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Subas-Jurez y col.

EVALUACIN IN VITRO DEL POTENCIAL

QUIMIOPROTECTOR DE EXTRACTOS
METANLICOS Y ACUOSOS DE PLANTAS
COMESTIBLES DEL ESTADO DE QUERTARO
1

Diego E. Subas-Jurez , Rosa Mara Pia-Zentella , Rosala Reynoso-Camacho , Valentina

Serrano2, Sandra Mendoza-Daz1, Minerva Ramos-Gmez1,3. 1Departamento de Investigacin y
Posgrado en Alimentos, Facultad de Qumica; 2Escuela de Biologa, Facultad de Ciencias
Naturales. Universidad Autnoma de Quertaro, Cerro de las Campanas, 76010 Quertaro,
3
Qro. Autor principal: ramosgomezm@yahoo.com

RESUMEN
El cncer es una de las principales enfermedades crnico-degenerativas a nivel
mundial y, en Mxico, las tasas de mortalidad por cncer muestran tendencias
crecientes en las ltimas dcadas. Estudios epidemiolgicos y en animales indican
que un mecanismo importante en la prevencin del cncer por componentes de
vegetales, se basa en la induccin de enzimas de fase 2, como la quinona reductasa
(QR), favoreciendo la eliminacin de los txicos y sus metabolitos del organismo. Por
lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de plantas comestibles
para inducir enzimas de destoxificacin en clulas transformadas de hgado de ratn
Hepa 1c1c7. Las clulas fueron sembradas (20,000 clulas/pozo) y tratadas por 48
horas con medio que contena las diferentes concentraciones (0.0 8.0 mg/ml) de los
extractos acuosos y metanlicos de Amaranthus hyspidus (quelite de pollo), Brassica
rapa (nabo), Rumex crispus (lengua de vaca), Portulaca oleraceae (verdolaga) y Yuca
filifera (yuca), usando como control positivo el agente quimioprotector sulfurofano. La
actividad de QR se determin mediante la tcnica establecida por Prochaska y
Santamara (1992) y la concentracin de protena por el mtodo de BCA. La actividad
de QR se increment significativamente (140%) con el sulfurofano (2.5 M),
comparado con el control negativo. Solamente se observ un incremento del 17% en
la actividad de QR con el extracto acuoso de la verdolaga (0.5 mg/ml). Asimismo, los
tratamientos con los extractos metanlicos de quelite de pollo, nabo, lengua de vaca y
verdolaga incrementaron la actividad de QR en un 74 (0.1 mg/ml), 49 (0.1 mg/ml), 20
(0.05 mg/ml) y 29% (0.1 mg/ml), respectivamente. Por otro lado, el extracto metanlico
de la yuca result altamente citotxico a concentraciones mayores de 0.1 mg/ml. Los
resultados obtenidos en el estudio son de gran importancia dado que constituyen la
base para los estudios de quimioprevencin in vivo.
Palabras clave: Induccin de enzimas de fase 2, extractos de plantas comestibles, clulas
Hepa 1c1c7.

INTRODUCCIN
En las ltimas dcadas, Mxico ha mostrado una marcada tendencia creciente
en las tasas de mortalidad por cncer (SSA, 2005). Hbitos tales como el fumar y el
consumo de alcohol, as como la exposicin a agentes carcingenos naturales y
sintticos, radiacin, algunas drogas y agentes infecciosos, son reconocidos
extensamente como contribuidores importantes en la teologa del cncer (Devita y col.,
1997).
Un mecanismo importante en la prevencin del cncer se basa en el balance entre las
enzimas de fase 1, que activan carcingenos, y las enzimas de fase 2, las cuales
destoxifican los productos o metabolitos de los mismos. Prestara y col. (1993)

