3er Parcial

Sistema nervioso central

Introduccin
Las estrategias en terapia gnica para el SNC difieren de las usadas en otros sistemas

Por qu?
Las clulas estn totalmente diferenciadas
Tienen una larga vida
Y al parecer no pueden ser reemplazadas

Cul es la diferencia?
Cada enfermedad afecta a un tipo celular especfico
Lo que da caractersticas patofisiolgicas

Transferencia de genes en el SNC

Entrega directa en el cerebro va un vector

Transformar clulas y transplantar en el cerebro
Importante
o Diferentes enfermedades afectan la funcin de un tipo celular especfico
o Diferentes enfermedades rompen la comunicacin clula- clula

5 preguntas para la Terapia Gnica

1. Cul vector usar?
Todos los vectores son viables
Todos permiten una expresin a corto plazo
Altos niveles de expresin del transgn
Limitante
El sistema inmune
Expresin a largo plazo
HIV
Pseudotipo
Se expresa por largos periodos de tiempo
Se integra a neuronas postmitticas

Baja capacidad, bajas concentraciones y no selectivo

AAV
Integran y expresan transgenes en clulas postmitticas
Capacidad
Respuesta inmune
Transplantes
Stem cell
Enfermedades neurodegenerativas
Limitaciones:
o Respuesta inmune
o Readministracin del transgen
2. Cuntas neuronas se necesita transducir?
Independientemente de la causa de la enfermedad neurolgica, la prdida neuronal
depende del estado de progresin
Se divide en dos:
Hereditarias
No hereditarias
Se puede hacer un diagnstico temprano?
Hereditarias
Diagnstico temprano
Posibilidad de dar un tratamiento preventivo
Posibilidad de proteger la capacidad del cerebro
Terapia Gnica fetal?
No hereditarias
Problema: diagnstico presintomtico
Es importante que cuando se observen los sntomas usar tratamiento farmacolgico
Para que la Terapia Gnica funcione no debe haber gran muerte neuronal
Ventaja: El cerebro puede resistir cierta cantidad de dao
3. Cules neuronas?
Las manifestaciones patolgicas revelan una alteracin especfica en la funcin de un tipo
celular
En algunas ocasiones afecta a las neuronas y sin afectacin gla y astrocitos
4. Cunto se necesita del transgn?
Para predecir el nivel de expresin requerimos de:
Cunto se necesita para mantener las condiciones normales
Qu porcentaje del total de la poblacin celular blanco puede contener el transgn
5. Por cunto tiempo?
En tumores cerebrales, la expresin del transgn es limitada a las 1-2 semanas
Enfermedades neurodegenerativas, se necesita expresin por ms tiempo
Retos sin resolver
La respuesta inmune

Tanto los vectores de Adenovirus como el HSV-1, tienen respuesta inmune va

intraparenquimal
Pero tambin cuando son administrados por va perifrica

Hacia donde va
Tumores cerebrales
Porqu?
Se necesitan nuevas terapias
Mayor supervivencia
Se pueden usar retrovirus, adenovirus y virus del herpes simple
1era generacin
Retrovirus que son insertados dentro del tumor
Al parecer los pacientes sobreviven y hay una regresin significativa del tumor
Desventajas: hemorragias intratumorales
2da generacin
Incluye remocin del tumor, seguida de inyeccin del vector
Se est tratando de estandarizar al tipo de tumor y la etapa
Tambin se incluye radioterapia
Transplantes de mdula espinal
Para enfermedades metablicas:
Terapia de reemplazamiento de enzimas
Se han observado grandes avances en el transplante de clulas modificadas
Huntington
Parkinson
Blanco

