Mtodos para la siembra y

mantenimiento de virus en laboratorio.

A diferencia de lo que sucede con la mayora de las bacterias, hongos y protozoos, slo
pueden multiplicarse en el interior de las clulas vivas, no pudiendo hacerlo en un
medio nutritivo carente de clulas.
Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:

Animales de experimentacin
Embriones animales
Cultivos celulares artificiales

Animales de experimentacin:
La inoculacin en animales de experimentacin de muestras clnicas o de virus para su
aislamiento o propagacin, es una tcnica poco empleada debido a diversas dificultades
como el entrenamiento de los animales, la laboriosidad de la inoculacin y el peligro de
difusin del virus con las excretas de las animales.
Se emplea nicamente cuando se trata de propagar virus cuya replicacin en los otros
sistemas - embriones cultivos celulares - no es posible. Los animales ms utilizados:
monos, los cobayos y los ratones lactantes.

Embriones animales
Los ms utilizados son los embriones de pollo, los huevos fecundados se incuban hasta
el momento de su inoculacin que suele oscilar entre 5 y 14 das. Las inoculaciones, que
pueden realizarse en diversas zonas del embrin (cavidad amnitica, saco vitelino o
cavidad alantoidea).
Se requiere de experiencia para su realizacin debido al tipo de inoculacin y
extraccin. La inoculacin en la cavidad amnitica es la ms utilizada para el
aislamiento del virus a partir de muestras clnicas.
Los virus slo pueden reproducirse en determinadas partes del embrin; por
consiguiente, se deben inyectar en la regin apropiada, ej. Los mixovirus crecen bien en
la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la parotiditis prefiere la cavidad
alantoidea. La infeccin puede producir una lesin tisular local conocida como pstula,
cuyo aspecto, a menudo, es caracterstico del virus.

El mtodo exacto de inoculacin y la edad del embrin

Que se emplea, dependen del virus problema. ej. Para aislar en forma primaria el virus
de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la
cavidad amnitica de embriones de 7 a 8 das; pero el virus se duplica fcilmente en la
membrana alantoidea de embriones de 12 a 13 das, despus de varias resiembras
(adaptacin) en el amnios. Los focos ms utilizados para la inoculacin, a parte de las
cavidades amnitica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino.
Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrin en desarrollo,
recurriendo a la inoculacin intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se
duplic el virus dentro de las clulas de las membranas o del embrin, puede liberarse a
los lquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej. el
virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrin y en las
clulas de la membrana amnitica, pasa al lquido amnitico, que luego puede recogerse
con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus, como p.ej. los de la viruela y el herpes,
que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las clulas en las
lesiones o pstulas que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una
solucin salina isotnica las membranas, logran liberarse estos virus.
En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrin de pollo puede provocar la
muerte del embrin (p.ej. virus de la encefalitis), producir pstulas o placas sobre la
membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna), desarrollar hemaglutininas
en los lquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante
(p.ej. poliovirus tipo 2).
En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la tcnica de
inoculacin de huevos embrionados al correlacionar el nmero de pstulas contadas con
la dilucin viral inoculada.
Actualmente el mtodo preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculacin
en huevos embrionados libres de patgenos especficos (SPF) o huevos negativos a
anticuerpos especficos (SAN). El sobrenadante de los centrifugados de las muestras se
inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 das de incubacin y se
incuba a 35-37C durante 4-7 das. Luego los huevos con embriones muertos, cuando
esto ocurra, o los que queden al final del periodo de incubacin se refrigeran a 4 C y el
lquido alantoideo se chequea con la prueba de hemaglutinacin. Si se detecta actividad
de hemoaglutinatin hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de influenza o
de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reaccin negativa deben inocularse al
menos en otro lote de huevos.

Entre los lugares de inoculacin tenemos:

Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 12 das y
La cantidad de inculo es de 0.1 0.5 ml. Apropiada especialmente para el aislamiento
y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la enfermedad de
Beyer(Pseudorrabia); que provocan focos o pstulas fcilmente visibles.

Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 12 das y la

Cantidad de inoculo es de 0.1 0.2 ml. Entre los virus que desarrollan en el endodermo
alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitis infecciosa, encefalitis
equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis. Ventaja: simplicidad de la
inoculacin y toma de muestra

Cavidad Amnitica
Se emplean embriones de 7 15 das y la cantidad de inculo es de 0.1 0.2 ml. la edad
de los mismos depende fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza.

Saco Vitelino
Se emplean embriones de 5 8 das de incubacin y la cantidad de inculo es de 0.2 1
ml. Va es sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de los virus de
enfermedades venreas, neumona y rickettsias. El vitelo es empleado para la
preparacin de vacunas y como antgeno para reacciones serolgicas de los virus ya
mencionados.

