UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

PRACTICA 3: ESTUDIO MORFOLGICO DE LOS

MICROORGANISMOS: COLORACIONES

CURSO

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS I

DOCENTE

Blga. M. Sc. Margarita Alcedo Romero

ALUMNOS

SEMESTRE

2016 - 0
TINGO MARIA - PERU
2016

I.

INTRODUCCION

Una de las caractersticas ms importante de las bacterias es su morfologa,

definida por el tamao, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias en
forma redondeada denominadas cocos, en forma cilndrica, denominadas bacilos y
una tercera morfologa como son las que tienen forma de espirales, denominadas
espirilos. A su vez cada categora puede sub clasificarse con base a diferentes
arreglos. Estas caractersticas pueden determinarse examinando muestras al
microscopio. Las clulas no teidas son prcticamente transparentes, pero pueden
observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lmina y laminilla o
con microscopios especiales como por ejemplo: de contraste de fases o de campo
oscuro.
Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teir las bacterias para
facilitar su visualizacin.

II.

OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con las caractersticas morfolgicas
(tamao,

forma,

disposicin),

movimiento,

de

otros

microorganismos, mediante el uso del microscopio, en muestra

fresca y fijaras.
Proporcionar conocimientos sobre los mtodos ms comunes de
coloracin, como simple y compuesta.

III. REVISION BIBLIOGRAFICA

3.1. PREPARACIONES NO TEIDAS O EXAMEN DIRECTO
3.1.1. Examen en fresco

Los exmenes en fresco permiten visualizar los microorganismos sin

necesidad de fijarlos o teirlos, por lo cual se observan vivos. La mayor parte de
estas observaciones se realiza mediante la microscopia de campo claro, aunque la
utilizacin de microscopia de contraste de fases puede facilitar la visualizacin de
las estructuras de los microorganismos.
Las preparaciones deben de obtenerse de material clnico fresco o de
cultivos recientes durante 24 horas y realizndoles en medios adecuados.
Muestras como sedimentos urinarios, esputos pueden utilizarse directamente, que
si el material es demasiado espeso se puede diluir con solucin salina estril. La
preparacin se observa en el microscopio con objetivo de inmersin y con poca
intensidad de luz el cual facilita la observacin microscopia.
Los microorganismo en general no presentan no presenta demasiado
contraste respecto al medio que lo rodea a pesar de ello es posible verlos sin
necesidad de teirlos gracias a su capacidad de movimiento en medio lquido.
Es una tcnica que apenas se utiliza en el diagnostico microbiologa, porque
ofrece muy poca informacin en cuanto a la estructura y composicin de las
bacterias.
3.1.2 Mtodo de gota pendiente
Esta preparacin se realiza colocando una gota de la suspensin bacteriana
en un cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un crculo con vaselina o
parafina.
a. La vaselina acta como sellador.
b. Sobre el cubreobjetos se coloca un portaobjetos con una excavacin central
que queda adherido gracias a la vaselina.
c. Se invierte la preparacin y se observa colocndola en la platina del
microscopio.
d. Las

preparaciones

en

microorganismos vivos.

gota

pendiente

se

utilizan

para

observar

Fig.N1. Mtodo de gota Pendiente

3.2. PREPARACIN TEIDA
3.2.1. COLORACIN
En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de
colorantes de acuerdo al mtodo de tincin que se realice. Para la observacin
microscpica existen diferentes tipos de coloraciones segn las caractersticas
morfolgicas que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican en simples y
compuestas.
A. Coloraciones simples
Se entiende por coloracin simple al teido de los microorganismos
aplicando slo una solucin colorante. Pueden ser positivas o negativas.
B. La coloracin positiva.
Es la tincin de los microorganismos, efectuada con colorantes bsico que,
como ya dijimos, poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan
qumicamente con el citoplasma microbiano. Tcnica: Se cubre el frotis, despus
de fijado, con la solucin colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se
lava con agua y se deja secar.
Con fucsina bsica: se diluye 1/10 la solucin de uso (fucsina fenicada de
Ziehl) y se deja actuar 30 a 60 segundos.
Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solucin de uso y se deja
actuar 30 a 60segundos.
Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solucin de uso (azul
de metileno alcalino de lo effler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos.

El azul de metileno es el colorante ms dbil de los tres, razn por la cual se usa
ms concentrado y se deja actuar durante ms tiempo. Tambin a la solucin de
azul de metileno de uso se le agrega un lcali (KOH) como intensificante, que
acta haciendo ms rpida e intensa la reaccin de coloracin.
Generalmente como intensificante se usa un lcali para un colorante bsico y un
cido para un colorante cido. Debido a que el protoplasma bacteriano tiene una
dbil carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios
alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan ms intensas.
C. LA COLORACIN NEGATIVA
Es lo contrario del procedimiento de tincin usual, los microorganismos quedan
sin teir y se colorea el medio que los rodea. Por lo tanto, lo que se ve es el perfil
de las clulas. La sustancia usada para la tincin negativa es un colorante opaco
que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea a
las clulas, tal como:
Tinta china (suspensin de partculas de Carbono coloidal demasiado
grandes como para penetrar en la bacteria).
Colorantes cidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El
ms utilizado es la nigrosina dado que es el que ms contraste ofrece por
ser negro.
La coloracin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los
microorganismos en microscopa ptica, pero su mxima utilidad est en revelar
estructuras como cpsulas tanto bacterianas como de levaduras, esporas que se
observan como cuerpos refringentes y espiroquetas que, por su pequeo dimetro
transversal, resulta difcil ponerlas en evidencia; por medio de la coloracin
negativa se observan sin dificultad.