Transgn

Mtodo

Parkinson
Terapia Gnica
Introduccin
Caracterstica: degeneracin de las neuronas dopaminrgicas
Cerca del 90 -95% de los casos de Parkinson no tienen bases genticas
Mutacin en el gen Parkina
Se especula que hay una interaccin deficiente entre las neuronas y la gla
Hechos
Presencia de neuroinflamacin en:
Puente, ganglios basales, estriado, corteza frontal y temporal
Tambin se ha observado alta concentracin plasmtica de citoquinas pro-inflamatorias
Cuerpos de Lewy y neuritos de Lewy
Responsables?
Gen de la parkina
Protena sinuclena
Radicales libres
Mltiples genes y protenas

Ventajas
Se cuenta con modelos experimentales

Lesin selectiva
Ratones KO

Es un grupo especfico neuronal

Se conoce la causa y patologa de la enfermedad

Terapia Gnica
A quin va dirigida?
Restaurar los niveles de dopamina endgena
Evitar la formacin de cuerpos de Lewy (contra -sinucleina)
Prevenir la inflamacin
Factores neurotrficos

Vectores

Lentivirus
Virus del herpes simple
Nanopartculas
Adenovirus y adenovirus asociados

Gen
Function
Vector
Phase
Institute
Dose
Number of subjects
Target
PET tracer

Alzheimer
Terapia Gnica

Introduccin
Caractersticas
Formacin de placas extracelulares de AB
Neurofibrillas de protena Tau

Mutacin en el gen APP

Donde
Emociones que median memoria y cognicin
Al parecer si hay factor gentico

Hechos
Presencia de agregados neurofibrilares en regiones como hipocampo, corteza frontal
Presencia de neuroinflacin
Mltiples genes con mutaciones

Posibles causas
Gen de la APP
Gen que codifica para las presenilinas
Protena Tau
Protena ApoE

Ventajas del estudio

Se cuenta con modelos animales y paradigmas de estudio

Inducida
Ratones con modificaciones

Se conoce que afecta a un grupo neuronal, al inicio de la enfermedad

Se conoce la progresin de la enfermedad

Terapia Gnica
Objetivo

Disminuir la produccin de BA

Aumentar la remocin de BA

Uso de una vacuna

Vectores

Lentivirus
Adenovirus y AAV
Retrovirus

Huntington
Introduccin
Es una enfermedad neurodegenerativa
Su causa es la expansin de repetido CAG en el gen de la huntingtina (Htt)
El HD es autosmica dominante

Caractersticas
Muerte neuronal
Demencia
Disfuncin motora

Importancia de la Htt

Mecanismo
Mitocondria?

Facilidades de estudio
Modelos animales de estudio

Inducido
Ratones transgnicos

Afectacin a un grupo neuronal especfico

Un gen especfico

Terapia
Therapeutic target for HD
Huntingtin proteolysis
Huntingtin aggregation
Mithocondrial dysfunction
Exototoxicity
Transglutaminase activity
Vaccine toxic proteins
Inflammation

Epilepsia
Introduccin
Es uno de los desastres neurolgicos con ms prevalencia en el mundo
Su caracterstica es cambios en la actividad elctrica del cerebro

Se piensa que es debida a:

Cambio en los canales inicos de K+, Na+, y Ca2+
Decremento la transmisin inhibitoria
Aumento en la transmisin excitatoria
Deficiencia en diversos NT y neuromoduladores

Facilidades de estudio
Modelos animales

Inducido
Ratones transgnicos

Diversos blancos teraputicos

Dirigida a dos blancos:
Disminucin la aparicin de las crisis
Disminuir y/o prevenir la neurodegeneracin

Dos posibilidades

Transplantes de clulas (con o sin modificacin)

Uso de vectores
o AAV
o Retrovirus

Terapia Gnica
Adenosine
Neuropeptide
GABA
Galonin

Fetal cells
Viral vectors
Encapsulated cells
Adult stem cells
Embryonic stem cells

Transplante de clulas

Opciones
Clulas modificadas para liberar neurotransmisores inhibitorios o componentes neuroactivos
Fibroblastos para liberar adenosina encapsulada en polmeros semipermeables
Clulas corticales para producir GAD65
Clulas embrionarias de NA, S-HT y AGth

