Tema 1

andres.aguilera@cabimer.es

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EL ADN Y MTODOS BSICOS EN GENTICA MOLECULAR.
La forma B de la doble hlice de ADN son dos cadenas polinucletidas antiparalelas, compuesta por cuatro bases.
Su dimetro es de 20A, una vuelta mide 34A y cubre 10.4 pv/vuelta. El surco mayor tiene 22.4A y el menor tiene 12.
In vitro pueden desarrollarse dos formas ms de hlice; la Z (levgira) y la A (cuando falta agua, 28A por vuelta).
Existen otras bases que son;

Tienen la capacidad de confundir al sistema e incorporarse al ADN como elemento extrao. Las propiedades de
emparejamiento de estas bases son diferentes, introduciendo mutaciones.
HIDRLISIS ALCALINA:

ESTRUCTURAS SECUNDARIAS:
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La forma de HORQUILLA que se realiza por el emparejamiento debido a un palndrome puede servir de diana
para reconocimiento de protenas. Es muy poco estable, y puede formarse durante la replicacin, aunque para
ello existe la protena de unin a la cadena simple.
La TRIPLE HLICE, y la TETRA HLICE que es exclusivamente en agrupaciones de guaninas.

TOPOLOGA DEL ADN:

Superenrollamiento condicionado por las

topoisomerasas. Es positivo si va hacia el mismo sentido que la doble hlice,
y negativo si al contrario. Las zonas de superenrollamiento negativo tienen
ms tendencia a abrir las dos cadenas de ADN, relajndolas.
Cuanto ms laxa sea la cadena, ms lento migrar en un gel.
Cuando se introduce un ADN intercalante, se elimina una vuelta, y se
puede observar una forma de escalera en un gel.
Cuando se enrolla en la misma direccin que el ADN, pero la molcula no
se mueve en sus extremos, se produce un superenrollamiento positivo en
uno de los extremos y un superenrollamiento negativo en el otro. Esto es
un desplazamiento del enrollamiento. Este hecho ocurre cuando la
molcula se est replicando y la helicasa abre las hebras. Para eliminar el
superenrollamiento es necesario cortar una o las dos hebras, trabajo
llevado a cabo por las topoisomerasas, que abre, corta y pega.
DESNATURALIZACIN Y RENATURALIZACIN: Se debilitan los
puentes de H, cuyas condiciones de temperatura depende del porcentaje de C-G, cuyas uniones son tres (ms
complicada de separar).

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PROPIEDADES FISICOQUMICAS DE LOS CIDOS NUCLEICOS:

El pico de absorbancia a 260 nm es mayor en las cadenas simples de ADN que en las dobles cadenas.
La Tm se encuentra en torno a los 70C, pero aumenta a medida que lo hace el porcentaje de C+G.
VISUALIZACIN DEL ADN: Bromuro de etidio y el gel red.
HIBRIDACIN DEL ADN: Southern

ACTIVIDARES MODIFICADORAS DEL ADN:

ENDONUCLEASAS: Enzimas de restriccin. Son

diferentes a las exonucleasas porque no necesitan un
extremo libre para actuar. Pueden ser de cadena sencilla o
doble. Cortan.
EXONUCLEASAS: Actan a travs de un extremo, ya sea
el 5' phosphate, o el 3' OH.
GLICOSILASAS: Rompen la unin de la base al azcar.
FOSFATASAS
QUINASA: Introducen fosfato en zonas libres de fosfato.
METILASAS:
RECTRICTASAS: Clonacin del ADN. Elemento que
fabrica la bacteria para defenderse, metilando su propia
cadena para que no sea reconocido. Permite identificar a
los vectores para clonar los ADN.
PREPRARACION DE UNA GENOTECA DE cDNA
DEL FAGO LAMBA

En genomas grandes se utiliza el ADNc, es decir, el gen sin los intrones, nicamente la parte codificante del gen.
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PCR: Lo de siempre.
MANIPULACIN GENTICA EN MAMFEROS.

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MARCADORES DE SEGUIMIENTO VISUAL: Luciferasa, GFP, -galactosidasa.

MUTACIONES CONDICIONALES: Mutacin que se expresa cuando se desea. Se deja que el individuo se
desarrolla y se anula el gen cuando sea necesario.
SECUENCIACION MASIVA DE ADN: Utilizacin de un fluorocromo que va hasta un sistema de computacin.
MICROARRAYS: La diferencia de color es significante. Cuando sale amarillo no hay variacin. Nos da la
capacidad de agrupar los diferentes genes, utilizando mutantes, viendo diferentes tejidos, o sometiendo a
diferentes situaciones como el estrs.
INMUNOPRECIPITACIN DE CROMATINA ChIP.

Sirve para estudiar protenas que se pegan a la cromatina. Se suele

utilizar un anticuerpo contra la protena de inters. Junto a la protena
se unir el ADN, y ste se separa y se amplifica marcndolo con el
fluorocromo. Se hibrida contra los microarrays y nos muestra gran
cantidad de ADN de ADN del color del fluorocromo si aparece el
promotor, o no si no aparece. Por ejemplo, si se pega al promotor ser
un factor de transcripcin. Si se pega en los factores de iniciacin de
replicacin, esta protena formara parte de l.