Fig.2. Tincin Negativa Se emplea para ver la cpsula Cryptococcus

neoformans en LCR.
D. Coloraciones compuestas
Aunque existen mltiples tipos de tinciones, vamos a referirnos aqu a los dos
mtodos de coloracin especiales ms comn mente empleados en la prctica
corriente del laboratorio de microbiologa: la tincin de Gram y la de Acido-Alcohol.
Resistencia.
a. Tincin de Gram
Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la ms empleada en
bacteriologa. Permite diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual forma y
tamao, por esta razn es una tincin diferencial. Dos o ms colorantes;
distingue entre bacterias Gram positivas y Gram negativas
Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la Gram positiva depende de
la naturaleza y composicin qumica de la pared celular o parte de ella. Se han
propuesto varias teoras para su explicacin, pero la ms aceptada es la que
sostiene que las bacterias Gram negativas son ms permeables al alcohol debido
a su alto contenido en lpidos. Cuando la bacteria se tie con el complejo colorante
bsico-mordiente, ste queda atrapado en las bacterias gran positivas y no puede
ser arrastrado por el decolorante a causa de la naturaleza fsico-qumica de su

pared. Por el contrario, en las Gram negativas es arrastrado debido a su alto

contenido lipdico.
http://coloraciondegram.blogspot.com/
E) Tincin de Ziehl-Neelsen
El fundamento de esta tcnica diferencial, se basa en la propiedad del cidoalcohol resistencia de algunas bacterias del orden Actinomycetales, si bien no es
privativa de ellas. Estos microorganismos se consideran Gram positivos, pero se
colorean difcil e irregularmente, de ah que emplee este tipo de tincin (ZiehlNeelsen) o su variante (Kinyoun). Cualquiera delas dos tcnicas citadas
consiguen, ya sea por el calor o aumentando el tiempo de contacto, que la fucsina
penetre profundamente y pueda resistir la accin decolorante de una solucin de
cido-alcohol, apareciendo los bacilos de color rojo sobre un fondo azul
Tcnica para realizar una preparacin coloreada
Una preparacin coloreada exige la sucesin de tres pasos: preparacin del
extendido, fijacin y coloracin.
a) Preparacin del extendido
Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado. Si el cultivo proviene
de un medio lquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y se extiende
hasta formar una fina pelcula que cubra el centro de la porta objetos. Si el
cultivo proviene de un medio slido, se procede as de la siguiente manera:
Con pipeta o ansa se coloca una gota de agua en el centro del
portaobjetos.
Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y
luego se extiende la suspensin bacteriana hasta formar una fina pelcula
sobre el portaobjetos sin tocar los bordes.
Se deja secar al aire, o se seca al aire caliente de la llama, si los
microorganismos lo admiten.
b) Fijacin
Este segundo paso se efecta para que los microorganismos que den
adheridos al vidrio y no se desprendan del portaobjetos con los lavados a los
que hay que someterlos posteriormente. La fijacin coagula las sustancias

proteicas de las clulas, lo cual hace que los microorganismos queden

pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas las
bacterias.
Existen dos tipos de fijacin: con calor o mtodo de Koch y fijacin qumica.
Mtodo Koch
El procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el
preparado por la llama del mechero 3 veces seguidas, con la precaucin de
llevar el extendido hacia arriba. El inconveniente de este mtodo es que los
microorganismos pueden deformarse demasiado si el calentamiento resulta
excesivo. Despus del procedimiento, el portaobjetos debe notar se caliente
pero no debe quemar cuando se coloca en la parte posterior de la mano.
Fijacin qumica
La coagulacin del protoplasma microbiano con sustancias qumicas es
lo ideal pues las clulas no resultan deformadas. Existen varios mtodos:Se inunda el preparado con alcohol metlico, se deja actuar 3 minutos y se
lava con agua. Es el ms usado.- dem con formalina al 5 % (v/v).- se
inunda el extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto
y ter sulfrico) y se deja actuar hasta su evaporacin completa.

IV.

MATERIALES Y METODOS

4.1. Materiales

Muestras:
Tubos contenido cultivo bacteriano (caldo o agar): cultivos de 24
horas de Escherriachia coli, Staphylococcus aureus bacillus sp; y

cultivos de 48 horas de saccharomyces cerevisiae.

yogurt/levadura
lamina portaobjeto/ laminilla cubre objeto.
Asa de siembra.
Torundas estriles.
Solucin salina
Bacteria Gram:
Cristal violeta
Lugol
Decolorante; alcohol-acetona
Colorante de contraste: safranina
Azul de metileno en solucin acuosa
Plumn indeleble
Laminas fijadas
Microscopio ptico

4.2. Procedimiento
4.2.1. Examen en fresco

Tomar un portaobjeto limpio y desengrasado. Con el asa de siembra

colocar una gota de la muestra a observar.

