannaschii
Clostridium

Extremos qumicos

Gases
Metales

Atmosfera pura de CO2

Elevadas concentraciones de
metales

Cyanidium caldarium
Ferroplasmic acidarmanus

BIODIVERSIDAD
Reino

Especias
Estimadas

Virus

13 x 104 - 13 x 106

Especies
Conocidas
%
1995
Conocido
5 x 103

0,04

500

??

4,8 x 103

0,12

1,5 x 106

69 x 103

Algas

6 x 104

4 x 104

67

Total

1,9 x 107

1,2 x 105

0,65

Archea
Bacteria
Hongos

??
4 x 104 - 4 x 106

BIODIVERSIDAD
Biotopo

% Microorganismos
cultivables

Agua Marina

0,001 0,1

Agua Dulce

0,25

Lagos Mesotrpicos

0,1 1

Aguas de Estuario

0,1 15

Sedimentos

0,25

Suelo

0,30

Lodos Activos

1 15

Arqueas (Archaea)
Microorganismos primitivos cuyas biomoleculas, enzimas y
mecanismo metablicos son diferentes de los de otros
microorganismos
Suelen estar adaptadas a vivir en condiciones extremas
de T, pH, salinidad etc
Hipertermfilos
Halfilos
Metanogncios

Diferencias con los organismos mesfilos

1) No tienen triglicridos en las membranas sino polieters
formados por uniones de glicerol y unidades de isopreno
O
O
OH

O
O
O

O
O
O

2) Microorganiosmo acidfilos
Sulfolobus sp.

Paredes celulares con

pseudo-peptidoglicanos de
NAG beta-1-3 y NAT beta 1,3resistentes a la lisozima
bacteriana

O
O
OH

HO
O
O

HO

OH

2)Metabolismo especial

HOH
HO
HO

HO

Acetil-CoA

via oxidacin y no via glicolisis normal

H OH OH
H
H

Lactato

Acetil-CoA

CH3- tetrahidrometopterina

CO-deshidrogenasa
(especifica de arqueas)

CO2

Microorganismo metanognicos
CO2 + 4H2

4 CO + 2 H2O

4 HCOOH

CH3-NH2 +HCl

2CH3OH

CH4 -COOH + H2O

Go = -131 kJ/mol

CH4 + H2 O

CH4+ 3 CO2

Go = -220 kJ/mol

CH4 + 3 CO2 + 2 H2O

CH4 + CO2 + 4 NH4 Cl

CH4 + CO + 2H2O

CH4 +

CO2

Go = -319 kJ/mol

Go = -230 kJ/mol

Go = -319 kJ/mol

Go = -31 kJ/mol

Aplicaciones industriales
1.- Arqueas metanognicas .- produccin de metano a partir de residuos urbanos
2.- DNA polimerasas termoestables de Thermus aquaticus para ensayos de PCR
3.- Alcohol deshidrogenasas resistentes a los medios orgnicos.
Sulfolobus sulfataricus
4.- Recuperacin de metales Ni, Cu, U, Au etc Sulfolobus sp.

Enzimas mas termoestables que las de los mesofilos

1.- Sustitucin aminocidos flexibles (Gly, Ser, Ala etc) por aminocidos
Rgidos (Thr, Val, Pro)
2.- Sustitucin de aminoacidos con grupos reactivos Cys (SH), Glu y Asp
(COOH), Asn (CONH2) porotros inertes Ala, Leu etc.
3.- Tiene una relacin Arg/Lys alta lo que permite fuertes interacciones
polares

Aplicaciones industriales de enzimas aisladas de microorganismos termfilos

EXTREMOFILO

HABITAT

ENZIMA

APLICACIONES REPRESENTATIVAS

Termfilo

Elevada temperatura
Termfilos moderados (45-65C)
Termfilo (65-85C)
Hipertermfilos (< 85C)

Amilasas
Xilanasas
Proteasas
DNA polimerasas

Glucosa, fructora para edulcorantes

Blanqueo del papel
Fermentaciones, detergentes
Ingeniera gentica

Psicrfilo

Baja temperatura

Proteasas
Deshidrogenasas
Amilasas

Maduracin del queso, produccin de lcticos

Biosensores
Degradacin de polmeros en detergentes

ACIDFILO

Bajo pH

Oxidacin de sulfuros
Concentrado de calcopirita

Desulfuracin del carbn

Recuperacin de metales

Alcalinfilo
Halfilo

Elevado pH
Elevada salinidad

Celulasas

Degradacin de polmeros en detergentes

Barfilos

Elevada presin

Cualquier microorganismo

Formaci de geles y almidones granulados

Metalfilo

Elevada concentracin de metal

Cualquier microorganismo

Bioremediacin, biomineralizacin

Radifilo

Elevados niveles de radiacin

Cualquier microorganismo

Bioremediacin contaminacin radionuclear???