Esquizofrenia
Introduccin

Interrupcin en esquizofrenia 1 (DISC-1) es un intrn 8 truncado, el cual propicia enfermedad

mental como esquizofrenia, depresin y desrden bipolar

DISC-1 es una protena en espiral que forma un complejo con PDE4, NDEL1, LIS1, que estn
involucradas en la asociacin ncleo-centrmero, proliferacin neuronal, diferenciacin y migracin

Mtodo
Generacin de transgnico de DISC-1
Uso de BAC que contiene 148 Kb que compromete los exones 1-8 de DISC1

Mltiples mediciones morfolgicas y de crecimiento neuronal

Pruebas conductuales

Neurotensin Polyplex as efficient

Mtodo
Poliplex de neurotensina

Receptor NST1
Con un promotor especfico de tejido: hDAT
Con hGDNF
Modelo de hemiporfinson con 6-OHDA
Cuantificacin de conducta de giro inducida
Cuantificacin de dopamina por HPLC

The transfection of BDNF to Dopamine Neurons Potentiates the Effect of Dopamine D3 receptor
against recovering the striatal innervation, dendritic spines and motor behavior in an aged rat model
of Parkinsons disease
Luis F. Razgado-Hernandez, Armando J. Espadas Alvarez, Patricia Reyna Velazquez
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4332861/pdf/pone.0117391.pdf

Enfermedades hereditarias
La terapia gnica ha tenido diversos problemas para ser aplicada en humanos

Debido a dos factores:

El crear nuevas alternativas teraputicas, desde la primera prueba clnica a una aplicacin real
vara entre 20 a 50 aos
Transferencia gnica con vectores, an se sigue investigando

AAV9

Hemofilia
Existen dos tipos:
Hemofilia A, deficiencia en factor VIII
Hemofilia B, deficiencia en factor IX

Su caracterstica es ser una enfermedad recesiva hereditaria

Los factores
La coagulacin de la sangre incluye mltiples mecanismos y una decena de factores
procoagulantes y reguladores
Pero el factor crtico es el IX y el cofactor VIII, los cuales son responsables de la activacin del
factor X

El factor IX
Es una glicoprotena plasmtica de 415 aa
Es producido por los hepatocitos
La concentracin normal en humanos es de 45g/ml-1

Caractersticas
Es un desrden asociado al cromosoma X
Afecta a 1 de cada 30000 hombres
Se divide de acuerdo a concentraciones en:
Baja 5-25%
Moderada 1-5%
Severa <1%

Facilidades de estudio
Se puede cuantificar
Ensayos de coagulacin

Modelos de estudio
No se requiere regulacin del transgen
Se puede sintetizar por otros tejidos
El F9 es relativamente pequeo (1.4 kb)
El F8 es de >8kb

El objetivo de la terapia
Mantener los niveles del factor mayores a uno
Con esto se pueden ver mejoras en la enfermedad

Condiciones para la terapia gnica

Desarrollo de un sistema de transferencia gnica que tenga alta eficiencia
Produccin estable del transgen en circulacin y en niveles teraputicos por aos
Mtodo seguro a corto y largo plazo
Mtodo durable y prctico (no invasivo)

Vectores
Retrovirus
Adenovirus

Vectores
Retrovirus
Tiene expresin a largo plazo
En modelos caninos de hemofilia B, se ha visto una recuperacin en la expresin de F8, por 5
meses

Se ha logrado una correccin total de F8, en modelo roedor de hemofilia

Retrovirus
Usando altas dosis de retrovirus y con replicacin competente del virus del 1% (vector)

Adenovirus
Traduce eficientemente en hepatocitos in vivo

1era generacin
Alta inmunidad
An as se observa mejora sostenida de 3-5 meses, en F8 y F9
Pero la eficacia cambia en animales ms grandes (3 semanas)