Colocar una laminilla cubreobjeto, sobre la gota, y observar al

microscopio utilizando primero el objetivo 10X y luego el de 40X.
4.2.2. Preparaciones fijadas: coloraciones
a)

Coloracin simple
Tomar un portaobjeto limpio y desengrasado.
Con el asa de siembra tomar un inculo del cultivo bacteriano (si
en caso es liquido), o colocar una gota de solucin salina esteral
(en caso de ser slido) en el portaobjeto, luego tomar un poco de
la muestra y mesclar con la solucin salina estril.

Hacer una extensin en la lmina (frotis), que no sea ni muy

gruesa ni muy fina.

Dejar secar a temperatura ambiente, o pasando por la llama del

mechero a fin de obtener la fijacin del frotis.

Cubrir la preparacin con 2 o 3 gotas de colorante de azul de

metileno, dejar que actu por un minuto.

Lavar la preparacin con agua corriente, evitar que el chorro de

agua le caiga directamente al frotis.

Secar y observar al microscopio ptico, usando el lente de

inmersin, con aceite de inmersin o cedro.

Coloracin compuesta: Mtodo GRAM
Tomar un inculo con el asa de siembra y extenderlo sobre una

lmina portaobjeto limpio y desengrasado. Haciendo el frotis.

Fijar la preparacin al medio ambiente y a la llama del mechero,

b)

controlar sobre el dorso de la mano si el calentamiento es

moderado, ya que si no habr calcinacin.

Cubrir con la solucin cristal violeta por un minuto.

Lavar ligeramente con agua corriente.

Cubrir la preparacin con Lugol, dejando actuar el mordiente, por

uno o dos minutos.

V.

Lavar con agua corriente.

Agregar alcohol-acetona, hasta que este no arrastre colorante

(regular mediante movimiento de balanceo de la preparacin).

Lavar con agua corriente.
Contrastar con el colorante de safranina, por 30 segundos a un

minuto.
Lavar con agua corriente. Prolongar el lavado para evitar

precipitados.
Sacar al aire o con ayuda del mechero.
Observar al microscopio ptico, con el objetivo de inmersin.
RESULTADOS Y DISCUSION

RESUMEN DE LAS OBSERVACIONES EN EL SIGUIENTE CUADRO:

Nombre

del Forma de la clula

microorganismo
Muestra 1

Coccus

(caldo)
Muestra

2 Bacilos

(Levadura)
Muestra

(Yogurt)

VI.

CONCLUCIONES

Disposicin
celular
nicos
streptobacilos

Clasificacin

 Las bacterias se dividen en dos grandes grupos GRAM (+) y (-), mas
no todas son de estos dos grupos porque algunas la pared celular es
de cera y necesitan otro mtodo de tincin.

VII.

CUESTIONARIO
1. Por qu es necesario que se fije la preparacin a la llama el
mechero?
Para impregnar la muestra al portaobjeto para poder teir.
2. Debido a que las bacterias Gram (+) se colorean de color violeta y
las Gram (-) de rojo?
Las gran (+) se colorean de violeta debido al mordiente (lugol) es el que
hace agrandar el colorante (cristal violeta) y no lo suelta fcilmente.
3. Ud. Cree que mediante la coloracin Gram se puede observar al
Mycobacterium tuberculosis? Explique de acuerdo a su respuesta.
En caso negativo describir el mtodo para observarlo y como se
llama?
No, porque el Mycobacterium tuberculosis en su pared celular tiene cera,
entonces el mtodo a utilizar seria el alcohol-acido-resistente.
4. Describir el mtodo para colorear esporas bacterianas.
a. Cubrir la extensin con papel de filtro (dificulta la precipitacin del
colorante sobre las bacterias).
b. Depositar la preparacin sobre una platina de Koch. Aadir verde de
malaquita. Esperar un minuto.
c. Seguir la tincin con calor: en emisin de vapores durante 5-10
minutos. Dejar enfriar.
d. Lavar con agua abundante. Secar.
e. Teir con safranina (dos minutos). Lavar con agua. Secar. Observar
con objetivo de inmersin.
5. Cree Ud. Que el tamao de la clula coloreada es la natural o no?
Explique porque?
No, porque al introducir el colorante la clula se deforma.

VIII.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n
http://webcache.googleusercontent.com/search?
q=cache:pKgVeaRDDlwJ:www.champagnat.edu.pe/tisg/bio/PDFs/Inf
orme%2520Tincion%2520Gram%2520Nathaly

%2520Grados.pdf+&cd=1&hl=es&ct=clnk&gl=pe
http://www.monografias.com/trabajos15/tinciones/tinciones.shtml
http://www.champagnat.edu.pe/tisg/bio/PDFs/Informe%20Tincion

%20Gram%20Nathaly%20Grados.pdf
http://clubensayos.com/Ciencia/TINCION-GRAM/306218.html