Microaerofilo

Crecimiento en <21% O2

Hipertermfilos

Se conocen como hipertermfilso aquellos microorganismos que crecen por encima de 80C.
Hay algunos que crecen por enzima de la temperatura de ebullicin del agua.Pyrolobus fumarii 113C
Muchos de ellos corresponden al dominio de las Archeas.
Los hipertermfilos se encuentran en entornos terrestres o marinos, siempre que haya agua
Caliente v.g. agua calentada por fuentes termales, geisers o volcanes.
El estudio de secuencias 16S rDNA de los hipertermfilso ha demostrado que se encuentran
en lo mas profundo de las ramas de la evolucin. Son organismos muy primitivos.

Enzimas de hipertermfilos
Hidrolasas.- Pyrobaculum calidifontis y Sulfolobus solfataricus producen
Carboxil-esterasas y esterasas termoresistentes.
No se han descrito hasta ahora verdaderas lipasas .-selectivas hacia
esteres de cidos grasos
Pyrococcus furiosus es un excelente productor de proteasas
Su perfil de actividad es similar al de la subtilisina
P.furiosus, P.horikoskhii y S. sulfataricus producen enzimas sacarolticas
Estan descritas -amilasa, -glicosidasa, - glucosidasa, -galactosidasa y
Exo--D- glucosaminidasa

Enzimas de hipertermfilos
Alcohol dehidrogenasas.- P. furiosus, S. solfataricus y Aeropyrum pernix
Se han descrito como productores de estas enzimas
En concreto la de P. furiosus tiene 234 aminoacidos y presenta similitudes
con las ADH de cadena corta (van der Ost ycol 2001)
Este tipo no suele tener una gran estereospecificidad
HO

R- 21.8 U/mg
ADH P. furiosus

HO

S- 32.3 U/mg

Enzimas de hipertermfilos
Alcohol dehidrogenasas.- S. solfataricus
Tiene 347 aminoacidos y es NADH dependiente. Muestra una buena
Enantioselectividad en la reduccin de cetonas pequeas (Esposito y col 2002)
Asi la (R,S) 3-metil-butan-2-ona da el alcohol de configuracin S, pero no
hay una marcada selectividad hacia la configuracin del centro que
lleva el metilo
HO

O
ADH S. solfataricus

HO

Enzimas de hipertermfilos

En la actualidad se estn identificando los genes de los hipertermfilso que producen

las enzimas de inters para expresarlas en E. coli.

Psicrofilos. Organismos cuya T ptima de crecimiento es <15C

Psicrotrofos organismos cuya T ptima de crecimiento es de 15 <T<20C
Psicrotolerantes Organismos mesfilos que pueden adaptarse a vivir a
bajas. T

Metodologas para aumentar la actividad enzimtica en los organismos Psicrofilos

1.- aumentar la concentracin intracelular de enzimas.- Psicrotolerantes y psicrotrofos
2.- Fabricando enzimas cuya actividad es casi independiente de T. G 0
3.- Fabricando enzimas muy especficas y de elevado turnover

T(C)

K(s-1)

G
(kJ/mol)

H
(kJ/mol)

S
(J/mol x
K)

15

187

58

71

46

15

34

62

97

122

B.TA41 (psicrof)

15

25

62

36

-92

B. subtillis

15

66

46

-70

-amilasa

A.halophantis
(psicrof)
B. amyloliquefaciens
Subtilisina

La diferencia fundamental es que sus protenas son muy flexibles

para que a bajas T sigan manteniendo la estructura 3D.
Por ello tienen:
1)pocos puentes salinos o pares inicos y por ello la relacin (Arg+Lys)/ Lys
es muy baja
2) posee pocos enlaces de H. esto hace que se pierdan los contactos
entre los barriles . Tienen adems pocos aminocidos tipo
Ser, Thr, Asn, Gln
3) tienen pocas interacciones de stacking entre anillos aromticos Tyr, Phe y Trp.
4) tiene pocas interacciones bipolares entre C=O y NH en las hlices
5)sus protenas tienen poca afinidad por iones estabilizadores de estructuras
tales como Ca(II)
6)sus superficies son muy hidrfobas dando valores anormales de pI
7) su interior es mas hidrfilo que en los mesofilos pro lo que hace que se
desnaturalicen por el agua.

