TIPIFICACIÓN DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO

INTRODUCCION

La infección por virus papiloma humano (VPH) es la infección de transmisión sexual (ITS)
más frecuente en el mundo y el principal agente causal del cáncer cérvico-uterino (CCU),
encontrándose en 99,7% de los casos. El VPH afecta a hombres y mujeres por igual; sin
embargo, en hombres principalmente se ha asociado a lesiones como verrugas ano-
genitales y a neoplasias intraepiteliales de pene y ano3. La infección por VPH en el
hombre ha sido considerada como un problema menor y de escasa relevancia. En general
se ha catalogado al hombre como vector silencioso de este microorganismo, ya que a
pesar de jugar un papel importante en la transmisión del virus, sólo 1% de ellos
experimenta algún signo o síntoma clínico. El objetivo de esta revisión es describir la
patogenia de VPH y sus principales técnicas de detección en el hombre.

La infección persistente por tipos de VPH oncogénicos es una condición previa para que
se desarrolle el cáncer cervicouterino, una enfermedad que cada año afecta a alrededor
de 500 000 mujeres y provoca 260 000 muertes en todo el mundo. Los tipos 16 y 18 del
virus causan por sí solos alrededor del 70% del total de casos de cáncer cervicouterino.
La infección por VPH puede manifestarse también como cáncer de vagina, vulva, pene o
ano, y es la causa de algunos cánceres de cabeza y cuello. Además, los tipos 6 y 11 del
VPH causan verrugas anogenitales y papilomatosis respiratoria recurrente. Los VPH se
transmiten principalmente por vía sexual. Si bien la mayoría de las personas se infectan
poco después de iniciar su vida sexual, el cáncer cervicouterino afecta sólo a una
pequeña fracción de las infectadas y puede tardar décadas en desarrollarse. La mayoría
de las afectadas por las enfermedades que causa el VPH son mujeres adultas de países
de ingresos bajos.

MARCO TEORICO:
VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO
Los Virus del Papiloma Humano (VPH) son un grupo de virus de ADN de doble banda que
pertenecen a la familia Papovaviridae, no poseen envoltura, y tienen un diámetro
aproximado de 52-55 nm. 2 Las partículas virales están compuestas por una cápsida
proteica, conformada en un 95% por la proteína L1 y en un 5% por la proteína L2, las
cuales se ensamblan para formar capsómeras heicosaédricas3 y que serían usadas para
la fabricación de vacunas profilácticas. Hacia el interior de la cápsida se encuentra un
DNA circular de doble cadena de aproximadamente 8000 pares de bases, constituido por
ocho genes y una región regulatoria no codificante, la cual contiene sitios de unión para
factores proteicos y hormonales del hospedero, necesarios para que el virus pueda
completar su ciclo de replicación. El genoma del VPH, lo conforman dos tipos de genes,
aquellos que son codificados en las etapas tempranas de la infección, conocidos como
genes E (del inglés Early = temprano), y aquellos que son codificados durante las etapas
tardías del ciclo de replicación del mismo, conocidos como L (del inglés Late = tardío). Se
conocen seis genes tempranos: E1, E2, E4, E5, E6 y E7 (aunque se considera que E4 es
en realidad un gene tardío), y dos tardíos: L1 y L2. Los genes tempranos codifican
proteínas involucradas en la replicación y regulación viral, así como en su capacidad
carcinogénica. Por otro lado los genes tardíos codifican las proteínas estructurales que
conforman la cápside viral.
Una región de aproximadamente 4000 pares de bases codifica las proteínas para la
replicación viral y la transformación celular; otra región que posee 3000 pares de bases
codifica proteínas estructurales de las partículas virales y finalmente una región de 1000
pares de bases que no codifica y contiene los elementos reguladores de la replicación y
transcripción del ADN viral.
El cáncer de cuello uterino (CCU) es la segunda neoplasia maligna más frecuente en la
población femenina a nivel mundial. En Chile, es una neoplasia de alta incidencia y
mortalidad, ocupando el cuarto lugar como causa de muerte por cáncer en mujeres. Se
estima una tasa bruta de mortalidad de 10,2 x 100.000 y una tasa de mortalidad de 16,7 x
100.000 en mujeres mayores de 15 años. En la IX región (Servicio Araucanía Sur) el CCU
corresponde a 68% de los cánceres ginecológicos y constituye la tercera causa de
muerte, con una tasa de mortalidad de 9,46 x 100.000 en el año 2000.