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proponen que algunos anticarcingenos presentes en la dieta pueden inhibir la

activacin de carcingenos por un balance competitivo entre la activacin del
carcingeno por enzimas de fase 1 y la destoxificacin por enzimas de fase 2, tales
como la glutatin Stransferasa (GST) y quinona reductasa (QR), entre otras.
El empleo de fuentes vegetales con capacidad para inducir enzimas de
destoxificacin de fase 2 se basa en estudios epidemiolgicos que sugieren que un
alto consumo de vegetales verdes y amarillos, especialmente de la familia Cruciferae y
del gnero Brassica (coliflor, berros, col, brcoli), reduce el riesgo de desarrollo de
cncer en varios rganos. Por otra parte, el consumo de vegetales o de algunos de
sus componentes qumicos, tambin protege contra la carcinognesis inducida
qumicamente en roedores. As mismo, evidencias bien fundamentadas establecen
que la alimentacin con ciertos vegetales inducen enzimas de fase 2 en tejidos y
rganos de animal (Zheng y Wang, 2001). Adems, la vasta flora mexicana ofrece la
oportunidad de obtener una amplia gama de compuestos fitoqumicos que pueden
formar parte de las diferentes estrategias en la prevencin del cncer.
Diversos estudios demuestran que la lnea celular Hepa 1c1c7 responde a casi
todos los compuestos que inducen enzimas de fase 2 (QR y GST) en roedores, siendo
un estimador confiable del agente inductor en los varios rganos de roedores. Debido
a ello, las clulas transformadas de hgado de ratn Hepa 1c1c7 se utilizan
ampliamente como una herramienta para examinar la relacin funcin-estructura de
compuestos con potencial para inducir enzimas de fase 2 in vitro (Uda y col., 1997).
Debido a la gran diversidad vegetal que se encuentra en la zona del estado de
Quertaro, as como la informacin existente en el uso de las plantas para consumo
directo en la dieta, el presente estudio justifica la realizacin de estudios sistemticos
sobre plantas comestibles como una fuente potencial de compuestos fitoqumicos con
capacidad para inducir enzimas de fase 2.

MATERIALES Y MTODOS
Qumicos. El agente inductor sulfurofano y el dimetilsulfxido (DMSO), as
como los reactivos para las determinaciones enzimticas tales como la albmina
bovina (BSA), dicumarol, flavn-adenin-nicotinamida, glucosa-6-fosfato, glucosa-6fosfato deshidrogenasa de levadura, tetrazolium (MTT), nicotin-adenin-difosfato y
Tween fueron de la marca Sigma (St. Louis, MI, EUA). Los reactivos para el
mantenimiento y crecimiento de la lnea celular, tales como el medio mnimo
modificado de Eagle (DMEM), antibiticos, antimicticos, tripsina, L-glutamina,
solucin salina de buffer de fosfatos (PBS) y el suero fetal bovino fueron de la marca
Gibco (Canad). Los dems solventes y los reactivos fueron de la marca JTBaker. El
kit para la cuantificacin de protena (mtodo BCA) fue de la marca Pierce (Rockford,
IL).
Plantas. Las plantas incluidas en el estudio fueron: Amaranthus hyspidus
(quelite de pollo), Brassica rapa (nabo), Rumex crispus (lengua de vaca), Portulaca
oleraceae (verdolaga), Yuca filifera (palma), las cuales fueron colectadas en el
Municipio de Pedro Escobedo, Quertaro (Ramos y col., 2004). El material fue
desecado en una estufa a 39 C y posteriormente pulverizado. Diez gramos de cada
especie se extrajeron por maceracin usando hexano-acetona 1:1 o agua como
disolvente. El extracto fue recuperado, concentrado al vaco a sequedad y guardado
bajo atmsfera de argn a 4 C y protegidos de la luz.