La Ingeniera de los Procesos Enzimticos- aplicacin a enzimas de termfilos

z BSQUEDA DE NUEVAS ENZIMAS MS EFICIENTES

z CLONAJE E HIPEREXPRESIN
z MUTACIN (PURIFICACIN, PROPIEDADES)
MEJOR PROTOCOLO DE PURIFICACIN
PROTOCOLOS MUY SENCILLOS DE INMOVILIZACIN + ESTABILIZACIN
z INGENIERA MICROSCPICA DEL CATALIZADOR
z INGENIERA DE LA REACCIN
z INGENIERA DEL REACTOR

RESULTADOS PODRIAN SER ESPECTACULARES

INGENIERIA ENZIMTICA COMO INGENIERIA MULTIDISCIPLINAR Y COMPLEJA:
NUEVAS POSIBILIDADES EN TECNOLOGIAS DE ALIMENTOS

ENZIMAS
MICROBIOLOGA
MICROBIOLOGA
Biodiversidad

BIOLOGAMOLECULAR
MOLECULAR
BIOLOGA
Alteracin de la
secuencia
de aminocidos
3D

Sper-produccin

NUEVOS Y
Y
NUEVOS
MEJORES
MEJORES
ENZIMAS
ENZIMAS
DNA RECOMBINANTE

Aplicacin a la QUIMICA ORGANICA

PCR

ENZIMAS DE TERMFILOS
z criterio de seleccin natural: eficacia biolgica
a altas temperaturas
z producto de la evolucin natural: enzimas
termo-resistentes
z criterio seleccin natural = criterio seleccin industrial
enzimas muy minoritarias
los microorganismos extremfilos
crecen muy lentamente
Clonacin, sper expresin en microorganismos
hospedadores adecuados

Microorganismos Termfilos: Viven a Altas Temperaturas

ENZIMAS TERMORRESISTENTES

BIOLOGIA INDUSTRIA

PROCESOS A ALTA TEMPERATURA

(prevencin de contaminaciones, economa del proceso)
Microorganismos termfilos Enzima minoritaria
Difcil de crecer en fermentadores
industriales

Clonacin e hiperexpresin en microorganismos mesfilos

hospedantes fciles de manejar

ENZIMAS DE MICROORGANISMOS QUE NO HAN SIDO DETECTADOS

Suelos
Aguas Termales
Aguas de Dorsales
Marinas

Amplificacin
DNA
(PCR)

Biblioteca
de
Secuencias

Extraccin
DNA
mRNA
Homologa con
enzimas conocidas

Clonaje, sper-expresin

Nuevas Enzimas

z Aprovechamiento de evolucin natural TERMFILOS

z Utilizacin directa de DNA ( organismos difciles de identificar)
z Mejora por evolucin dirigida
z Estructura 3D ( Rayos X, modelos matemticos... )
z Mejora por mutagnesis dirigida

ENZIMAS INDUSTRIALES
Actividad y selectividad substratos naturales
Estabilidad

Las enzimas deben ser purificadas

Alta actividad volumtrica

Enzimas puras

Problemas de alergenicidad (solubles)

Ausencia de reacciones laterales catalizados por otras enzimas
contaminantes (oxidaciones, hidrlisis, proteasas solubles o inmovilizadas)
Mxima capacidad de carga de los derivados inmovilizados

Enzimas inmovilizadas y estabilizadas

Re-uso
Reactores en continuo para tratamiento de grandes volmenes de sustrato
La enzima no se libera al alimento
(posibilidad de utilizar un mayor nmero de enzimas)

Derivados inmovilizados y estabilizados para su uso por prolongados periodos de

tiempo
htecnologa y economa

Purificacin de enzimas industriales mediante procesos cromatogrficos

ESTE MTODO DE PURIFICACION PUEDE SER:

a). Muy eficiente y til a escala laboratorio

b). Deberan ser muy tiles a escala industrial pero necesitan
simplificarse y optimizarse

Adsorcin
Adsorcin Selectiva
Selectiva de
de Enzimas
Enzimas Grandes
Grandes Sobre
Sobre Soportes
Soportes Inicos
Inicos Poco
Poco Activados
Activados

Adsorcin de enzimas
grandes y pequeas

Adsorcin selectiva
de enzimas grandes

Desorcin
Desorcin de
de la
la -galactosidasas
-galactosidasas de
de Thermus
Thermus sp.
sp. T2,
T2,
Adsorbida
Adsorbida aa Soportes
Soportes MANAE
MANAE de
de Diferente
Diferente Grado
Grado de
de Activacin
Activacin

80

80

60

60

40

40

20

20

0
0

10

15

20

25

30

35

40

Grado de aminacin del soporte (mols)

Pessela y col. J. Chromatgr. A,

A, 1034, (2004), 155155-159.