Adenovirus
Gutted:
Correccin sostenida con una dosis de 3x1012 vp/kg se ha observado en modelo ratn de hemofilia
A
Se ha utilizado F8 humanos a dosis de 4-3x101* vp/kg, pero experimentan inflamacin y fiebre

AAV
Si tiene el espacio suficiente para codificar la secuencia de F8 y F9

Vectores dirigidos a msculo

Codificando para F9 y con el promotor del CMV
Y dosis de 20-300 ng/ml alcanza niveles teraputicos

AAV
En fase I/II:
Inyeccin intramuscular de AAV
Dosis de 2x1011 vg/kg
No se observa toxicidad
Expresin sostenida hasta x (2 o 7?) aos

El problema, el nmero de inyecciones

Mtodos no virales
Transplantes de fibroblastos que traducen para F8
Solo muestran efectos modestos y temporales
Es bien tolerado
Los obstculos

El implante de las clulas

Inactivacin del promotor
Fibrosis
Respuesta inmune

Avances recientes
ltimos 3 aos
El uso de vectores lentivirales

Promotor especfico para hgado

Expresar a largo plazo y estable de F9. Alcanzando niveles teraputicos

AAV
Promotor especfico para hgado

Resumen
In vivo
Inyecciones intravenosas, musculares, en otros tejidos

Quedan algunas preguntas

Cunto del rgimen inmunosupresor es suficiente para bloquear la respuesta inmune?
Por qu cambia la sensibilidad al pasar a humanos?

Fibrosis qustica
Es la enfermedad letal ms comn en poblacin caucsica
Aproximadamente 1 de cada 20 personas es portadora asintomtica
La expectativa de vida es de 29 aos
Es autosmica recesiva

Caractersticas
Dificultad para respirar
Infecciones pulmonares crnicas
Acumulacin de moco espeso y pegajoso
Alta concentracin de sal
En casos severos necesita transplante de pulmn

Causa
Mutacin en el gen de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR)
La protena CFTR

Mutacin en el gen CFTR

El gen se localiza en el cromosoma 7 en la posicin 7q31.2
La mutacin ms comn es la delecin de 3 bp para el exn 10
Falta una fenilalanina en la posicin 508

Fallo en el transporte celular y localizacin de la protena en la membrana

Se ha descrito ms de

Objetivo de la terapia
Insertar una copia normal del gen CFTR en las clulas afectadas

Vectores
Adenovirus

Adenovirus Asociados
Liposomas
Lentivirus

Excepcin
Los retrovirus no son aplicados a la fibrosis qustica ya que nace

Adenovirus
El candidato ideal para la transferencia gnica en vas areas
Los humanos permiten al husped

Adenovirus asociado
Se ha demostrado que las cpsides de los serotipos 1,5 y 6 son ms eficientes para traducir
clulas epiteliales
Se necesitan re-administracin pero la eficacia sigue siendo baja

Se ha demostrado eficiencia en administracin nasal

Virus recombinante
Virus Sendai (SeV)
Muy eficiente para traducir clulas epiteliales (virus competente)
Pero se mantienen aun siendo incompetente

El vector SeV

Lentivirus
El pseudotipo con envoltura de glicoprotenas de virus bola
Traduce de manera eficiente
Su expresin es hasta 50 semanas

Mtodos no virales

Polmeros con nanopartculas de DNA

Se ha usado con xito en ratones de pulmn por medio de electroporacin
Fuerza magntica para incrementar la transferencia
Sonoporacin en pulmn

Adminis Adenovirus
tracin intranasal
Ventajas y estudios
Fcil acceso
Para la transferencia gnica y mediciones

Reduccin de riesgo

Adenovirus
Expresin de cDNA de CFTR
Se presenta inflamacin
En otros pacientes se encuentra una recuperacin del 30%

Estudios
Liposomas catinicos
Seguros
Se ha utilizado DNA y RNAm de CFTR
Reduccin de un 20%
Expresin transitoria, solo 7 das