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Tratamiento de las clulas Hepa 1c1c7 con los extractos. Las clulas fueron
cultivadas en medio DMEM enriquecido con suero fetal bovino (10%) y antibiticos e
incubadas a 37C con una atmsfera de 5% de CO2 hasta alcanzar una confluencia
del 80-90%. Las clulas fueron lavadas y tripsinadas para su resuspensin a una
concentracin de trabajo (200,000 clulas/ml) en microplacas de 96 pozos. Las placas
fueron incubadas por 24 h y posteriormente tratadas con diferentes concentraciones
de los extractos (0-8 mg extracto/ml DMEM), de acuerdo a lo propuesto por Prochaska
y col. (1992), incluyendo un control positivo (sulfurofano, 0-10 M en DMSO). Al
trmino de 48 h de incubacin, las clulas se lisaron para la determinacin de QR.
Determinacin enzimtica de QR y cuantificacin de protena. El ensayo de
potencia inductora se basa en la reduccin enzimtica del colorante MTT por la
enzima QR dando como resultado un precipitado azul-caf, el cual puede medirse a
610 nm despus de 5 minutos de reaccin (Prochaska y col., 1992). La cuantificacin
de protena se realiz por el mtodo de BCA despus de una incubacin de 30
minutos a 37C a 562 nm, empleando BSA como estndar. La actividad especfica de
QR fue expresada en nmoles de producto /min/mg de protena.

RESULTADOS
Las frutas y los vegetales pueden contener sustancias con ciertas propiedades
que directa o indirectamente pueden reducir, proteger o eliminar la actividad
carcinognica de otros compuestos. Las propiedades quimioprotectoras de estos
alimentos pueden estar asociadas a la induccin de enzimas de fase 2 (QR). En base
a los resultados del presente estudio se observa que el agente sulfurofano, compuesto
naturalmente presente en vegetales como el brcoli, incrementa significativamente (P
< 0.05) la actividad de QR hasta en un 240% (165.18 7.43 nmol/mg min) a una
concentracin de 2.5 M, comparado contra el control negativo (68.99 9.04 nmol/mg
min). A la concentracin de 10 M, el sulfurofano slo incrementa la actividad de QR
en un 45% (100.04 24.42 nmol/mg min), mientras que la densidad celular (expresada
en mg de protena) se reduce hasta en un 46%, sugiriendo cierto efecto citotxico del
sulfurofano a concentraciones mayores.
En la Figura 1A se muestra la potencia inductora de los extractos acuosos a las
diferentes concentraciones evaluadas (0-8 mg/ml). El nivel mximo de actividad de QR
en las clulas Hepa 1c1c7 fue obtenido a las concentraciones de 0.5 mg/ml (5.1 %,
103.74 2.49 nmol/mg min), 0.05 mg/ml (3.5 %, 102.22 3.33 nmol/mg min), y 0.5
mg/ml (16.9%, 115.41 2.64 nmol/mg min) para los extractos acuosos de A. hyspidus,
B. rapa y P. oleraceae, respectivamente, comparado con el grupo control (98.72 4.26
nmol/mg min), observndose adems poco o nulo efecto citotxico a estas
concentraciones.
En lo que respecta a la potencia inductora de los extractos metanlicos, se
observ un efecto negativo sobre el crecimiento celular a concentraciones mayores a
1.0 mg/ml. Por lo tanto, se decidi trabajar con concentraciones menores de 1.0
mg/ml. Los resultados muestran que los tratamientos con los extractos metanlicos de
A. hybridus, B. rapa, R. crispus y P. oleraceae incrementaron la actividad de QR en un
74 (0.1 mg/ml), 49 (0.1 mg/ml), 21 (0.05 mg/ml) y 29% (0.1 mg/ml), respectivamente
(Figura 1B). A estas mismas concentraciones, la densidad celular se vio disminuida en
un 20% para los extractos de A. hybridus, B. rapa y P. oleraceae, y solamente en un
6% para el extracto metanlico de R. crispus. Por otro lado, el extracto metanlico de
la yuca (Y. filifera) result altamente citotxico a concentraciones mayores de 0.1
mg/ml, no mostrando induccin de la actividad de QR a ninguna de las
concentraciones evaluadas.