Proteinas (%)

100

Actividad (%)

100

Purificacin
Purificacin de
de Enzimas
Enzimas Multimricas
Multimricas de
de Microorganismos
Microorganismos Termfilos
Termfilos Clonadas
Clonadas en
en
Mesfilos
Mesfilos por
por Adsorcin
Adsorcin Selectiva
Selectiva aa Soportes
Soportes de
de Intercambio
Intercambio Inico
Inico Poco
Poco Activados
Activados

Anlisis por filtracin en gel de las protenas del extracto crudo de E. coli
adsorbidas a soportes MANAE-agarosa con diferente grado de activacin

Protenas (g/ml)

12
10
8

Protenas adsorbidas a
MANAE altamente activado

6
4
2

Protenas
adsorbidas
a MANAE 1 mol/g

0
50

60

70

80

90

Volumen de Elucin (mL)

100

110

Anlisis por Filtracin en Gel de PROTEINAS de Microorganismos Termfilos

Clonadas en Mesfilos por Adsorcin Selectiva a Soportes de Intercambio Inico Poco Activados

Proteinas (ugr /mL)

12
10
8
6
4
2
0
45

55

65

75

85

95

105

Volumen de elucin (mL)

- Se eliminan las protenas de elevado peso molecular del organismo mesfilo

- La protena de mayor peso molecular se mantiene intacta (nuestro inters)

Pessela y col. Biotechnol. Progr.

Progr. 20, (2004), 15071507-1511

Purificacin
Purificacin de
de la
la -galactosidasa
-galactosidasa de
de Thermus
Thermus sp.
sp. T2
T2 Clonada
Clonada en
en E.
E. coli
coli

94

1- Patrn de PM

67
-galactosidasa

43

2- Extracto crudo
3- Protenas tras choque trmico

30

4- Protenas adsorbidas a soportes

con baja densidad de grupos

20
1

Pessela y col. J. Chromatog.

Chromatog. A,
A, 1055, (2004), 9393-98

ENZIMAS DE TERMOFILOS
z Elevada estabilidad trmica
z Elevada estabilidad en presencia de codisolventes orgnicos
z Temperatura ptima elevada
z Baja actividad a temperaturas moderadas

Esterasa de Bacillus stearothermophilus

Catecol 2,3 dioxigenasa de Bacillus stearothermophilus
Alfa y beta galactosidasa de Thermus sp.
Xilanasa de Thermotoga maritima

ESTERASA DE B. stearothermophilus

zTemperatura ptima del microorganismo: 60C

zTemperatura ptima de la enzima: 62C
zElevada actividad a temperatura moderada
zAmplia especificidad

ACTIVIDAD DE LA ESTERASA DE B. stearothermophilus

EN MEDIOS DESFAVORABLES

Efecto de la fuerza inica

95

100

Actividad Residual, (%)

Actividad Residual, (%)

Efecto de co-disolventes

80
60
40

30

20
0

95

100
80
60
60
40
20
0

30% propanol

500 mM ClNa

Catecol 2,3 dioxigenasas

X

OH

OH

Catecol

OH
COOH
C O
H

zEnzimas multimricas
z Centro cataltico con un
grupo Fe 2+ no hemo
z Muy inestables
z Posibilidad de ser utilizadas
en sntesis de piridinas complejas

Semialdehido
2- hidroximucnico

Catecol 2,3 dioxigenasa de B. stearothermophilus

Estabilidad trmica elevada ( microorganismo crece a 55C )

EFECTO DE LA UNION COVALENTE MULTIPUNTUAL

EN LA ACTIVIDAD DE LA CATECOL 2, 3 DIOXIGENASA EN
CONDICIONES DESFAVORABLES
100

75
50
25
0
0,00001 0,001

0,1

10

[catecol mM]
pH 7, 40C

1000

Actividad Residual, (%)

Actividad Residual, (%)

100

75
50
25
0
0

25

50
75
Temperatura

pH 7, 0.1 mM catecol

100

XILANASA DE Thermotoga maritima

z Temperatura crecimiento, 80C
z Enzima muy termoestable
z Mximo de actividad 105C
z Vida Media a 100C aproximadamente 10 minutos

