PCR Pigs

Sistema de Revisiones en Investigacin
Veterinaria de San Marcos
USO DE LAS VARIANTES DEL

PCR EN EL ESTUDIO DEL
VIRUS DEL SNDROME
RESPIRATORIO Y
REPRODUCTIVO PORCINO
REVISIN BIBLIOGRFICA - 2011

Autor:
Mercy G. Ramrez Velsquez
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Facultad de Medicina Veterinaria
TABLA DE CONTENIDO
1.
2.
2.1.
2.2.
2.3.
3.
4.
5.
PRESENTACIN .................................................................................................... 2
CARACTERISTICAS VIRALES ............................................................................ 2
Taxonoma ................................................................................................................ 2
Genotipos .................................................................................................................. 3
Organizacin genmica .......................................................................................... 3
EL PCR Y SUS VARIANTES................................................................................. 3
CONCLUSIONES .................................................................................................... 5
BIBLIOGRAFA CITADA: ....................................................................................... 5
Postgrado Autor: Mercy G. Ramrez Velsquez
USO DE LAS VARIANTES DEL PCR EN EL

ESTUDIO DEL VIRUS DEL SNDROME
RESPIRATORIO Y REPRODUCTIVO PORCINO
Mercy G. Ramrez Velsquez (mercyvet@gmail.com,)
1. PRESENTACIN
En los ltimos aos, el uso de las
tcnicas
convencionales
como
ensayo
inmunoabsorvente
ligada
El presente artculo tiene por
el
objetivo hacer una breve revisin sobre
los estudios que se han realizado para
enzimas (ELISA) y la inmunoperoxidasa
identificar
el
VPRRS
utilizando
en monocapa (IPMA) han servido para
principales variantes del PCR.
las
el diagnstico del virus del Sndrome

Respiratorio y Reproductivo Porcino
Palabras clave: PCR, virus PRRS,
(VPRRS) en hatos o granjas porcinas;
nested PCR, multiplex PCR, tiempo real
sin embargo estas pruebas serolgicas
PCR
no permiten diferenciar a los animales

vacunados
infectados
vacuna),
de
(en
ni
los
naturalmente
regiones
recin
donde
se
infectados,
ni
2. CARACTERISTICAS VIRALES
2.1. Taxonoma
El PRRS es causado por el virus
portadores que no producen anticuerpos
del
detectables por estas pruebas. Las
Reproductivo
pruebas moleculares como la reaccin
VPRRS
en cadena de la polimerasa (PCR) es
Arteriviridae, junto al virus de la arteritis
una
viral equina, al virus elevador de lactato
deshidrogenasa del ratn y al virus de la
diferenciar genotipos virales por lo que
fiebre hemorrgica del simio. La familia
es
Arteriviridae
prueba
permiten
altamente
identificar,
considerada
una
sensible
cuantificar
herramienta
diagnstica ms precisa y confiable.
Sndrome
Respiratorio
Porcino
pertenece
junto
(VPRRS).
a
con
la
la
y
El
familia
familia
Coronaviridae forma el nuevo y estable
orden
Nidovirales
(Snijder,
1998;
Meulenberg, 2000; Morilla 2005).
de 8 marcos
lecturas
abiertas
(ORFs), 6 de los cuales son expresados

para
2.2. Genotipos
la
formacin
de
ARNs
subgenmicos (Guarino et al., 1999).
El VPRRS est dividido en dos