El virus papiloma humano (VPH) es considerado uno de los patógenos más comunes
transmitidos sexualmente y el principal agente causal de las neoplasias cervicales
intraepiteliales (NCI) y el CCU; y está asociado a tumores de la región anogenital, tracto
respiratorio alto y digestivo.

Las NCI son clasificadas en lesiones de bajo grado (LBG) y lesiones de alto grado (LAG)
según el riesgo de transformación neoplásica. Clásicamente se han agrupado los
genotipos virales de VPH en bajo riesgo (BR), alto riesgo (AR) y riesgo intermedio (RI),
dependiendo de la frecuencia con que se encuentran en lesiones benignas, LBG, LAG y
carcinomas invasores. Los subtipos virales más frecuentemente asociados al grupo de AR
son VPH 16, 18, 45 y 56, detectados principalmente en LAG y carcinomas; al grupo de RI
VPH 31, 33, 35, 51 y 52 asociados a todos los grados de NCI y el grupo de BR VPH 6, 11,
34, 42, 43 y 44 detectados más frecuentemente en lesiones benignas. En la actualidad, se
ha observado que la asociación cáncer-VPH es igualmente poderosa entre los tipos
considerados de AR y RI. De este modo, 15 tipos de VPH han sido clasificados como de
AR (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82) y por lo tanto, deberían ser
considerados con potencial oncogénico.

PATOGENIA DE LA INFECCIÓN POR VPH.

Acciones de las distintas proteínas codificadas por VPH. Una vez que las células son
infectadas por VPH comienza la replicación del virus gracias a factores de transcripción
de la célula hospedera y la proteína E1 viral. E7 se une la proteína retinoblastoma
dejando libre al factor de transcripción E2F, lo que permite la activación de genes que
aumentan la proliferación celular. La oncoproteína E6 es capaz de inducir la
ubiquinización y posterior degradación de p53, lo que conlleva a disminución de la
apoptosis mediada por p53. E2 regula la transcripción de las oncoproteínas E6 y E7. La
proteína E5 aumenta la acción de las kinasas celulares lo cual promueve la proliferación y
disminuye la diferenciación celular. E4 ayuda al ensamblaje de las proteínas de la cápside
viral L1 y L2 para el empaquetamiento de los viriones de VPH.

Diferentes estudios han intentado explicar la fisiopatologia y modelo de infección por VPH
de alto riesgo, siendo descrito principalmente en el epitelio cervical. Durante la actividad
sexual se produce un microtrauma lo que permite la entrada de viriones a la capa basal
del epitelio cervical, ya que VPH sólo infecta a células del tejido mucoso que puedan
proliferar. Esto ocurre mediante la unión entre receptores celulares y el virus,
principalmente heparán sulfato para VPH 16 y α6 -integrina para VPH 6. Una vez dentro
de la célula hospedera, el AlDN viral se replica a medida de que la capa basal se
diferencia y progresa a la superficie del epitelio9. Mientras el virus se encuentra en la capa
basal se mantiene en estado episomal con pocas copias de ADN y utiliza la maquinaria
celular para la replicación de su genoma. Cuando la célula se va diferenciando el virus
aumenta su tasa de replicación y además comienza a producir las proteínas L1 y L2

relacionadas con la cápsula.

La replicación del AlDN viral comienza con la interacción de los factores de transcripción
de la célula con la región LCR del virus y los genes virales E6 y E7 son los primeros en
ser transcritos7. La proteína E6 se une con una proteína celular denominada proteína
asociada a E6 (E6AP) que cumple una función de ubiquitina ligasa15. E6 aumenta la
afinidad de E6AP por p53 promoviendo la rápida degradación de p53, mediante un
complejo enzimático de ubiquitinización, lo que inactiva las funciones de p53, entre las
que se encuentran: regular el ciclo celular mediante arresto en etapa G1, mediar procesos
de apoptosis e intervenir en la reparación del ADN, regular la expresión de ErbB2 y
estimular otros genes supresores de tumores como Notch1. Por otra parte, la proteína E7
viral se puede unir a la forma hipofosforilada de la proteína retinoblastoma (RB). Esta
unión rompe el complejo entre RB y el factor de transcripción E2F-1, por lo que E2F-1
queda libre y se une a promotores de genes necesarios para que la célula entre en fase S
del ciclo celular y así comenzar su transcripción.

