Consumo de Zinc, suplementacin y produccin de quimiocinas
Laboratorio de Investigacin en Inmunologa - Edificio A
Elabor: Fosado Esquivel Cyntia Paola, Carrizosa Muoz Cecilia, Hernndez Aceves Juan Alberto. Profesor titular: Dra. Ana Esther Aguilar Crdenas
RESUMEN: Se cuantific la concentracin de la quimiocina CXCL16 en muestras de sangre humana; mediante la estandarizacin de un ensayo inmuno-enzimtico. Se
evaluaron dos ensayos, cuya cuantificacin se realiz por microespectroscopa con ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) y OPD (oPhenylenediamine) como sustratos de revelacin con el fin de ayudar a encontrar la relacin entre el consumo de zinc de una poblacin con la produccin de CXCL16
( biomolcula partcipe de la respuesta inmunitaria)
OBJETIVO: Estandarizar un mtodo para la cuantificacin de quimiocina CXCL16
mediante un ensayo inmuno-enzimtico y de esta manera ayudar a determinar la
influencia que tiene el consumo de zinc en la produccin de sta.
Incubar
Overnight
Deteccin
T.A.
INTRODUCCIN:
El requerimiento biolgico de los llamados metales traza o huella basa su importancia
en que son elementos qumicos que se necesitan para asegurar un crecimiento y
desarrollo adecuados del cuerpo humano, por lo que es indispensable mantener una
dieta balanceada que los incluya. Por caso, el zinc ha demostrado participar en
funciones biolgicas, genticas, metablicas y en la respuesta inmune (Figura 1)
Respuesta inmune mediante la
modulacin de Interleucinas
Incubar
30 min
T.A
Lavar y aspirar 4
veces con A.L
(1 min)
Metablicas, cofactor de la enzima
Superxido dismutasa
Zinc
Expresin gentica. Mediante la
interaccin con los dedos de Zinc
Resultado colorido
Proliferacin de clulas.
Por ejemplo clulas T
Cuantificacin
Figura 1. Funciones en las que interviene el Zinc en el cuerpo
Las quimiocinas son una familia de protenas con estructura similar entre ellas que se
clasifican en 4 grupos: CC, CXC, C y CXXXC, se caracterizan por tener un puente disulfuro
y son encargadas de la comunicacin en la respuesta inmune. CXCL16 es una protena
producida por clulas dendrticas y se encuentra altamente expresada en bazo y
ganglios linfticos, regulando principalmente la migracin de linfocitos T hacia el bazo.
RESULTADOS
Se evalu el mtodo con ABTS y OPD, obtenindose una mejor correlacin
lineal entre absorbancia y concentracin de CXCL16 usando ABTS.
METODOLOGA
Se realiz la estandarizacin de acuerdo al diagrama presente, la lectura se efectu en
un microespectrofotmetro a una longitud de onda de 405nm con un filtro de 610 nm
debido al espectro del ABTS, siendo una longitud de onda de 490nm en el caso de OPD.
Abs. =405-630 nm
0.244
Anticuerpo de captura
BSA (Albmina de suero bovino) / Amortiguador de bloqueo
Quimiocina CXCL16 humana
Anticuerpo de deteccin biotinilado
HRP (peroxidasa de rbano picante)
Avidina
ATBS/OPD
0.24
y = 0.0299x + 0.157
R = 1
0.236
0.232
0.228
LOG10 CXCL16 (pg/ml)
0.224
2
Tabla 1. Simbologa utilizada para denotar el proceso efectuado en cada paso de la estandarizacin
2.2
2.4
2.6
2.8
Figura 2. Curva de estandarizacin obtenida con ABTS
METODOLOGA DE ESTANDARIZACIN TANTO PARA ABTS COMO OPD
Incubar a
overnight
Lavar y aspirar
4 veces con
amortiguador de lavado (A.L) (300L)
Durante 1 min.
T.A
Foto 1. Resultados de las curvas de estandarizacin realizadas ABTS (izq.) y OPD (der.)
Incubar 1 h
T.A.
Lavar y aspirar 4 veces con
300 L de A.L (1 min)
Preparacin de estndar de CXCL16 humana
MUESTRA
CXCL16 EN SUERO (pg/mL)
031093
592.65
190893
37.165
120292
746.49
240388
14.77
030393
11.72
Tabla 2. Resultados de la cuantificacin de 5 muestras de alumnos de la Facultad de Qumica
CONCLUSIONES
Se complet el volumen de cada estndar con diluyente (PBS)
Incubar 2 h
T.A.
Lavar
y aspirar 4
veces con 300 L de
A.L (1 min)
Ya que el ensayo inmuno-enzimtico es muy sensible (en orden de pg/mL) al
realizarse 4 estandarizaciones se observ que la preparacin debe de llevarse
a cabo con la mayor exactitud, determinando as que el uso de ABTS es el ms
adecuado para cuantificar la quimiocina de inters en muestras problema.
Este proyecto servir para complementar el trabajo de investigacin en el
Laboratorio de Inmunologa de la Facultad de Qumica, permitiendo establecer
si existe una relacin entre el consumo de Zinc y la produccin de CXCL16
Agradecimientos
Agradecemos el apoyo constante de Martnez Velasco Omar y Rodrguez Daz Nelly
durante la estancia estudiantil 2017-1
BIBLIOGRAFA DE REFERENCIA
N. I. o. Health, National Institutes of Health Office of Dietary Supplements, 12 Febrero 2016. [En lnea]. Available: https://ods.od.nih.gov/factsheets/Zinc-DatosEnEspanol/. [ltimo acceso: 5 Agosto 2016]
CULTEK, Fundamentos y tipos de ELISA, CULTEK, febrero 2006. [En lnea]. Available: http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf. [ltimo acceso: 5 Agosto 2016].
