TRANSFECCIONES

Conjugacin:
Plsmidos, entre bacterias, requiere contacto con
intervencin de estructuras especializadas.
Transduccin:
Transferencia de material gentico mediada por
bacteriofagos.
Transformacin
La introduccin de DNA desnudo o libre en el medio
en procariontes y levaduras (eucariontes no
animales).

Transfeccin:
Introduccin de DNA forneo a la clula eucarionte,
mediante plsmidos, vectores vricos, etc.
*Mtodos no virales en clulas de mamferos.

Mtodos de transfeccin

TRANSFECCION

Mtodos Biolgicos

Virus.

Mtodos Qumicos

Polmeros catinicos, Fosfato clcico, lposomas.

Mtodos Fsicos

Electroporacin, Laser, Biolstica, Inyeccin.

Mtodos Biolgicos
Retrovirus
Virus de RNA. Insertos relativamente grandes (un
mximo de 8 Kb).
Los virus inyectados integran su DNA en el genoma
del hospedero.
Tienen una alta eficacia de transduccin y tambin
de expresin.

Para infectar clulas del hospedero que se

encuentran en divisin.
La integracin en el genoma es al azar.

Ejemplo: leucocitos humanos que carecen de

adenosina desaminasa (ADA) se reparan por infeccin
viral)

Adenovirus
Causan infecciones
humano.

en

el

tracto

respiratorio

Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 Kb.

de DNA exgeno.
No se integra el material gentico.
No necesitan que las clulas estn dividindose.

 Alta eficacia de transduccin.

Expresin transitoria.
Producen respuesta inmune.

Virus adenoasociados (VAA)

Requieren la coinfeccin con un adenovirus.
Combinan las ventajas de los retrovirales y los
adenovirales. Su capacidad es slo de 5 Kb.
Integran su DNA.
Infectan tanto a clulas en divisin como a las
que no lo estn.

 No estn implicados en enfermedad humana*.

No ha sido tan bien estudiado como los retrovirus
y los adenovirus.

Herpesvirus
Sus clulas diana son las neuronas.
Su complejidad y la falta de conocimiento dificulta
su utilizacin.
Una gran ventaja es el gran tamao del DNA.

Mtodos Qumicos
Polmeros catinicos

-Polibreno-DMSO
Cubre al DNA favoreciendo su insercin a la
membrana.
El DMSO (dimetil sulfoxido). Tratamiento breve
de choque que permeabiliza la membrana.

-DEAE-dextrano (dietil aminoetil dextrano)

Similar al anterior.
Para transfecciones transitorias.

Fosfato clcico
-Por mucho tiempo el mas extendido.
-Hasta un 90% incorporan el DNA a la clula.
-Transfecciones estables y transitorias.
-En muchos casos menor del 1% del DNA llega al
ncleo.

-Toxicidad mnima.
-Mecanismo: endocitosis.

Liposomas
Forman complejos con el DNA.
Estn formados por un lpido negativamente
cargado y un colpido (lpidos ayudantes: DOPE,
DOPC).

Lipofectina (Mezcla de cloruro de N-[1-(2,3dioleyiloxy))propil]-N-N-N-trimetil amonio

DOTMA- y DOPE).
DNA y lipofectina interaccionan espontneamente
formando complejos con una alta eficiencia.

Ofrecen un grado de proteccin al DNA de procesos

degradativos.
Pueden llevar grandes cantidades de DNA.

Metodo Fsicos
Electroporacin
Clulas sometidas a corriente elctrica.
La eficiencia depende del pulso elctrico, distancia
entre electrodos, fuerza inica del buffer y la
naturaleza de las clulas.

Se tiene una elevada mortandad celular.

Hay que ajustar para cada tipo celular.

Laser
Forma poros en las membranas.
Radiacin intensa que se puede dirigir
estructuras celulares de manera controlable.
Inconveniente. Equipo muy sofisticado.

Biobalstica
Bombardeo de partculas, transferencia gnica por
microproyectiles o gene-gun.
El DNA recubre micropartculas de oro o tungsteno
de 1-3 micras de dimetro.

Libera dosis controladas de DNA.

Produce dao en la clula.

Inmunizacin basada en DNA contra HIV, hepatitis

B y C, papiloma, Helicobacter pylori, malaria, etc.

Inyeccin DNA
Tamao del DNA: 2-19 kilobases.
Se evita la degradacin lisosomal y citoplasmtica
del material.
Tcnica laboriosa que requiere clulas bien
aisladas.

Variantes segn organismo, etc.

La preinyeccin de soluciones de sacarosa en el
msculo incrementa algo los niveles de expresin.
El msculo de primates parece ser menos eficiente
en la incorporacin del DNA que el msculo de
roedores.

Comparacin entre vectores

Retrovirus

Adenovirus

HSV

AAV

Liposomas

Biobalistica

Inyeccin

Tamao del
inserto (kb)

>20

<4

>20

>20

>20

Integracin*

si

no

no

si*

no

no

no

Clulas
quiescentes

no

si

si

si

si

si

si

variable

requiere
tejido
expuesto

pobre

In vivo

pobre

alta

alta

alta

Objetivos de las transfecciones

Expresin de protenas para su purificacin, etc.

Expresin de protenas para estudiar su efecto
sobre el fenotipo celular.
Estudio de promotores y elementos regulatorios.
Estudio de mecanismos involucrados en
procesamiento del RNA, postraduccionales, etc.

el

Problemas que pueden surgir de expresar

protenas en sistemas procariontes

Inestabilidad
Sin actividad biolgica
Contaminantes procariontes
Caractersticas bioqumicas diferentes

Transfeccin estable y transitoria

Estable
Integracin del DNA en el genoma de las clulas
receptoras.
No desaparece con el tiempo.
Se asegura la expresin permanente.
Requiere de un marcador de seleccin en el
vector.

Transitoria

El DNA introducido permanece en forma de

plsmido en el citoplasma (48-72 horas).

Tiene un mximo de expresin (48 horas).

Desaparece al cabo de unas generaciones.

Anlisis rpido.

Mltiples propsitos.

Anlisis de secuencias regulatorias.