FISH: Se puede identificar en el cromosoma una secuencia conocida.

Se marca un ADN con fluorocromo y se introduce en la clula in vivo.

Ese ADN se hibridar en la secuencia complementaria y podr verse
en el microscopio.

FRET:

Se utiliza para conocer in situ la cercana de dos

protenas. Cuando las dos protenas estn juntas, al excitar
una de ellas se excitarn ambas protenas. Si no lo estn solo
se excitar la primera.

Tema II

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GENES Y GENOMAS
COMPLEMENTACIN GNICA:

Podemos saber cmo es mutacin porque el alelo mutante puede

complementarse con el alelo silvestre (homocigoto o heterocigoto), es decir, hay dos copias de la protena.
Cuando existe complementariedad entre ambos alelos, sera heterocigoto.
Si no existe ser homocigoto. Cuando es homocigoto recesivo, ese genotipo no sera funcional.
En procariotas existe una correlacin lineal positiva entre el tamao del genoma y el nmero de genes. Sin
embargo esto no ocurre en eucariotas.
CINTICA DE RENATURALIZACIN DEL ADN:

Cuando el ADN es de secuencia nica, la probabilidad de

que un ADN pequeo, tras ser desnaturalizado, vuelva a unirse, es muy alta. Sin embargo ocurre lo contrario con
un ADN con genoma largo.
Con estos datos se puede realizar una grfica.

Se establece un valor medio que se llamara Cot 1/2 (Concentracin de ADN en el tiempo inicial, multiplicado por
el tiempo que ha tardado).
Cuando las secuencias de ADN son repetidas en el genoma ms largo, y no lo son en el genoma pequeo, siendo
las proporciones idnticas (1/4 de a, 1/4 de a', 1/4 de b, y un 1/4 de b') entonces la renaturalizacin sera en ambas
el mismo tiempo. Por ello la tcnica de desnaturalizacin-renaturalizacin (Cot 1/2) nos mide el tamao de la
secuencia nica, el cual aumenta con la complejidad del ADN. Cuando se representa en una grfica de Cot 1/2
contra los pb sale lineal.
Cuando nuestro genoma pertenece a un ser superior encontramos este tipo de grfica:

Se calcula el Cot 1/2 por cada

representan en una grfica y no
el ADN de un ser superior tiene
altamente
repetitiva,
la

parte de la grfica., estos se

sale lineal. Esto quiere decir que
tres tipos de secuencias; la
moderadamente repetitiva, y la
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secuencia nica. El Cot 1/2 de la secuencia nica nos da el nivel de complejidad del organismo (a ms secuencia
codificante, ms complejidad, aunque menos proporcin hay entre repetidos, no codificantes, y codificantes).

TAMAO DE GENES Y DISTRIBUCIN SEGN EL N DE INTRONES.

No hay relacin entre cromosomas y complejidad.

El 96% de genes de levadura no intrones, eso no quiere decir que el 96% del ARN que se codifica por esos genes
no tenga intrones (siempre va a existir el splicing alternativo).
GENOMAS.

GENOMA DE MITOCONDRIA: Hay grandes diferencias de tamao.

EMPAQUETAMIENTO DEL ADN: Si la cantidad de ADN es mayor y el espacio celular es el mismo, deber haber
mayor nmero de cromosomas.

ELEMENTOS QUE ACTAN EN EL ADN.

CIS--> Mismo cromosoma. Elementos fundamentales que definen funciones concretas en el cromosoma.
TRANS--> Diferente cromosoma. Normalmente es una protena que puede actuar sobre otro cromosoma.
SUPERENROLLAMIENTO: Se organiza en torno a las vueltas que da el ADN alrededor del nucleosoma. De esta

forma no se produce desorganizacin ni forzamiento del ADN.

MNasa se utiliza para tratar el collar de perlas.
HISTONAS.
Las define el domino HFD.
Las histonas H3 y H4 tienen unas colas con aa fcilmente modificables (se
les pueden aadir diferentes grupos), con esas modificaciones se puede
variar la carga (normalmente es bsica), para cambiar las propiedades de
reconocimiento. Esto les da un papel funcional de elemento fundamental
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para permitir que accedan o no otras protenas al ADN (promotor), adems de su papel estructural.
Aparecen nicamente en la fase S.
Eucromatina: menos compactada
Heterocromatina: ms compactada.
CENTRMERO.

Da la propiedad de la correcta segregacin a las molculas de ADN. La protenas CENP-A es exclusiva de ellos. Es
muy variable entre las especies.
TELMEROS.

Son cadenas ricas en guanina, por la cual toman la conformacin del G4, para que las endonucleasas no daen el
ADN, es decir, protege el extremo del cromosoma para que no se degrade por su propia maquinaria nuclear.

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