genotipos
de
pero
polimerasa viral, los ORFs 2-6 codifica
genticamente distinguibles: el genotipo
protenas estructurales (GP2, GP3, Gp4,
1, el Europeo, tambin conocido como
GP5 y M) y ORF7 la protena de la
virus Lelystad, y el genotipo 2 o
nucleocpside (N) (Guarino et al., 1999;
Americano (Guarino et al., 1999; OIE,
Meulemberg, 2000). Hay tres principales
2008; Spilman et al., 2009). Existe una
protenas estructurales: la protena GP5,
considerable variabilidad entre ambos
M y N, siendo la protena GP5 la ms
genotipos, inclusive entre cepas del
abundante glicoprotena de envoltura y
mismo genotipo 2 (Kleiboeker et al.,
la principal inductora de anticuerpos
2005). Dependiendo del respectivo gen
neutralizantes (Meulemberg, 2000; Yang
bajo investigacin, estos dos genotipos
et al., 2000; Zheng et al., 2007).
difieren
la
Mientras que la protena N es la ms
secuencia de su ARN (Truyen et al.,
abundante protena del virion y es
2006), teniendo solo cerca del 50-60%
altamente
antignica,
de
utilizada
para
hasta
identidad
antignica
Los ORFs 1a y 1b codifican el ARN
en
un
entre
50%
sus
en
secuencias
(Spilman et al., 2009).
la
por
esto
deteccin
es
de
anticuerpos especficos al virus y para el

diagnstico de la enfermedad (Dea et
2.3. Organizacin genmica

El
genoma
del
VPRRS
al., 2000).
est
contenido en una molcula simple de
3. EL PCR Y SUS VARIANTES
ARN poliadenilado de polaridad positiva
El PCR es una tcnica molecular
asociado a una cubierta proteica y a una
altamente sensible y especfica utilizada
envoltura externa (Kleiboeker et al.,
para
2005; OIE, 2008). Su genoma consiste
enfermedades
el
diagnstico
de
infecciosas.
muchas
Hay
numeroso estudios que sealan el uso
VPRRS por un PCR convencional y
de
la
PCR nested usando 6 pares de primers
reaccin en cadena de la polimerasa
de diferentes regiones del genoma viral,
(RT-PCR) para la identificacin del
con el objetivo de identificar primers
cido nucleico del VPRRS en muestras
universales que permitan amplificar el
de tejidos, suero y semen (Rovira et al.,
genoma de todos o de la mayora de los
2007). Las variantes del PCR ms
aislados del VPRRS. Ellos demostraron
utilizadas
del
que el ORF 7 es un blanco exitoso para
VPRRS son el PCR nested, el PCR
el diagnstico del virus y que permiti la
multiplex y el PCR en tiempo real.
amplificacin
la
transcriptasa
para
la
reversa
de
identificacin
de
los
fragmentos
En 1997 Gilbert et al. describi a
correspondientes en todos los aislados
la tcnica del PCR multiplex y del PCR
probados. Sin embargo, mencionan que
nested multiplex para la diferenciacin
la
de genotipos Europeos y Americanos
disminuy con muestras de suero, esto
del VPRRS, con el fin de determinar el
puede estar relacionado a prdidas en
ms bajo limite de deteccin viral por
el
PCR. Ellos mostraron que la prueba del
degradacin del RNA por contaminacin
PCR nested multiplex es capaz de
con
detectar 10 dosis infectivas en Cultivo
suero.
sensibilidad
de
procedimiento
ribonucleasas
algunos
de
primers
extraccin
presentes
en
o
el
de Tejido 50 (TCID50) en comparacin

con 103TCID50 que pudo detectar el
Otra variante del PCR empleada
PCR multiplex en muestras de suero de
para la deteccin del VPRRS es el PCR
animales experimentalmente infectados.
en tiempo real (RRT-PCR) que tiene la
La ms alta sensibilidad del PCR nested
ventaja, sobre el RT- PCR convencional,
multiplex
de consumir menos tiempo durante su
tiene
como
ventaja
la
genotipificacin directa del VPRRS.
desarrollo y disminuir la probabilidad de

contaminacin de los amplificados de
Guarino et al 1999, analiz 24

diferentes
asilados
de
campo
del
ADN.
El uso de una tcnica como el
RRT-PCR ofrece
la oportunidad de
detectar fcil y rpidamente ARN viral.