CICLO VITAL DE LOS VPH.

El ciclo de los VPH está estrechamente ligado al crecimiento y diferenciación de las

células epiteliales hospederas. El VPH inicia su ciclo productivo infectando a las células
poco diferenciadas de las capas basales del epitelio, donde inicia la transcripción de sus
genes. La forma en que el VPH alcanza las células de los estratos bajos del epitelio es a
través de lesiones, micro-heridas y abrasiones del tejido.8 El virus se une a su célula
blanco a través de un receptor de membrana, la molécula a6-Integrina. Una vez ocurrida
la infección el virus se establece dentro del núcleo de las células basales. El DNA viral
permanece en estado episomal (circular) fuera de los cromosomas del hospedero,
replicándose a niveles muy bajos en coordinación con la división celular. Fig. 4 Cuando
las células infectadas se diferencian y migran desde la capa basal hacia el estrato
espinoso del epitelio, la replicación viral se estimula, produciendo la acumulación de
viriones dentro del núcleo. El análisis de las moléculas de ARN mensajero viral durante
las diferentes etapas de diferenciación de las células infectadas demuestra que la
expresión de los genes tempranos ocurre a lo largo de todos los estratos epiteliales, sin
embargo la expresión de los genes tardíos se observa únicamente en los queratinocitos
totalmente diferenciados de los estratos más superficiales, donde también ocurre el
ensamblado de las cápsidas virales que dan lugar a la formación de viriones.9-11 que al
parecer siguen fases bien definidas pero variables en la infección transitoria y en el
desarrollo de lesiones premalignas y malignas del cuello uterino12 que se han
determinado por medio de marcadores celulares. Para que estos permanezcan en la
población general deben completarlo. 11 Los VPH no presentan una fase lítica, por lo
tanto se valen de las características propias de las células que los albergan para propagar
su progenie, la cual es liberada cuando las células terminales del estrato corneo sufren un
proceso de descamación.8, 13 Cuando se estudian las lesiones histológicas y los
marcadores moleculares, en un mismo tipo de lesión histológica puede mostrar diferentes
marcadores, y en dentro de una misma biopsia pueden haber diferentes expresiones.
 Estas anomalías tempranas en el ciclo viral pueden desencadenar el desarrollo de
lesiones NIC o del CCU. Es decir, los marcadores celulares pueden consti tuir técnicas
adecuadas para mejor predecir el futuro de las lesiones.11 Epidemiología de la infección
por el virus del papiloma. La proporción de mujeres infectadas con el VPH varía entre
poblaciones. Cuando se comparó la distribución en tres áreas de 11 países (Nigeria,
India, Vietnam, Tailandia, Corea, Colombia, Argentina, Chile, Holanda, Italia y España),
utilizando la prueba de HPV de la reacción en cadena de la polimerasa se encontró de 15
613 mujeres comprendidas entre los 15-74 años sin anomalías citológicas, la prevalencia
de VPH estandarizada por edad varía cerca de 20 veces entre poblaciones, desde 1.4%
(IC 95% 0.5-2.2) en España a 25.6% (22.4-28.8) en Nigeria. Aunque tanto la prevalencia
total de VPH como la de VPH 16 eran más altas en el África Subsahariana, las mujeres
positivas al virus en Europa estaban mayormente infectadas con el VPH 16 que las del
África Sub-sahariana (OR 2.64, p=0.0002), y fueron significativamente menos infectadas
por tipos de VPH de alto riesgo diferentes al VPH 16 (OR 0.57, p=0.004) y / o tipos de
bajo riesgo (OR 0.44. p=0.0002).12 Las mujeres de Suramérica tenían una prevalencia
intermedia entre las de África y Europa. La heterogeneidad entre las áreas de Asia era
significativa, y este hecho, debe ser tomado en cuenta cuando se desarrollen pruebas de
cribado para el virus y predecir el efecto de las vacunas en la incidencia de la infección.12
Algunos ejemplos de la prevalencia de la infección por el VPH se muestran a
continuación: En Guanacaste, Costa Rica se determinó la seroprevalencia y los
determinantes de la seropositividad en 10049 mujeres de un estudio de cohortes en base
poblacional Se buscaron la presencia de los tipos 16, 18, 31 y 45. Definieron la
seropositividad como 5 desviaciones estándares por encima de la media de la densidad
óptica obtenida por los estudios vírgenes (controles), y la seroprevalencia fue,
respectivamente, de 15, 15, 16 y 11 %. De las mujeres ADN positivas para esos tipos
virales, la seropositiva fue de 45, 34, 51 y 28 %. El pico de seroprevalencia ocurría a la
década después de la prevalencia del ADN viral, y plantearon que el número de parejas
sexuales tenidas, eran determinantes de la seropositividad, y que ésta era independiente
del status del ADN y de la edad. Tanto la seropositividad como la seroprevalencia
mostraban los mayores valores cuando estaban presentes las lesiones de NIC 3/cáncer,
seguidos de de mujeres ADN positivas, pero seronegativas