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A
)

Subas-Jurez y col.
B
)

Figura 1. Potencia inductora de los extractos acuosos de Amaranthus hyspidus, Brassica rapa y
Portulaca oleraceae (A) y metanlicos de Amaranthus hyspidus, Brassica rapa, Rumex crispus, Portulaca
oleraceae y Yucca fillifera (B) sobre las clulas Hepa 1c1c7, medida como la actividad especifica de QR
del tratamiento sobre control. Indica diferencia estadstica significativa con respecto al control, de
acuerdo a la prueba estadstica de Dunnett (=0.05).

DISCUSIN
Diversos estudios in vivo e in vitro han mostrado que una gran variedad de
compuestos de la dieta o sus metabolitos pueden inducir la activacin de sistemas de
destoxificacin (Hashimoto y col., 2002). Adems, agentes inductores de la enzima QR
pueden tambin inducir toda una batera de enzimas de destoxificacin y protenas
antioxidantes, por medio de las cuales se eliminan una gran diversidad de
carcingenos (Talalay y col., 1988). En el presente trabajo la prueba de potencia
inductora fue empleada para evaluar la capacidad de los extractos acuosos y
metanlicos de plantas comestibles en el estado de Quertaro para inducir enzimas de
destoxificacin de fase 2 (QR), empleando sulfurofano como control positivo.
Previos trabajos muestran que el sulfurofano induce arresto del ciclo celular y
subsecuentemente muerte apopttica en la lnea celular de cncer de colon humano
HT29 a concentraciones de 10-30 M (Gamet-Payrastre y col., 2000), tambin inhibe
el crecimiento de clulas MIA PaCa-2 (5 M) y MIA PaCa-2 y PANC-1 (10 M),
mostrando adems un incremento en la concentracin de especies reactivas del
oxgeno (Pham y col., 2004). Estos resultados indican que el efecto citotxico del
sulfurofano observado en el presente estudio es mediado posiblemente a travs de un
estrs oxidativo.
Los extractos acuosos de A. hyspidus, B. rapa y P. oleraceae mostraron tener
una actividad inductora de QR muy baja en comparacin con los extractos
metanlicos. Una de las explicaciones por las cuales no se observa una induccin
significativa de las enzimas de fase 2 con los extractos acuosos, es posiblemente que
la cantidad de compuestos fenlicos u otros metabolitos que presenta cada planta es
diferente y cada compuesto tiene propiedades diferentes, o bien, estos compuesto
estn presentes en forma glicosilada y, por lo tanto, no estn disponibles para ser
incorporados dentro de las clulas.
Aunque ciertas familias de vegetales son consideradas como las ms potentes
(ej. Cruciferae y Brassicaceae), en el presente estudio se observa que el extracto
metanlico de A. hyspidus (familia Amaranthaceae) fue el mejor inductor comparado
con los extractos metanlicos y acuosos de otras plantas. Sin embargo, estos
resultados son de suficiente importancia dado que los extractos no son puros y se ven

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influidos por las condiciones de extraccin y su composicin de mezclas

heterogneas. Por otra parte, no existe acervo bibliogrfico con informacin sobre
ensayos de potencia inductora para los extractos de plantas comestibles probados en
el presente estudio.

CONCLUSIONES
Las plantas comestibles en el estado de Quertaro seleccionadas contienen
una amplia variedad de metabolitos, algunos de los cuales son inductores de enzimas
de fase 2. Aunque un simple mecanismo no puede explicar todas las formas de
quimioprevencin, est claro que la induccin de enzimas de fase 2 (ej. QR y GST) es
un mecanismo importante de proteccin contra agentes txicos y efectos neoplsicos
de carcingenos qumicos. Por lo tanto, el presente trabajo contribuye a la
identificacin de fuentes vegetales de la regin con gran potencial para la prevencin
y/o tratamiento del cncer.

REFERENCIAS
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