Asimismo, puede monitorear amplicones
4. CONCLUSIONES
Las
variantes
del
PCR
ms
acumulados directamente, durante el
utilizadas para la identificacin
proceso de amplificacin del ADN (Yang
molecular del VPRRS son el PCR
et al., 2006).
nested, PCR multiplex y el PCR
Un estudio realizado por
Yang et al., 2006 compararon los

resultados obtenido de un RRT-PCR en
en tiempo real.
Que el PCR en tiempo real es
tiempo real utilizando SYBR green I con
una
un
RT-PCR
sensibilidad
del
tcnica
molecular
convencional.
La
confiable
RRT-PCR
fue
identificacin del VPRRS.
segura
ms
para
la
encontrada por ser de 10-100 veces

ms alta que el convencional RT-PCR.
5. BIBLIOGRAFA CITADA:
Otro estudio desarrollado por Rovira et
1. Dea S, Gagnon CA, Mardassi H,
al., 2007 evalu la sensibilidad del RRT-
Pirzadeh B, Rogan D. 2000.
PCR en diferentes muestras biolgicas,
Current
probadas individualmente y en mezcla
structural
de 3 a 5 muestras. Los resultados de
reproductive
and
este estudio sugieren que el suero es la
syndrome
(PRRS)
virus:
mejor muestra para detectar el VPRRS
comparison
of
North
en verracos durante la infeccin aguda y
American and European isolates.
que el trabajo en mezcla de 3 a 5
Arch Virol 145: 659688.
knowledge
proteins
on
of
the
porcine
respiratory
the
muestras disminuye la sensibilidad del
2. Gilbert SA, Larochelle R, Magar
RT-PCR; ya que, cerca del 6% de las
R, Cho HJ, Deregt D. 1997.
muestras que pudieran ser detectadas
Typing of porcine reproductive
por RT-PCR en muestras de suero
and respiratory syndrome viruses
individuales pueden ser prdidas si ellas
by a multiplex PCR assay. J. Clin.
fueran corridas en una mezcla de 5
Microbiol. 35: 264-267.
muestras.
3. Guarino H, Goyal SM, Murtaugh

MP, Morrison RB, Kapur V.
1999.
Detection
reproductive
syndrome
of
and
virus
porcine
8. Rovira
Clement
T,
Christopher-Hennings
respiratory
by
A,
J,
Thompson B, Engle M, Reicks
reverse
D,
reaction using different regions of
Evaluation of the sensibility of
the viral genome. J vet Invest 11:
reverse transcription polymerase
27-33.
chain reaccin to detect porcine
4. Kleiboeker SB, Schommer SK,
Muoz-Zanzi
2007.
transcription- polymerase chain
reproductive
and
Cl.
respiratory
Lee SM, Watkins S, Chittick W,
syndrome virus on individual and
Polson D. 2005. Simultaneous
pooled samples from boars. J Vet
detection of North American and
Diagn Invest 19: 502-509.
European porcine reproductive
9. Snijder EJ, Meulenberg JJM.
and respiratory syndrome virus
1998. The molecular biology of
using
arteriviruses. J Gen Virol 79: 961-
real-time
quantitative
979.
reverse transcriptase- PCR. J Vet

Diagn Invest 17: 165-170.
10. Spilman MS, Welbon C, Nelson
5. Meulenberg JM. 2000. PRRSV,
E,
6. Morilla A. 2005. Manual para el

de
las
T.
2009.
Cryo-
electron tomography of porcine
the virus. Vet Res. 31: 11-21

control
Dokland
reproductive
and
respiratory
syndrome virus: organization of
enfermedades
infecciosas de los cerdos. 2a ed.
the
Mxico.
General Virology. 90: 527-535.
El
manual
Moderno:
nucleocapsid.
Journal
og
11. Truyen U, Wilhem S, Genzow
315p.
7. (OIE) Organizacin Mundial de
M, Schageman G. 2006. Porcine
Sanidad Animal. 2008. PRRS:
Reproductive
the
diagnosis,
Syndrome Virus (PRRSV): A ring
prevention and control. Report of
test performed in Germany to
the OIE Ad hoc Group on PRRS/
Asess
disease,
its
Paris, 9-11.
and
RT-PCR
Respiratory
dteccion
methods. J. Vet. Med. B53: 1874.