Un buen modelo para estudiar la degradacin qumica

de protenas correctamente plegadas

EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD

DE LA XILANASA DE T. maritima

Vida media (min)

10000
1000
100
10
1
0,1
0,01
95

105

115

T, (C)
pH 7

125

EFECTO DE LA INMOVILIZACION EN LA ESTABILIDAD

DE LA XILANASA DE T. maritima

Vida media (min)

10000
1000
100
10
1
0,1
0,01
95

105

115

T, (C)
pH 7

125

Inmovilizacin y Estabilizacin de Enzimas Multimricas

INMOVILIZACIN Y ESTABILIZACIN DE LA -GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2.

z Enzima tetramrica de elevado peso molecular
z Altamente termorresistente
z Activa y estable en un amplio rango de pH.

Potencialmente til para hidrolizar lactosa en leche y en sueros de quesera a alta temperatura

INMOVILIZACIN MULTIPUNTUAL CON DIFERENTE ORIENTACIONES SOBRE SOPORTES EPXIDO

Inmovilizacin Multipuntual de Enzimas Sobre Soportes Epxido

H2 N

O
O

HS

HO
O

Muy estables: transporte

Pueden reaccionar con distintos nucleofilos de la enzima:

inmovilizacin multipuntual muy favorable

Facilidad del bloqueo de epxidos remanentes

z Muy poco reactivos: velocidad de inmovilizacin extremadamente lenta

zPosibilidad de modular la enzima sobre el soporte

Mecanismo de Estabilizacin de Enzimas

Detecci
n de subunidades enzim
ticas no unidas al soporte vva
a ep
xido.
Deteccin
enzimticas
epxido.
SDS Mercaptoetanol,
100C

Derivado no estabilizado

derivado
estabilizado

+
SDS-PAGE

Estabilizacin del Derivado Boronato por Entrecruzamiento con Dextrano Aldehdo pH 6,5 70 C

Actividad residual,(%)

100

derivado boronato entrecruzado

970
97000
66000

- galactosidasa
de Thermus sp. T2

80
45000

60

30000

40

20100

-galactosidasa soluble

20

14400

0
0

10

Tiempo (horas)

Pessela y col. Biotechnol. Prog. 20, (2004), 388-392

1 Patr
Patrn de peso molecular
2 Derivado boronato sin entrecruzar
3 Derivado boronato entrecruzado

Adsorcin de protenas sin colas de Poli-His sobre soportes quelatos altamente activados

Adsorci
Adsorcin en ausencia de Imidazol

Adsorci
Adsorcin en presencia de Imidazol

Las protenas de elevado peso molecular se pegan mucho mas

fuertes que las protenas de pequeo peso molecular

Adsorcin de la -galactosidasa de Thermus sp. T2 clonada en E. coli soportes

IMAC altamente activados
Grado de activacin del soporte: 115 M de quelatos /g de soporte

Efecto del Imidazol en la adsorcin de la -galactosidasa y de otras protenas de E. coli

100

Actividad residual ,%

Actividad
-galactosidasa

Protenas totales

80

80

60

60

40

40
20

20

10

Pessela y col. Enzyme Microbial Technol.

Technol. 39, (2006), 909909-915.

20
30
40
[Imidazol, mM]

50

Protenas adsorbidas ,%

100

Adsorcin de la - y -galactosidasas de Thermus sp. T2 clonadas en E. coli

soportes IMAC altamente activados
Purificacin de la - y -galactosidasas de Thermus sp. T2 clonadas en E. coli
1.- Choque trmico
2.- Adsorcin selectiva a soporte IMAC muy activados en presencia de 50 mM de imidazo
-galactosidasa

LMW (kDa)

-galactosidasa

LMW (kDa)

94
94

67

67

43

43
31

31

21

21
1

3
1- PM; 2- Extracto crudo; 3- enzima purificada

Pessela y col. Enzyme Microbial Technol.

press).
Technol. (In press).

Purificacin-Inmovilizacin-Estabilizacin de la - y -galactosidasas
de Thermus sp. T2 sin Poli-His, adsorbidas a soportes IMAC muy activados

Inactivacin Trmica de los Derivados de la - y -galactosidasas

Actividad residual, (%)

-galactosidasa

-galactosidasa

100

100

Sepabeads-EB-IDA-Ni

80

Sepabeads-EB-IDA-Ni

80

60

60

Soluble

40
20

20

0
0

Soluble

40

10

Tiempo (h)
Condiciones de inactivacin: pH 7, 70C

Pessela y col. Enzyme Microbial Technol.

Technol. (In press)
press)

20

30