DETECCIÓN Y TIPIFICACIÓN DEL VPH

Los estudios realizados muestran una gran variabilidad en cuanto a la sensibilidad y

especificidad de los distintos métodos utilizados en el cribado del VPH, dependiendo del
uso del método en sí, las características de la población/muestra evaluada, el tipo de
lesiones y, de gran importancia, la cantidad y calidad del material biológico. La infección
causada por este virus puede evidenciarse indirectamente mediante examen citológico o
histopatológico a partir de cambios morfológicos sugestivos o directamente mediante
pruebas moleculares que, a diferencia de los anteriores, permiten detectar el genoma y/o
identificar el tipo viral involucrado.

También se utilizan pruebas serológicas basadas en la detección de anticuerpos

circulantes y la respuesta inmunitaria al nivel celular inducida por la infección viral, que
incluyen el estudio de péptidos de las regiones E2, E4, Ll, L2, E6 y E7 de los tipos 16 y 18
de VPH y la detección de anticuerpos frente a proteínas transformantes E6 y E7
expresadas in vitro por transcripción y transducción, así como de estructuras proteicas
conformacionales de la cápside viral L1 y L2 desprovistas de ADN («virus like particles»),
con las que además se preparan vacunas de tipo preventivo. La sensibilidad de estas
pruebas es baja (entre 50-70%), en comparación a la detección de ADN viral mediante
reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Sin embargo, la detección de anticuerpos se
interpreta como un marcador de exposición persistente al VPH en mujeres normales y
está en evaluación como marcador de diseminación metastásica en pacientes con
carcinoma invasor.

En la actualidad la citología cervical es la herramienta más usada para el cribado del

cáncer cervical. No obstante, presenta un porcentaje de falsos negativos que,
dependiendo del laboratorio, puede alcanzar 20-30% de los frotis examinados. Dentro de
las limitaciones de la citología cérvico-vaginal como método convencional para la
pesquisa de cáncer cérvico-uterino caben resaltar la dificultad y elevado costo de su
automatización para reducir el error humano y la sobrevaloración de los hallazgos
citológicos; esto, a su vez, conlleva al diagnóstico de cambios atípicos ambiguos que no
pueden ser confirmados, tratamientos excesivos por Papanicolaou dudosos y manejo
inadecuado de pacientes con lesiones cervicales cuyo Papanicolaou fue negativo para la
infección por VPH y que, sin embargo, pudieran presentar una infección latente que solo
se diagnosticaría molecularmente. Entre las alternativas para superar tales limitaciones se
ha propuesto la citología en fase líquida que consiste en la preparación de suspensiones
celulares en medio líquido y obtención de láminas monocelulares (limpias de residuo y de
grumos celulares), con la lectura computarizada de los frotis.
Dada la relación causal que existe entre tipos específicos de VPH con el cáncer cervical y
las lesiones precursoras, distintos estudios han resaltado la importancia de utilizar
métodos que permitan la tipificación viral, así como las ventajas de combinar los estudios
citológicos con dichos métodos para mejorar el valor predictivo negativo (probabilidad de
que un sujeto con un resultado negativo en la prueba esté realmente sano) de la prueba
citológica convencional, permitiendo el incremento en los intervalos de periodicidad para
la realización de la misma y la disminución de los costos de programas de salud. Un valor
predictivo negativo elevado de la detección viral es muy útil en la práctica ya que, si no se
detecta el virus, la posibilidad de que se esconda una lesión de alto grado es muy baja; se
ha establecido que la evaluación de VPH de alto riesgo en combinación con una citología
vaginal negativa representa un valor predictivo negativo para la progresión de la
enfermedad a cáncer cervical mayor a 98%. Esto adquiere mayor significación tomando
en cuenta que para algunos investigadores resulta controversial la forma de atender a las
pacientes con diagnóstico de ASCUS, ya que entre 5-17% de citologías con esta
clasificación son posteriormente diagnosticadas como LIEag en la biopsia cervical 11, lo
cual refleja limitaciones en la reproducibilidad de este diagnóstico. Otros estudios
registran un riesgo de 32,5% para el desarrollo de lesiones de alto grado a partir de
lesiones ASCUS positivas para VPH tipo 16.