Va Intravenosa
La membrana corialantoidea est irrigada por vasos sanguneos, es susceptible de
inoculacin para casos especiales, virus que ocasionan cambios hematolgicos; por
ejemplo, virus de la Leucemia. Son empleados embriones de 10 - 15 das y la cantidad
de inculo es de 0.02 - 0.05 ml.

Va Intracerebral (embrin)
Se emplea embriones de 8 14 das, especficamente para virus que producen
alteraciones cerebrales: la rabia, herpes, etc; 0.01 0.02 ml.

EFECTO CITOPTICO (CPE),

Los virus invaden las clulas causando normalmente algn tipo de cambio visible en el
crecimiento de las clulas .Ejemplo efecto citoptico (CPE), es un deterioro delas
clulas del cultivo de tejidos causado por el virus.
La CPE puede tener diferentes apariencias dependiendo de un virus particular y del tipo
de clulas en el cultivo.
Cambios morfolgicos visibles en clulas infestadas con virus.
Incluye la paralizacin del ARN celular y de la sntesis de protenas, fusin celular,
liberacin de enzimas lisosomales, cambios en lapermeabilidad de las membranas
celulares,cambios difusos de las estructurasintracelulares, presencia de cuerpos
deinclusin virales, y aberraciones cromosmicas

EFECTOS CITOPATOGNICOS

Los efectos citopatognicos virales aportan un valioso mtodo para la identificacin y

clasificacin de los virus que producen la infeccin.

MATERIALES Y MTODOS

Material de Laboratorio:
Ovoscopio.
Tijera Quirrgica.
Agua Destilada.
Azul de Metileno.
Agujas Hipodrmicas.
Placas Petri amplias.
Los virus pueden propagarse en las membranas extraembrionarias o en el propio
embrin. Anatmicamente el huevo embrionado de gallina presentan en su estructura las
siguientes partes:
1.- Embrin
2.- Cavidad amnitica
2a.- Membrana amnitica
3.- Saco vitelino
4.- Albmina
5.- Cavidad alantoidea
6.- Membrana corioalantoidea
7.- Membrana externa del huevo
8.- Cscara
9.- Cmara de aire

Cultivos celulares
Se trata de multiplicar y mantener clulas in vitro. La clulas se obtienen de un
fragmento de un rgano u embriones de pollo, por trituracin y posterior disgregacin
con tripsina (enzima), lo que permite obtener clulas aisladas que se introducen en
frascos con medos de cultivo lquidos adecuados (botellas o placas Petri).
Las clulas en los frascos pueden estar en suspensin, es decir, libres en el medio de
cultivo lquido o adosadas a la pared del frasco y baadas por el medio (las clulas
producen un material glicoprotico que permite su adhesin a las superficies). En el
primer caso se trata de clulas en suspensin y en segundo en monocapa.

El medio de cultivo utilizado para los cultivos celulares es bastante complejo, e incluye
aminocidos, vitaminas, sales, glucosa y buffer de bicarbonato. Para un mejor
crecimiento, se da la adicin de una pequea cantidad de suero sanguneo, y tambin
suele aadirse varios antibiticos para impedir la contaminacin bacteriana. Tambin se
aade un indicador de pH coloreados para evidenciar esta contaminacin.
Algunos cultivos celulares pueden crecer indefinidamente y constituyen las llamadas
lneas celulares permanentes, estos cultivos son ms convincentes para investigacin
vrica. En otros casos no ocurre un crecimiento indefinido, pero permanece vivo por
unos das, estos son los llamados cultivos primarios, que aunque tambin sean tiles hay
que prepararlos en cada anlisis.
Accin citoptica: Lesin que causan algunos virus a las clulas in vitro. Pueden ser
intensas y precoces, produciendo en 24 o 48 horas la muerte celular, acompaada de
lisis fcilmente observable al inspeccionar los cultivos celulares con microscopio.
El efecto citoptico es muy diferente debido al tipo de virus. En otras ocasiones las
alteraciones morfolgicas que se producen en las clulas son mnimas o tardas y muy
difciles de detectar. En las clulas infectadas por determinados virus pueden observarse
cuerpos de inclusin.
Los cuerpos de inclusin pueden visualizarse, despus de la tincin de las clulas con
hematoxilina-eosina, como masas con morfologa ms o menos caracterstica y
localizacin nuclear o citoplasmtica tpica, segn los virus que los originan. Estn
constituidos por acmulos del material vrico sintetizado depositados en zonas
celulares alteradas.