12. Yang L, Frey L, Yoon KJ,
Zimmerman JJ, Platt KB. 2000.
Categorization of North American
porcine
reproductive
respiratory
and
syndrome
viruses:
Epitopic profiles of the N, M, GP5

and
GP3
susceptibility
proteins
to
and
neutralization.
Arch Virol 145: 15991619.

13. Yang Z-Z, Fang WH, Habib M.
2006. First results of detection de
PRRSV and CSFV RNA by SYBR
green I- based quantitative PCR.
J. Vet. Med. B 53, 461467.
14. Zheng Q, Desheng Ch, Li P, Bi
Z, Cao R, Zhou B, Chen P. 2007.
Co-expressing
GP5
and
proteins under different promoters

in recombinant modified vaccinia
virus
ankara
vaccine
vector
humoral
and
(rMVA)-based
enhanced
cellular
the
immune
responses of porcine reproductive

and respiratory syndrome virus
(PRRSV). Virus Genes 35:585
595.

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USO DE LAS VARIANTES DEL

REVISIN BIBLIOGRFICA - 2011

Postgrado Autor: Mercy G. Ramrez Velsquez

USO DE LAS VARIANTES DEL PCR EN EL

El presente artculo tiene por

objetivo hacer una breve revisin sobre

los estudios que se han realizado para

enzimas (ELISA) y la inmunoperoxidasa

en monocapa (IPMA) han servido para

principales variantes del PCR.

el diagnstico del virus del Sndrome

Palabras clave: PCR, virus PRRS,

(VPRRS) en hatos o granjas porcinas;

nested PCR, multiplex PCR, tiempo real

sin embargo estas pruebas serolgicas

no permiten diferenciar a los animales

portadores que no producen anticuerpos

detectables por estas pruebas. Las

pruebas moleculares como la reaccin

en cadena de la polimerasa (PCR) es

Arteriviridae, junto al virus de la arteritis

viral equina, al virus elevador de lactato

deshidrogenasa del ratn y al virus de la

diferenciar genotipos virales por lo que

fiebre hemorrgica del simio. La familia

diagnstica ms precisa y confiable.

Coronaviridae forma el nuevo y estable

Postgrado Autor: Mercy G. Ramrez Velsquez

Meulenberg, 2000; Morilla 2005).

(ORFs), 6 de los cuales son expresados

subgenmicos (Guarino et al., 1999).

El VPRRS est dividido en dos

polimerasa viral, los ORFs 2-6 codifica

genticamente distinguibles: el genotipo

protenas estructurales (GP2, GP3, Gp4,

1, el Europeo, tambin conocido como

GP5 y M) y ORF7 la protena de la

virus Lelystad, y el genotipo 2 o

nucleocpside (N) (Guarino et al., 1999;

Americano (Guarino et al., 1999; OIE,

Meulemberg, 2000). Hay tres principales

2008; Spilman et al., 2009). Existe una

protenas estructurales: la protena GP5,

considerable variabilidad entre ambos

M y N, siendo la protena GP5 la ms

genotipos, inclusive entre cepas del

abundante glicoprotena de envoltura y

mismo genotipo 2 (Kleiboeker et al.,

la principal inductora de anticuerpos

2005). Dependiendo del respectivo gen

neutralizantes (Meulemberg, 2000; Yang

bajo investigacin, estos dos genotipos

et al., 2000; Zheng et al., 2007).

Mientras que la protena N es la ms

secuencia de su ARN (Truyen et al.,

abundante protena del virion y es

2006), teniendo solo cerca del 50-60%

Los ORFs 1a y 1b codifican el ARN

(Spilman et al., 2009).

anticuerpos especficos al virus y para el

2.3. Organizacin genmica