Tales observaciones en el diagnóstico ASCUS y las implicaciones clínicas de la infección

con VPH de alto riesgo oncogénico (especialmente el tipo 16) ha determinado que
investigadores consideren y sugieran la detección directa del VPH en estos casos
mediante pruebas moleculares, tomando en cuenta que tal identificación puede ser
importante en la estratificación del riesgo de progresión hacia lesiones más graves, para
un monitoreo y seguimiento apropiado de pacientes ASCUS. También se ha propuesto
introducir la determinación viral con procedimientos de automuestreo como técnica de
cribado primario en países subdesarrollados, donde los programas de citología son
deficitarios.

En el caso de la citología se ha reportado un valor promedio de sensibilidad de 61,3% con

una dispersión considerable (18,6-94%), lo que resalta la elevada subjetividad de este
método y justifica un control estricto de su calidad, así como la necesidad de su repetición
frecuente; esta sensibilidad incrementa con la edad de las pacientes (79,3% por encima
de los 50 años frente a 55,4% entre los 35-49 años y 48,7% por debajo de los 35 años).
En contraste, la RCP presenta una sensibilidad mayor (aproximadamente 90%), con un
intervalo más compacto (84,9-100%) que no varía con la edad, así como una
homogeneidad de los resultados significativamente superior. En ambos casos la
especificidad incrementa con la edad, aunque es más alta en la citología que en la RCP.
Se ha sugerido que la baja especificidad de las pruebas basadas en ADN de VPH en
mujeres jóvenes se debe a la alta prevalencia de infecciones transitorias en esta
población.

Los métodos moleculares de detección y/o identificación del ADN viral comprenden la ya
mencionada RCP (y sus variantes: RCP anidada, RCP múltiple, RCP y estudio de
polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción o RFLP) que puede combinarse
con hibridación o digestión enzimática de los productos de amplificación para la
tipificación viral.

Extracción y Amplificación del ADN de VPH

Para la extracción y la amplificación del ADN v í r i c o , s e u s ó e l k i t P V H f a s t d e
P h a r m a g e n ® , procediendo según las instrucciones recomendadas por el fabricante
del kit. Para evitar contaminación en la amplificación, la PCR se efectuó en tres etapas:
1) preparación de la muestra
2) ensamblaje de la reacción
3) visualización del producto.
La amplificación se realizó con cebadores de consenso o genéricos (MY09 y MY11), que
permiten amplificar un fragmento de aproximadamente 450 pares de bases (pb)
correspondientes a la región L1 del genoma viral. Esta región, a pesar de que es muy
similar entre l o s d i s t i n t o s t i p o s d e V P H , p r e s e n t a p e q u e ñ a s variaciones
en la secuencia de bases entre unos tipos y otros, lo que hace posible detectar un amplio
espectro de tipos de VPH que, habitualmente, infectan el tracto anogenital, con este único
par de cebadores y en una sola reacción.

CONCLUSIONES

La infección por virus del papiloma humano es la enfermedad de transmision sexual más
común, tanto en hombres como en mujeres y la persistencia de esta es el principal agente
causal del cáncer cervico uterino. Existe la presencia del HPV tanto en leisones pre
invasivas , denominadas LIEBG Y LIEAG así como en cáncer invasivo del cérvix. Amayor
grado de lesión mayor número de casos positivos.

Se detectó que dentor de HPV de alto riego el mas frecuente es el de tipo16 , el cual
invariablemente encabeza su presencia en cada tipo de lesión preinvasiva . Se concluye
que el HPV 16 es el mas peligroso agente causal biológico del cáncer cérvix. Esto se llego
a detectar mediante la gran variabilidad en cuanto a la sensibilidad y especificidad de los
distintos métodos utilizados en el cribado del VPH.

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